Спосіб одночасної індикації днк мікоплазм та рнк вірусів діареї врх з подальшою ідентифікацією 1 та 2 генотипу збудника вірусної діареї за допомогою плр

Реферат: Спосіб одночасної індикації ДНК мікоплазм та РНК вірусів діареї ВРХ з подальшою ідентифікацією 1 та 2 генотипу збудника вірусної діареї за допомогою полімерної ланцюгової реакції (ПЛР) включає екстракцію нуклеїнових кислот, зворотну транскрипцію та ампліфікацію. У першому раунді ПЛР використовують праймерні системи GPO-1/MGSO та Р1/Р2, які фланкують ділянки гена 16S rRNA мікоплазм та Erns вірусу діареї ВРХ з утворенням фрагментів довжиною 715 та 826 п. н. відповідно, за температури відпалу 55 °С. У другому раунді ПЛР використовують системи праймерів TS3/P2 для ідентифікації вірусної діареї ВРХ 1 генотипу та TS2/P2 - для 2 генотипу із синтезом фрагментів довжиною 223 та 488 п. н. відповідно. UA 87122 U (54) СПОСІБ ОДНОЧАСНОЇ ІНДИКАЦІЇ ДНК МІКОПЛАЗМ ТА РНК ВІРУСІВ ДІАРЕЇ ВРХ З ПОДАЛЬШОЮ ІДЕНТИФІКАЦІЄЮ 1 ТА 2 ГЕНОТИПУ ЗБУДНИКА ВІРУСНОЇ ДІАРЕЇ ЗА ДОПОМОГОЮ ПЛР UA 87122 U UA 87122 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної біотехнології, зокрема до розробки молекулярно-генетичних способів виявлення контамінації ветеринарних імунобіологічних препаратів та сировини для їх виготовлення збудниками мікоплазмозу та вірусної діареї великої рогатої худоби (ВД ВРХ) за допомогою дуплексної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), з можливістю подальшого визначення генотипу ВД ВРХ за допомогою гніздової ПЛР. Відомі способи виявлення ДНК мікоплазм за 16S rRNA геном (van Kuppeveld F.J, van der Logt J.T., Angulo A.F. et al. Genus- and Species-Specific Identification of Mycoplasmas by 16S rRNA Amplification // Appl. Environ. Microbiol. - 1992. - Vol. 58(8). - P. 2606-2615) та РНК збудника ВД rns ВРХ за E геном з можливістю встановлення генотипу вірусу діареї ВРХ (Sullivan D.G., Akkina R.K. A nested polymerase chain reaction assay to differentiate pestiviruses // VirusRes. - 1995. - Vol. 38(3-8) - P. 231-239). Недоліками даних способів, за рахунок окремої детекції збудників, є вищі собівартість та часозатратність за спосіб, що пропонується. Найбільш близьким рішенням до способу, що заявляється, є спосіб виявлення РНК збудника ВД ВРХ за 5'-UTR геном разом зі збудником інфекційного ринотрахеїту ВРХ за допомогою дуплексної ПЛР (Tramuta С., Lacerenza D., Zoppi S. et al Development of a set of multiplex standard polymerase chain reaction assays for the identification of infectious agents from aborted bovine clinical samples // J. Vet. Diagn. Invest. - 2011. - Vol. 23(4). - P. 657-64). Цей спосіб ґрунтується на екстракції нуклеїнових кислот збудників ринотрахеїту та ВД ВРХ, проведенні зворотної транскрипції, ампліфікації з використанням двох систем праймерів та подальшої візуалізації результатів ПЛР за допомогою електрофорезу. Це рішення може бути найближчим аналогом. Недоліком даного способу є відсутність можливості генотипування збудника ВД ВРХ. На даний час розроблено чимало методик одночасного виявлення генетичного матеріалу збудників ринотрахеїту та ВД ВРХ за допомогою дуплексної ПЛР, проте немає жодної для одночасної детекції нуклеїнових кислот мікоплазм та вірусу діареї. За цим способом розроблено дуплексну ПЛР методику одночасної індикації ДНК мікоплазм та РНК вірусу діареї ВРХ з подальшою ідентифікацією 1 та 2 генотипу збудника ВД ВРХ, що відповідає критерію "новизна". В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб одночасної індикації ДНК мікоплазм та РНК вірусу діареї ВРХ з подальшою ідентифікацією 1 та 2 генотипу збудника вірусної діареї за допомогою ПЛР. Поставлена задача вирішується тим, що в способі одночасної індикації ДНК мікоплазм та РНК вірусу діареї ВРХ з подальшою ідентифікацією 1 та 2 генотипу збудника вірусної діареї за допомогою ПЛР, що включає екстракцію нуклеїнових кислот, зворотну транскрипцію та ампліфікацію, згідно з корисною моделлю, використовують на першому етапі ПЛР систем праймерів GPO-1/MGSO - для мікоплазм і Р1/Р2 - для вірусу діареї ВРХ, які фланкують ділянки гена 16S rRNA та Erns з утворенням фрагментів довжиною 715 та 826 п.н відповідно, за температури відпалу 55 ºС, на другому етапі ампліфікації шляхом використання праймерних систем TS3/P2 для ідентифікування збудника ВД ВРХ 1 генотипу та TS2/P2 - для 2 генотипу, з утворенням фрагментів довжиною 223 та 488 п.н. відповідно за температури відпалу 55 ºС, щоб забезпечити ефективність способу. Спосіб виконується наступним чином: Спочатку проводять пробопідготовку. Як матеріал для дослідження використовують ветеринарні імунологічні препарати та сировину для їх виготовлення, клінічний та патологічний матеріал від ВРХ. Після чого проводять екстракцію сумарних нуклеїнових кислот за допомогою набору для екстракції Рибосорб (Амплисенс, Москва, Російська Федерація) або аналогічного. Зворотну транскрипцію сумарної РНК проводять за допомогою набору GenPak RT MasterMix Core (Isogene, Москва, Російська Федерація) або аналогічного. Продукт зворотної транскрипції кДНК застосовують як досліджувану пробу в реакції ампліфікації, яку проводять за допомогою набору GenPak PCR MasterMix Core (Isogene, Москва, Росія) або аналогічного, та систем праймерів. Для проведення першого раунду ПЛР до пробірок з реакційною сумішшю вносять по 8 мкл PCR dilluent, по 1 мкл праймерів GPO-1/MGSO та Р1/Р2 та 10 мкл розчину сумарної кДНК проби. Для негативного контрольного зразка в пробірку вносять 10 мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразка - 10 мкл розчину кДНК з суміші референтних штамів мікоплазми (М. hyorhinis BTS-7) та збудника ВД ВРХ 1 та 2 генотипу (штами Ossloss та Kosice відповідно). Переносять пробірки в програмний термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікацію за наступною програмою (табл. 2). Після закінчення реакції проводять аналіз результатів ампліфікації шляхом поділу продуктів ПЛР у агарозному гелі. 1 UA 87122 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В електрофоретичну камеру заливають необхідну кількість розчину буфера ТБЕ так, щоб він покривав агарозний гель шаром завтовшки (4-5) мм. Зразки продуктів ампліфікації об'ємом 10 мкл вносять у відповідну лунку агарозного гелю. Електрофорез проводять у градієнті напруги 8 В/см. Після чого агарозний гель розміщують на склі УФ-трансілюминатора. Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у вигляді смужок жовтогарячого кольору при проходженні УФвипромінювання з довжиною хвилі 310 нм. Облік результатів першого раунду ПЛР. У негативному контрольному зразку смужки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках одна смужка жовтогарячого кольору розміром 715 п.н. відповідає наявності ДНК мікоплазм, а друга розміром 826 п.н. - РНК збудника ВД ВРХ. Відсутність смужок жовтогарячого кольору на рівні позитивного контролю (715 та 826 п.н.) свідчить про відсутність нуклеїнових кислот збудників. Наявність смужок, що відповідають за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю, свідчить про присутність збудників. Якщо після обліку результатів першого раунду ПЛР в зразках була встановлена присутність РНК вірусу діареї ВРХ, з метою визначення його генотипу проводять другий раунд. Ампліфікацію проводять за допомогою набору GenPak PCR MasterMix Core (Isogene, Москва, Росія) або аналогічного, та системи праймерів TS2/TS3/P2. Для проведення другого раунду ПЛР до пробірок з реакційною сумішшю вносять по 8 мкл PCR dilluent, 8 мкл Н2О, по 1 мкл праймерів TS2/TS3/P2 та 1 мкл розчину ампліконів після першого раунду ПЛР. Для негативного контрольного зразка в пробірку вносять 1 мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразка - 1 мкл розчину кДНК з суміші референтних штамів вірусу діареї ВД ВРХ 1 та 2 генотипу. Переносять пробірки в ампліфікатор і проводять ПЛР за наступною програмою (табл. 3). Після закінчення реакції проводять аналіз продуктів ПЛР, шляхом поділу фрагментів ампліфікованої кДНК в агарозному гелі. Облік результатів другого раунду ПЛР. У негативному контрольному зразку смужки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках смужка жовтогарячого кольору розміром 223 п.н. відповідає наявності РНК збудника ВД ВРХ 1 генотипу, а смужка розміром 448 п.н. - 2 генотипу. Наявність смужок, що відповідають за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю (223 та 448 п.н.), свідчить про те, що зразок містить РНК вірусу діареї ВРХ відповідного генотипу. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. З метою визначення чутливості розробленого способу була використана панель -6 10х розведень нуклеїнових кислот мікоплазм та вірусу діареї ВРХ до розведення 10 . Початкова концентрація становила 10 нг/мкл. У результаті ампліфікації ДНК мікоплазм та РНК -4 -3 вірусу діареї виявлялися до розведення 10 , що відповідає концентрації 10 нг/мкл (на Фіг.1). На фіг.1 показані результати ампліфікації різних розведень нуклеїнових кислот, виділених з -1 культур мікоплазм (1-7) та вірусу діареї ВРХ (8-14). 1, 8-10нг/мкл; 2, 9-1 нг/мкл; 3, 10-10 нг/мкл; -2 -3 -4 -5 4, 11-10 нг/мкл; 5, 12-10 нг/мкл; 6, 13-10 нг/мкл; 7, 14-10 нг/мкл, М - маркер молекулярної маси 100 п.н. Дослідження були проведені дворазово, при повтореннях результати відтворені. Приклад 2. Для визначення специфічності способу було використано 5 зразків сироватки крові ВРХ, контамінованої мікоплазмами та вірусом діареї, та негативний зразок. Після першого раунду ампліфікації встановлено, що специфічні продукти реакції утворювались лише з пробами, які містили нуклеїнові кислоти мікоплазм та вірусу діареї. У зразку, вільному від контамінації, після ампліфікації смуги не утворювалися (Фіг.2). На фіг.2 показані результати дуплексної ПЛР індикації генетичної матеріалу мікоплазм і вірусу діареї та генотипування ВД ВРХ. Перший раунд ампліфікації: 1.- М. hyorhinis BTS-7; 2.-М. hyorhinis BTS-7 та ВД ВРХ-1( штам Ossloss); 3.-М. hyorhinis BTS-7 та ВД ВРХ-2( штам Kosice); 4ВД ВРХ-1; 5- ВД ВРХ-2; 6.- негативний контроль. Другий раунд ампліфікації зразків № 2-6: 7- ВД ВРХ-1; 8- ВД ВРХ-2; 9 - ВД ВРХ-1; 10- ВД ВРХ-2; 11- негативний контроль; М - маркер молекулярної маси 100 п.н. Після другого раунду ампліфікації було встановлено, що довжина специфічних смуг відповідала генотипу, а в негативному контролі смуги не утворювалися. Таким чином, розроблено спосіб одночасної індикації генетичного матеріалу мікоплазм та вірусу діареї ВРХ з подальшою ідентифікацією генотипу збудника ВД ВРХ, який може успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень. 60 2 UA 87122 U Таблиця 1 Назва Положення в геномі 338-359 1029-1055 1424-1449 2221-2250 1802-1821 2027-2045 Послідовність праймерів (5'→3') GPО-1 MGSO P1 Р2 TS2 TS3 ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC AACAAACATGGTTGGTGCAACTGGT CTTACACAGACATATTTGCCTAGGTTCCA TGGTTAGGGAAGCAATTAGG GGGGGTCACTTGTCGGAGG Розмір ПЛРпродукту (п.н.) 715 826 448 223 Таблиця 2 № циклу 1 2 3 Температура 94 °С 94 °С 55 °С 72 °С 72 °С Час 2 хв 1 хв 1 хв 1 хв 10 хв Кількість циклів 1 35 1 Таблиця 3 № циклу 1 2 3 5 10 15 Температура 94 °С 94 °С 55 °С 72 °С 72 °С Час 2 хв 1 хв 1 хв 1 хв 10 хв Кількість циклів 1 25 1 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одночасної індикації ДНК мікоплазм та РНК вірусів діареї ВРХ з подальшою ідентифікацією 1 та 2 генотипу збудника вірусної діареї за допомогою ПЛР, що включає екстракцію нуклеїнових кислот, зворотну транскрипцію та ампліфікацію, який відрізняється тим, що у першому раунді полімерної ланцюгової реакції (ПЛР) використовують праймерні системи GPO-1/MGSO та Р1/Р2, які фланкують ділянки гена 16S rRNA мікоплазм та Erns вірусу діареї ВРХ з утворенням фрагментів довжиною 715 та 826 п. н. відповідно, за температури відпалу 55 °С, у другому раунді ПЛР використовують системи праймерів TS3/P2 для ідентифікації вірусної діареї ВРХ 1 генотипу та TS2/P2 - для 2 генотипу із синтезом фрагментів довжиною 223 та 488 п. н. відповідно. 3 UA 87122 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4