Діалкіламіноалкілбензімідазо[1,2-с]хіназоліни як противірусні агенти та індуктори інтерферону

Діалкіламіноалкілбензімідазо[1,2-с]хіназоліни загальної формули Винахід відноситься до біоорганічної хімії, зокрема до синтезу противірусних агентів та індукторів інтерферону, і може бути використана для створення нових противірусних та імунокорегуючих засобів. Пошук нових противірусних засобів обумовлений розповсюдженістю вірусних інфекцій, можливістю мутацій та виникненням нових вірусів, що є збудниками небезпечних для людини захворювань. За даними ВООЗ [Доклад о состоянии здравохранения в мире, 2007г. http://whqlidoc.who.int/whr/2007/WHR07_overview_r us.pdf], в останній чверті XX століття знову з'явилися холера, жовта лихоманка й епідемічні менінгококові захворювання, вимагаючи поновлення зусиль з епіднагляду, профілактиці й боротьбі з ними. Важкий гострий респіраторний синдром (ВГРС) і пташиний грип у людини викликали серйозну стурбованість міжнародного співтовариства, поставили нові питання перед наукою, заподіяли людям серйозні страждання й викликали величезний економічний збиток. Інші вірусні захворювання, наприклад лихоманка Эбола, Марбургська геморагічна лихоманка й вірус Ніпах, створюють N N R C2 N (19) UA (11) 89992 , де n=1, R=піперидин-1-іл або 2-метилпіперидин-1-іл, або 4-метилпіперидин-1-іл, або морфолін-4-іл, або 4-метилпіперазин-1-іл; n=2, R=піперидин-1-іл або 2-метилпіперидин-1-іл, або 4-метилпіперидин-1-іл, або морфолін-4-іл, або 4-метилпіперазин-1-іл, як противірусні агенти та індуктори інтерферону. (13) n 3 89992 погрозу для глобальної безпеки в області охорони здоров'я й також вимагають локалізації джерел у зв'язку з їхнім гострим характером і високою смертністю. Тому створення ефективних та безпечних противірусних препаратів та імунокоректорів є вкрай актуальним. До найбільш ефективних імунокоректорів відносяться індуктори інтерферону (ІФН) [Ершов Ф.И., Новохатский А.С. Индукторы интерферона. - Μ.: Медицина, 1982, 180с.]. В Україні впроваджені в клінічну практику такі індуктори інтерферону як амізон [Frolov V.M., Vinnikova L.M., Ter'oshyn V.O., Klokol D.I. Efficacy of amizon in the treatment of chronic toxic hepatitis and its immunocorrective action // Lik. Sprava 2001. - №3. С.135-138.], арбідол [Boriskin Y.S., Pecheur E.I., Polyak S.J. Arbidol: a broad-spectrum antiviral that inhibits acute and chronic HCV infection // Virol. J. 2006. - Vol.3. - P.56.], циклоферон [Zarubaev V.V., Slita A.V., Krivitskaya V.Z., Sirotkin A.K., Kovalenko A.L., Chatterjee N.K. Direct antiviral effect of cycloferon (10-carboxymethyl-9-acridanone) against adenovirus type 6 in vitro // Antiviral Res. - 2003. Vol.58, №2. - P.131-137.] й аміксин [Litvinova L., Ptiashko A. Amixin ІС, antiviral medicine and oral inductor of endogenic interferon // Science and Innovation. - 2007. - Vol.3, №4. - P.75.]. Але перерахованим індукторам інтерферону притаманна перехресна гіпореактивність та обмежений спектр дії, що зумовлює актуальність пошуку нових малотоксичних індукторів ІФН. Найближчим аналогом винаходу, що заявляється, виходячи з структури є бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін-6ілметилдиметиламін, здатний до інтеркаляції у ДНК та інгібування саркоми людини в концентрації IC50=19.2μΜ на культурі клітин MG-63 [Brana MR, Castellano J.M., Keilhauer G., Machuca Α., Martin Υ., Redondo С, Schlick Ε., Walker N. Benzimidazo[1,2c]quinazolines: a new class of antitumor compounds. // Anticancer Drag Des. - 1994 - Vol.9 №6 - P.527538]. 4 Бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін-6ілметилдиметиламін Відомості про противірусну активність та індукцію інтерферону сполукою-аналогом відсутні. В основу винаходу поставлено задачу пошуку нових противірусних агентів серед похідних бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну та розширення спектру індукторів інтерферону. Поставлена задача вирішена синтезом сполук, що заявляються, загальної формули: де n=1 R= піперидин-1-іл (1); 2-метилпіперидин-1-іл (2); 4-метилпіперидин-1-іл (3) морфолін-4-іл (4); 4метилпіперазин-1-іл (5); n=2 R= піперидин-1-іл (6); 2-метилпіперидин-1-іл (7); 4-метилпіперидин-1-іл (8) морфолін-4-іл (9); 4метилпіперазин-1-іл (10); Сполуки 1-10 одержують за двостадийною схемою. Вихідні сполуки 12 та 13 одержують взаємодією аміна 11 з хлорацетилхлоридом та хлорпропіонілхлоридом, відповідно, нагріванням в крижаної оцтової кислоті при 60°С [Богатский А.В., Иванов Э.И., Вострова Л.Н., Гренадерова М.В., Караван Л.Д., Гернега С. А. Синтез и исследование свойств некоторых производных о-аминофенилбензимидазола // Укр. хим. журн. - 1979. - Т.45, №3. - С.225-230.]. Сполуки 1-5 отримують обробкою сполуки 12 вторинними амінами в ДМФА при кімнатній температурі протягом 24год. Кип'ятіння вихідного 13 в метанолі з триразовими надлишками вторинних амінів дозволяє одержувати цільові продукти 6-10 з високими виходами. Схема синтезу Чистоту синтезованих сполук контролювали методом тонкошарової хроматографії на пластинках Silufol UV-254 з використанням елюентів різного складу. Будову синтезованих сполук підтверджено набором спектральних методів: спектроскопією ПМР, ІЧ-спектроскопією і масспектрометрією. Первинне дослідження препаратів проводили за схемою і за умов, що враховували адекватність тест-моделі можливому механізму інтерфероно 5 генної активності, що передбачався на підставі аналізу структури хімічної сполуки, яка вивчалась [Вильнер Л.М. Актуальные вопросы скрининга и последующего изучения противовирусных препаратов типа интерфероногенов / В сб.: Методические вопросы научной разработки противовирусных средств. - Минск, 1977. - С.134-136]. Противірусну та інтерфероніндукуючу активність синтезованих сполук вивчали як описано [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. / За ред. чл.-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К: МОЗ, України. ДФЦ, 2001. - 392с.] Отримання сполук, що заявляються, та їх противірусної та інтерфероніндукуючої активностей підтверджено наступними прикладами. Приклад 1. 6-Піперидин-1-ілметилбензо[4,5]імідазо[1,2с]хіназолін (1) До розчину 7г (0.035моль) 2-(1Н3 бензоімідазол-2-іл)феніламіну (11) в 100см крижаної оцтової кислоти додають по краплях 4.4см (6.2г, 0.055моль) хлорацетилхлориду. Розчин нагрівають на водяній бані (не вище 60°С) 15хв., охолоджують і виливають в холодну воду. Осад відфільтровують, промивають на фільтрі водой до нейтральной реакції і висушують. Після перекристалізації із ацетону одержують 6.3г (68%) 6хлорметилбензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (12). C15H10ClN3. M.W. 267.72. Т.пл. 237-238°С. Rf=0.33 -1 (елюент - хлороформ). ІЧ спектр: 2970-2990см -1 (СІСН2Аr); 1595, 1665см (коливання аром, систе-1 ми); 690см (СІСН2Аr). Мас-спектр (БША), m/z (%): + 268 (100) [М+Н] . Мас-спектр (електроний удар), + m/z (%): 267 (100) [М] , 232 (55). Спектр ПМР: розчинник - DMSO-d6, аліфатичні протони: с 5.49 м.ч. (2Н). Ароматичні протони: м. 7.55-7.66 м.ч. (2Н); м. 7.77-7.83 м.ч. (1Н); м. 7.87-7.93 м.ч. (1H); м. 7.978.02 м.ч. (2Н); д. 8.25 м.ч. (1Н); д. 8.60 м.ч. (1H). Суспендують при кімнатній температурі 0.54г (0.002моль) 6-хлорметил-бензо[4,5]імідазо[1,23 3 с]хіназоліну (12) в 10см ДМФА та додають 0.60см (0.51г, 0.006моль) піперидину, при цьому суспензія переходить до розчину. Реакційну суміш залишають при кімнатній температурі на добу, після чого 3 виливають до 100см води дистильованої. Осад, що випав відфільтровують, промивають на фільтрі водою дистильованою до нейтрального рН, висушують в ексикаторі над лугом протягом ночі й перекристалізовують з гептану. Вихід 0.58 мг (61%). C20H20N4. M.W. 316.41. Т.пл.=145-146°С. Rf=0.27 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.52 (бензол:триетиламін (10:1)). Мас-спектр (БША), m/z + (%): 317 (100) [М+Н] . Спектр ПМР: розчинник DMSO-d6, аліфатичні протони: м. 1.43-1.45 м.ч., (6Н); н/р. м. 2.59 м.ч. (4Н); с 4.15 м.ч. (2Н, ArCH2N). Ароматичні протони: скл.м. 7.48-7.60 м.ч. (2Н); м. 7.71-7.77 м.ч. (1Н); м. 7.82-7.88 м.ч. (1Н); м. 7.937.96 м.ч. (2Н); д. 8.09 м.ч. (1H); д. 8.57 м.ч. (1H). Приклад 2. 6-(2-Метилпіперидин-1ілметил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін (2) Синтез проводили як описано у прикладі 1, виходячи із 0.54г (0.002моль) 6хлорметилбензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (12) та 3 0.71см (0.60г, 0.006моль) 2-метилпіперидину. Отриману сполуку перекристалізовують з ізопро 89992 6 панолу. Вихід 0.41г (62%). C21H22N4. M.W. 330.44. Т.пл.=134-135°С. Rf=0.41 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.52 (бензол:триетиламін (10:1)). Мас+ спектр (БША), m/z (%): 331 (100) [М+Н] . Спектр ПМР: розчинник - DMSO-d6, аліфатичні протони: д. 1.20 м.ч. (3Н, -N(CH2CH2)2CHCH3); н/р. м. 1.37 м.ч. (4Н); н/р. м. 1.58 м.ч. (2Н); м. 2.46-2.56 м.ч. (1Н); м. 2.65-2.71 м.ч. (1Н); н/р. м. 2.85 м.ч. (1Н); д. 4.09 м.ч., 15.0Гц (1Н, ArCH2N); д. 4.54 м.ч., 15.0Гц (1H, ArCH2N). Ароматичні протони: скл.м. 7.47-7.60 м.ч. (2Н); м. 7.70-7.76 м.ч. (1Н); м. 7.81-7.87 м.ч. (1Н); м. 7.91-7.95 м.ч. (2Н); д. 8.32 м.ч. (1Н); д. 8.57 м.ч. (1Н). Приклад 3. 6-(4-Метилпіперидин-1ілметил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін (3). Синтез проводили як описано у прикладі 1, виходячи із 0.54г (0.002моль) 6хлорметилбензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (12) та 3 0.71см (0.60г, 0.006моль) 4-метилпіперидину. Отриману сполуку перекристалізовують з ізопропанолу. Вихід 0.45г (68%). C21H22N4. M.W. 330.44. Т.пл.=142-144°С. Rf=0.52 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.52 (бензол:триэтиламин (10:1). Мас+ спектр (БША), m/z (%): 331 (100) [М+Н] , 259, 233, 219, 112. Мас-спектр (електронний удар), m/z (%): 233 (100), 98 (25). Спектр ПМР: розчинник - DMSOd6, аліфатичні протони: д. 0.81 м.ч., (3Н, N(CH2CH2)2CHCH3); м. 0.98-1.06 м.ч. (2Н); н/р. м. 1.36 м.ч. (1Н, N(СН2СН2)2CHСН3); д. 1.56 м.ч. (2Н); т. 2.17 м.ч. (2Н); д. 2.95 м.ч. (2Н); с 4.16 м.ч. (2Н, COCH2N). Ароматичні протони: м. 7.47-7.58 м.ч. (2Н); м. 7.70-7.76 м.ч. (1Н); м. 7.81-7.89 м.ч. (1Н); м. 7.92-7.95 м.ч. (2Н); д. 8.07 м.ч. (1Н); д.д. 8.57 м.ч. (1Н). Приклад 4. 6-Морфолін-1-ілметилбензо[4,5]імідазо[1,2с]хіназолін (4). Синтез проводили як описано у прикладі 1, виходячи із 0.54г (0.002моль) 6хлорметилбензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (12) та 3 0.53см (0.52г, 0.006моль) морфоліну. Отриману сполуку перекристалізовують з ізопропанолу. Вихід 0.52г (82%). C19H18N4O. M.W. 318.38. Т.пл.=191192°С. Rf=0.38 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.40 (бензол:триетиламін (10:1). ІЧ спектр: 2770-1 2990см (аліфатич. фрагмент піперидину); 1600, -1 1665см (коливання аром, системи). Мас-спектр + (БША), m/z (%): 319 (100) [М+Н] , 233,100. Масспектр (електронний удар), m/z (%): 233 (98), 83 (100). Спектр ПМР: розчинник - DMSO-d6, аліфатичні протони: т. 2.63 м.ч. (4Н, O(CH2CH2)2N): т. 3.52 м.ч, (4Н, O(CH2CH2)2N); с. 4.22 м.ч. (2Н, СОСH2N). Ароматичні протони: м. 7.48-7.60мл. (2Н); м. 7.71-7.76 м.ч. (1Н); м. 7.81-7.87 м.ч. (1Н); м. 7.93-7.97 м.ч. (2Н); д. 8.10 м.ч. (1Н); д. 8.56 м.ч. (1Н). Приклад 5. 6-(4-Метилпіперазин-1ілметил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін (5). Синтез проводили як описано у прикладі 1, виходячи із 0.54г (0.002моль) 6-хлорметилбензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (12) та 3 0.67см (0.60г, 0.006моль) 4-метил-піперазину. Отриману сполуку перекристалізовують з гептану. 7 Вихід 0.36г (54%). C20H21N5. M.W. 331.42. Т.пл.=164-165°С. Rf=0.01 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.15 (бензол:триетиламін (10:1)). Мас+ спектр (БША), m/z (%): 332 (100) [М+Н] , 289, 261, 233, 220. Спектр ПМР: розчинник - DMSO-d6, аліфатичні протони: с 2.08 м.ч., (3Н, N(CH2CH2)2NCH3); н/р м. 2.25 м.ч. (4Н, N(CH2CH2)2NCH3; н/р м. 2.62мл. (4Н, N(CH2CН2)2НСН3); с. 4.17мл. (2Н, СОСH2N). Ароматичні протони: м. 7.47-7.58 м.ч. (2Н); м. 7.707.75мл. (1Н); м. 7.80-7.85 м.ч. (1Н); м. 7.92-7.94мл. (2Н); д. 8.05мл. (1Н); д. 8.55мл. (1Н). Приклад 6. 6-(2-Пілеридин-1-ілетил)-бензо[4,5]імідазо[1,2с]хіназолін (6) Отримують 6-(2хлоретил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін (13) як описано у першей частині прикладу 1, виходячи із 7.32 r (0.035моль) 2-(1Н-бензоімідазол-23 іл)феніламіну (11) та 5.30см (7.00г, 0.055моль) хлорпропіонілхлориду. Продукт 13 перекристалізовують з ацетону. Вихід 9.52г (97%). С16Н12СIN3. M.W. 281.75. Т.пл.=165-166°С (с розкл). Rf=0.69 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.80 (бензол:триетиламін (10:1). Мас-спектр (БША), m/z (%): + 282 (100) [М+Н] . Спектр ПМР: розчинник - CDCI3, аліфатичні протони: т. 3.77 м.ч. (2Н); т. 4.20 м.ч. (2Н). Ароматичні протони: м. 7.38-7.42 м.ч. (1Н); м. 7.47-7.51 м.ч. (1Н); м. 7.57-7.63 м.ч. (1H); м. 7.707.74 м.ч. (1Н); м. 7.80 -7.83 м.ч. (1Н); м. 7.88-7.95 м.ч. (2Н); д. 8.62 м.ч. (1Н). Розчиняють при нагріванні 0.56г (0.002моль) 6(2-хлоретил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну 13 в 3 3 50см метанолу, і додають 0.6см (0.006моль) піперидину. Реакційну суміш кип'ятять 30-40хв., ви3 парюють при зниженому тиску до об'єму 10см і 3 виливають в 100см води дистильованої. Осад, що випав, відфільтровують, промивають на фільтрі водой дистильованою до нейтрального рН і перекристалізовують із ізопропанолу. Вихід 0.49 мг (74%). C21H22N4. M.W. 330.44. Т.пл.=119-120°С. Rf=0.01 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.48 (бензол:триетиламін (10:1)). Мас-спектр (БША), m/z + (%): 331 (100) [М+Н] , 307, 246, 220, 98. Спектр ПМР: розчинник - DMSO-d6, аліфатичні протони: м. 1.41-1.43 м.ч., (2Н); м. 1.53-1.59 м.ч., (4Н); н/р. м. 2.50 м.ч. (4Н); т. 2.93 м.ч. (2Н, АrСH2CH2N); т. 3.57 м.ч. (2Н, ArCH2CH2N). Ароматичні протони: м. 7.467.57 м.ч. (2Н); м. 7.63-7.68 м.ч. (1Н); м. 7.76-7.86 м.ч. (2Н); д. 7.92 м.ч. (1Н); д. 8.14 м.ч. (1Н); д. 8.50 м.ч. (1Н). Приклад 7. 6-[2-(2-Метилігіпервдин-1-іл)-етил]бензо[4,5]імідазо[1,5-с]хіназолін (7). Синтез проводили як описано у прикладі 6, виходячи із 0.56г (0.002моль) 6-(2хлоретил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (13) та 3 0.71см (0.60г, 0.006моль) 2-метилпіперидину. Отриману сполуку перекристалізовують з ізопропанолу. Вихід 0.44г (64%). C22H24N4. M.W. 344.46. Т.пл.=162-163°С. Rf=0.06 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.48 (бензол:триетиламін (10:1)). Мас+ спектр (БША), m/z (%): 345 [М+Н] , 113 (100). Мас+ спектр (електроний удар), m/z (%): 344 (0.3) [М] , 244 (16), 112 (100). Спектр ПМР: розчинник 89992 8 DMSO-d6, аліфатичні протони: д. 1.00 (3Н, N(СН2СН2)2СНСН3); н/р. м. 1.16-1.35 м.ч. (2Н); н/р. м. 1.44-1.49 м.ч. (1Н); м. 1.56-1.63 м.ч. (3Н); м. 2.28-2.37 м.ч. (1Н); м. 2.41-2.45 м.ч. (1Н); м. 2.933.01 м.ч. (2Н, АrСН2СН2N); м. 3.34-3.40 м.ч. (1Н); м. 3.56-3.62 м.ч. (2Н, АrСH2СН2N). Ароматичні протони: м. 7.48-7.60 м.ч. (2Н); м. 7.65-7.71 м.ч. (1Н); м. 7.78-7.88 м.ч. (2Н); д. 7.94 м.ч. (1Н); д. 8 18 м.ч. (1Н); д. 8.53 м.ч. (1Н). Приклад 8. 6-[2-(4-Метилпіперидин-1-іл)етил]бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін (8). Синтез проводили як описано у прикладі 6, виходячи із 0.56г (0.002моль) 6-(2хлоретил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (13) та 3 0.71см (0.60г, 0.006моль) 4-метилпіперидину. Отриману сполуку перекристалізовують з метанолу. Вихід 0.47г (68%). C22H24N4. M.W. 344.46. Т.пл.=108-110°С. Rf=0.07 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.48 (бензол:триэтиламин (10:1)). Мас+ спектр (БША), m/z (%): 345 [М+Н] , 112 (100). Мас+ спектр (електроний удар), m/z(°/o): 344 (0.5) [М] , 244 (9), 112 (100). Спектр ПМР: розчинник - DMSOd6 аліфатичні протони: д. 0.91 м.ч., (3Н, N(СН2СН2)2СНСH3); м. 1.16-1.29 м.ч. (2Н); н/р. м. 1.38 м.ч. (1Н, Н(СН2СН2)2СНСН3); м. 1.62-1.66 м.ч. (2Н); м. 2.06-2.13 м.ч. (2Н); м. 3.00-3.04 м.ч. (4Н); т. 3.60 м.ч. (2Н). Ароматичні протони: м. 7.45-7.57 м.ч. (2Н); м. 7.62-7.67 м.ч. (1Н); м. 7.75-7.80 м.ч. (1Н); д. 7.83 м.ч. (1Н); д. 7.91 м.ч. (1Н); д. 8.16 м.ч.(1Н); д.8.53м.ч.(1Н). Приклад 9. 6-(2-Морфолін-4-ілетил)-бензо[4,5]імідазо[1,2с]хіназолін (9). Синтез проводили як описано у прикладі 6, виходячи із 0.56г (0.002моль) 6-(2хлоретил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (13) та 3 0.53см (0.52г, 0.006моль) морфоліну. Отриману сполуку перекристалізовують з метанолу. Вихід 0.54г 81%. C20H20N4O. M.W. 332.41. Т.пл.=190191°С. Rf=0.12 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.31 (бензол:триeтиламин (10:1)). Мас-спектр (БША), + m/z (%): 333 (100) [M+H] . Мас-спектр (електроний + удар), m/z (%): 332 (0.9) [М] , 314 (1.5), 245 (7), 233 (1.4), 100 (100). Спектр ПМР: розчинник - DMSOd6, аліфатичні протони: т. 2.56 м.ч. (4Н); т. 3.00 м.ч. (2Н); м. 3.61-3.65 м.ч. (6Н). Ароматичні протони: м. 7.46-7.56 м.ч. (2Н); м. 7.64-7.70 м.ч. (1Н); м. 7.777.87 м.ч. (2Н); д. 7.93 м.ч. (1Н); д. 8.17 м.ч. (1Н); д. 8.51 м.ч. (1Н). Приклад 10. 6-[2-(4-Метилтперазин-1іл)етил)]бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназолін (10). Синтез проводили як описано у прикладі 6, виходячи із 0.56г (0.002моль) 6-(2хлоретил)бензо[4,5]імідазо[1,2-с]хіназоліну (13) та 3 0.67см (0.60г, 0.006моль) морфоліну. Отриману сполуку перекристалізовують з ізопропанолу. Вихід 0.54г (78%). C21H23N5. M.W. 345.45. Т.пл.=9798°С. Rf=0 (хлороформ:ацетон (10:1)), Rf=0.13 (бензол:триэтиламин (10:1)). Мас-спектр (БША), m/z + (%): 346 [М+Н] , 275, 246, 113 (100). Мас-спектр + (електроний удар), m/z (%): 345 (2) [М] , 303 (12), 289 (5), 275 (22), 244 (20), 233 (8), 113 (81), 70 (100). Спектр ПМР: розчинник - DMSO-d6, аліфа 9 тичні протони: с 2.18 м.ч., (3Н, N(CH2CH2)2NCH3); н/р м. 2.37 м.ч. (4Н, N(CH2CH2)2NCH3); н/р м. 2.58 м.ч. (4Н, N(CH2CH2)2NCH3); т. 3.00 м.ч. (2Н, АrСH2CH2N); т. 3.60 м.ч. (2Н, ArCH2CH2N). Ароматичні протони: м. 7.47-7.59 м.ч. (2Н); м. 7.66-7.71 м.ч. (1Н); м. 7.78-7.88 м.ч. (2Н); м. 7.94 м.ч. (1Н); д. 8.17 м.ч. (1Н); д. 8.52 м.ч. (1Н). Приклад 11. Визначення цитотоксичності препаратів в умовах in vitro клітин L929 за пригніченням їх життєздатності. Параметром, за яким оцінювали токсичність доз препаратів було пригнічення їх життєздатності. [Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа. Методические указания. Сост. проф. В.И. Ильенко. - Л. - 1977. - 35с.]. Підрахунок клітин та визначення їх життєздатності через 24 та 48 годин інкубації проводили після фарбування клітин водним розчином вітального фарбника трипанового синього. При відсутності токсичного ефекту клітини засвоювали вітальний барвник. Забарвлення контрольних культур приймали за 100%. Розведення препарату, що викликало засвоєння фарбника на 50% вважали токсичним. Приклад 12. Вивчення інтерфероніндукуючих властивостей. Інтерфероніндукуючу активність синтезованих сполук вивчали як описано [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. За редакцією член-кореспондента АМН України О.В. Стефанова. / Міністерство охорони здоров'я України. Державний фармакологічний центр., Київ, 2001. С.392]. Інтерфероніндукуючу активність препаратів в умовах in vitro вивчали в культурі клітин ПТП. Пре3 парати в різних дозах (30-250мкг/см ) додавали до сформованого моношару клітин і культивували при 37°С на протязі 24 та 48год., після чого надосадову рідину збирали і в ній визначали активність інтерферону за раніше опублікованою методикою. [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. За редакцією членкореспондента АМН України О.В.Стефанова. / Міністерство охорони здоров'я України. Державний фармакологічний центр., Київ, 2001. С.392] (пригнічення цитопатогенної дії вірусу везикулярного стоматиту). Визначення активності інтерферону здійснювали через 24-48год., коли доза внесеного вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) 100 ТЦД50 викликає повну дегенерацію клітин у контролі вірусу (KB) за відсутністю дегенерації у неінфікованій культурі. За титр інтерферону в одиницях дії (ОД) приймали величину, зворотну розведенню препарату, при якому культура клітин в 50% лунок була повністю захищена від цитопатогенної дії індикаторного вірусу. 89992 10 Титр індукованого інтерферону (максимальне розведення супернатанту, при якому в 50% лунок цілком запобігалася дегенерація клітинного моношару) визначали в трьох паралельних експериментах. Виявлено, що в умовах in vitro досліджені речовини спричиняють утворення інтерферону (дані - діапазон значень, що отримані у трьох паралельних експериментах - наведені в таблиці). Приклад 13. Вивчення противірусної активності на культурі клітин L929. Вплив сполук на противірусну резистентність культур клітин L929 вивчали за допомогою мікрометоду скринінгу противірусних сполук [Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений: Метод, рекомендации / Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В. и др. Минск. - 1986.]. В 96-лункові пластикові панелі вносили суспензію клітин в концентрації, необхідній для формування суцільного шару клітин. На 2-3-й день (в залежності від активності росту культури) середовище зливали, моношар промивали середовищем для культур клітин без сироватки і вносили досліджувані препарати в серійних розведеннях в вертикальних рядах. На кожне розведення відводили 3 лунки для визначення противірусної активності, одну - для контролю токсичності. Враховували також контроль клітин та вірусу. Клітини інкубували з препаратами 24год. при 37°С, після чого середовище вилучали з лунок. В лунки для визначення контролю клітин та токсичності вносили середовище для підтримання росту клітин, у всі інші - вірусну суспензію ВВС. Для визначення ефективності захисту клітин проводили досліди із застосуванням ВВС в різних дозах: 10, 100, 1000 ЦТД50. Мікропанелі інкубували в термостаті з постійним рівнем СО2 при 37°С та вологості 98% до настання 100% цитопатичного ефекту (ЦПЕ) в лунках контролю вірусу. Потім визначали ступінь інгібування вірусоспецифічного ЦПЕ. Аналіз пригнічення вірусної реплікації проводили через 24год. Противірусну активність препаратів МК оцінювали за цитопатичним ефектом в формі некрозу (визначення проценту клітин, що загинули за допомогою прямого підрахунку під мікроскопом). Визначали: ІД50 - дозу (мкг/мл), що затримує ЦПЕ вірусу на 50%. Дані про цитотоксичність, інтерфероніндукуючу та противірусну активність сполук 1-10 наведені в таблиці. Як видно з наведених даних, сполуки, що заявляються, є ефективними індукторами інтерферону і противірусними агентами, причому противірусна активність сполук 3, 4, 6 - 10 при профілактичному введенні набагато вища, ніж при одночасному, что свідчить на користь інтерферонопосередкованого механізму противірусної дії. 11 89992 12 Таблиця Цитотоксичність, інтерфероніндукуюча та противірусна активність сполук, що заявляються Сполука 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 А Цитотоксичність ІД100 52,1 52,1 13,0 104,2 208,3 189,14 181,44 11,35 47,00 180,92 300 Противірусна активність Інтерфероніндукуюча активність При одночасному введенні При профілактичному введенні С, μ-М Титр % живих клітин С, μ-М % живих клітин С, μ-М 1,93 8 50 20,6 3,69 12 80 9,85 25 0,185 1,85 8-16 80 19,7 99 0,023 0,96 16-32 80 81,8 99 0,024 1,47 16 95 78,6 0,05 8-16 93 0,05 100 0,012 0,04 8-16 91 0,35 100 0,011 0,09 8-16 100 0,04 100 0,011 0,73 16 83 11,76 100 0,012 0,09 8-16 83 5,64 100 0,023 25 32 75 25 50 15 Примітка: А - аміксин, "-" - активність відсутня. Комп’ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601