Похідні нафталімідооцтової кислоти як інтеркалюючі у днк індуктори інтерферону та противірусні агенти

Похідні нафталімідооцтової кислоти загальної формули 2 3 86087 4 H 3C N R1=H; n=1; R2= H3C O N N (2); (1); H3C N H3C O N H (3); H 3C R1=H; n=2; R2= HO NH N N H CH3 (7); N (4); CH3 (8); (6); (5); H 3C N R1=CH3; n=3; R2= H3C (9). Але ці сполуки характеризуються помітною цитотоксичністю. В основу винаходу поставлено задачу створити нові похідні нафталімідооцтової кислоти інтеркалюючі у ДНК індуктори інтерферону та противірусні агенти, в яких за рахунок модифікації структури бокового ланцюга в сполуках 1-9 забезпечити зниження цитотоксичності. Поставлена задача вирішена синтезом похідних нафталімідооцтової кислоти загальної формули: H3C N O A (13); (12); як інтерфероніндукуючих противірусних агентів. Причинно-наслідковий взаємозв'язок між структурою об'єктів, що заявляються, і їхньою біологічною дією полягає, очевидно, у здатності наявного в їх структурі амідного зв'язку до гідролізу у фізіологічних умовах і, як наслідок, скорочення часу дії протонова-ного ліганду ДНК у клітині, при збереженні нафталімідного фрагменту, який забезпечує інтеркаляцію в ДНК, противірусну та інтерфероніндукуючу активності. Сполуки 10-13 одержували конденсацією хлороангідриду нафталімідооцтової кислоти (16) з діалкіламіноалкіламінами (17-21), яку здійснювали змішуванням еквімольної кількості відповідного аміну із розчином хлорангідриду у безводному 1,4діоксані з наступним виділенням та очисткою цільового продукту. Чистота цільових сполук 10-13 підтверджена тонкошаровою хроматографією, будова-даними масспектрометрії та спектроскопії 1Н-ЯМР. R O де: H3C A=(CH2)2; R= N H3 C N H3C O H N O N A=(CH2)3; R= (10); R O O OH O O 15 O O N O 16 Дослідження препаратів проводили за схемою і за умов, що враховували адекватність тестмоделі можливому механізму інтерфероногенної активності, що передбачався на підставі аналізу структури хімічної сполуки, яка вивчалась [Вильнер Л.М. Актуальные вопросы скрининга и последующего изучения противовирусных препаратов типа интер-фероногенов / В сб.: Методические вопросы научной разработки противовирусных средств. - Минск, 1977. - С. 134 - 136]. Цитотоксичність та інтерфероніндукуючу активність синтезо HN Cl O N 17 A R O H2N 18-22 A O O N O 10-14 ваних сполук вивчали як описано [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації./ За ред. чл.-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К: МОЗ, України ДФЦ, 2001. - 392с.] Отримання сполук, що заявляються, підтверджено наступними прикладами. Приклад 1. Отримання нафталімідооцтової кислоти (15). Розчин 20.81г (0.105моль) нафталевого ангідриду та 7.51г (0.1моль) a- амінооцтової кислоти в 50см3 ДМФА кип'ятили із зворотнім холодильником 5 2 години, замінювали зворотній холодильник насадкою Вюрца, приєднанною до прямого холодильника. Відганяли дистилат до досягнення температури пари 153°С. Реакційу суміш охолоджували. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою та висушували. Маточний розчин нагрівали до 100°С й додавали гарячу воду до замутнення та відфільтровували. Осад, що випав при охолодженні, відфільтровували та об'єднували із першим осадом, висушували та перекристалізовували з чотирихлористого вуглецю. Вихід 19.80г (74%). C14H9NO4. M.W. 255.23. Мас-спектр (ЕВ) [М+] = [255]. Τ пл. = 245 - 278°С. Приклад 2. Отримання хлороангідриду нафталімідооцтової кислоти (16). Суміш 2.55г (0.01моль) нафталімідооцтової кислоти і 3.3см3 (0.03моль) хлористого тіонілу кип'ятили зі зворотним холодильником до повного розчинення осаду, випаровували у вакуумі досуха. Додавали безводний бенол (5см3) і знову випаровували у вакуумі. Операцію повторювали тричі. Сухий залишок висушували у вакуумі та використовували без додаткового очищення. Вихід сирого продукту 2.02г (74%). C16H12CINO3. M.W. 273.68. Mac-спектр (EB) m/z (%): [M+] = [273+275]. Приклад 3. Отримання N-(2-диетиламіноетил)2-нафталімідоацетаміду (10). В 30см3 безводного діоксану при перемішуванні розчиняли 2.73г (0.01моль) хлороангідриду нафталімідооцтової кислоти і 1.16г (0.01моль) 2(діетиламіно)етиламіну. Продовжували перемішування при 70°С протягом 4-5 год (контроль за ТШХ). Випаровували реакційну суміш до об'єму 23см3 і виливали у 250 см3 води. Додавали розчин карбонату натрію до рН = 9, екстрагували хлороформом (3x50см3). Органічний екстракт підсушували і випаровували досуха. Сухий залишок екстрагували гептаном (5x30см3). При охолодженні випадали кристали цільового продукту. Осад відфільтровули і промивали на фільтрі охолодженим гептаном. Вихід: 2.43г (69%). C20H23N3O3. M.W. 353.42. Мас-спектр (БША), m/z (%):354 (100) [М+Н]+. Τ пл.=196-197°С. Аналогічно отримували сполуки 11-13. Приклад 4. Отримання N-(2-(морфолін-4ил)етил)-2-нафталімідоацетаміду (11). Синтез проводили як описано у прикладі 3, виходячи із 2.73г (0.01моль) хлороангідриду нафталімідооцтової кислоти і 1.30г (0.01моль) 2(морфолін-4-ил)етиламіну. Вихід: 1.76г (48%). C20H21N3O4. M.W. 367.41. Мас-спектр (БША), m/z (%): 368 (100) [М+Н]+. Τ пл.-215-216°С. Приклад 5. Отримання N-(2диетиламінопропіл)-2-нафталімідоацетаміду (12). Синтез проводили як описано у прикладі 3, виходячи із 2.73г (0.01моль) хлороангідриду нафталімідооцтової кислоти і 1.30г (0.01моль) 2(диетиламіно)пропіламіну. Вихід: 1.39г (38%). C21H25N3O3. M.W. 367.45. Мас-спектр (БША), m/z (%): 368 (100) [М+Н]+. Т пл. (гідрохлорид) = 255258°С. Приклад 6. Отримання N-(2диметиламінопропіл)-2-нафталімідоацетаміду (13). 86087 6 Синтез проводили як описано у прикладі 3, виходячи із 2.73г (0.01моль) хлороангидриду нафталімідооцтової кислоти і 1.04г (0.01моль) 3(диметиламіно)пропіламіну. Вихід: 1.49г (44 %). C19H21N3O3. M.W. 339.40. Мас-спектр (БША), m/z (%): 340 (100) [М+Н]+.Тпл. = 191-192°С. Приклад 7. Вивчення афінітету до ДНК Приготування вихідних концентрованих розчинів Розчиняли 70мг ДНК у 100см3 води (одержали розчин "a"). 545мг NaCl розчиняли у 100см3 води (одержали розчин "β"). 36мг ЕДТА розчиняли у 100см3 води (одержали розчин "δ"). 52.2мг етидію броміду розчиняли у 100см3 води; одержали розчин з концентрацією 1.324x10-3 Μ (розчин "ε"). Приготування концентрованого буферного розчину (розчин "c") Розчиняли у склянці на 50см3 164мг безводного ацетату натрію в 20см3 води і додавали по краплях розведену водою (1:3) оцтову кислоту до рН=5 (контролювали рН за допомогою повіреного й відкалибованого рН-метру). Вміст склянки кількісно перенесли у мірну колбу на 100см3 і додали воду до мітки. Приготування контрольного розчину для "гасіння" Внесли у мірну колбу на 50см3 4см3 розчину a, 3 5см розчину β, 5см3 розчину c, 5см3 розчину δ і 0.151 (0.150-0 152)см3 розчину ε. Додали воду до мітки (одержали розчин А). Приготування контрольного розчину для "витиснення" Внесли у мірну колбу на 50см3 0.1см3 розчину a, 5см3 розчину β, 5см3 розчину c, 5см3 розчину δ і 0.096 (0.09-0.100) см розчин у ε. Додали воду до мітки (одержали розчин В). Приготування буфера розведення Внесли у мірну колбу на 50см3 10см3 розчину β, 10см3 розчину c, 10см3 розчину δ. Додали воду до мітки (одержали розчин С). Приготування концентрованого розчину ліганду Розрахункову кількість ліганду розчиняли у 100см дистильованої води, прагнучи одержати розчин з концентрацією у 20-30 разів більшою, ніж очікуване значення С50 (одержали розчин D). Приготування вихідних розчину ліганду Додали у 8 мірних колб на 25см3 0.5, 0.9,1.3,2.5,4.0, 7.5,10.0,15.0, см3 розчину D. Додали воду до мітки (одержали розчини Е1 - Е8). Як розчин Е9 використовували розчин D. Приготування робочих розчинів ліганду У 9 пробірках змішували по 1см3 розчинів Е1Е9 з 1см3 розчину С (одержали розчини F1-F9). Приготування розчинів ліганду для вивчення гасіння У 9 пробірок, що містять по 2см3 розчинів F1F9 додавали по 2см3 розчину А (для вивчення гасіння), одержують розчини G1-G9 (одержали розчини G1-G9). Додатково готували розчин G10 змішуючи 2см3 розчину А, 1см води і 1см3 розчину С. Приготування розчинів ліганду для вивчення витиснення 7 У 9 пробірок, що містять по 2см3 розчинів F1F9 додавали по 2см3 розчину В (для вивчення витиснення), одержують розчини Н1-Н9. Додатково готували розчин Н10 змішуючи 2см3 розчину В, 1см3 води і 1см3 розчину С Проведення вимірів У кювету спектрофлуориметру додали 2.5см3 досліджуваного розчину, кювету установили у кюветоутримувач і записували спектр флуоресценції в інтервалі довжин хвиль 520-630нм. Виділяли пік, що відповідає етідію броміду (lmах=595±2нм) і з'єднували мінімуми прямою (базис). З вершини піка опускали перпендикуляр, відзначали точку його перетинання з базисом і вимірювали довжину отриманого відрізку. Процедуру повторювали для розчинів G1-G10 і Н1-Н10. Інтенсивність флуоресценції розчинів G1-G9 і Н1-Н9 виражали у відсотках щодо інтенсивності флуоресценції розчинів G10 і Н10 відповідно. Відсоток витиснення етидію броміду з комплексу визначали за формулою: D%=I%G-I%H На графіку відкладали величини D%, I%G і I%H як функції від концентрації. Проводили пряму D%=50% і з точки її перетину з графіком D%=F(З) опускали перпендикуляр. Отримане значення концентрації приймали за C50. Якщо величина 1%H не перевищує 5-10%, то будували залежність I%G від lgCL. Отримані значення апроксимували сигмоїдою. Точку, що відповідає lgCL визначали як точку перегину, а її довірчий інтервал - як ширину коридору помилок при 50% витисненні. Логарифм константи асоціації ліганду з ДНК визначали за формулою: lgKa=lgCE-lgC50+7 Приклад 8. Визначення цитотоксичності препаратів в умовах in vitro клітин за дією на моношар клітин та пригніченням їх життєздатності. Перещеплювану культуру клітин фібробластів свиней-перевивних тестикул поросяти (ПТП)вирощували у 96-лункових мікроплатах (в атмосфері, що містить 5% СО2). Через 24год з лунок, де сформувався суцільний моношар клітин видаляли середовище росту і вносили підтримуюче середовище та розчинені препарати в діапазоні концентрацій від 5 до 500мкг/см3 (на одне розведення не менше 4 лунок). Контроль-лунки, в які було внесене тільки середовище для підтримання росту. Плати поміщали в термостат. Через 24 та 48год після інкубації плат при 36°С в умовах 5% СО2 клітини проглядали за допомогою інвертованого мікроскопу при малому збільшенні з метою виявлення цитопатичної дії (ЦПД) препаратів, яку оцінювали за порушенням цілісності мо-ношару, появою осередків дегенерованих клітин та визначали за чотириплюсовою системою. Визначали: ТЦД100 - тканинну цитотоксичну дозу (мкг/см3), що викликає повну деструкцію клітин, ТЦД50 - тканинну цитотоксичну дозу (мкг/см3), що викликає зміну 50% моношару клітин; МВК - максимально витримувану концентрацію - максимальну із досліджених доз речовини (мкг/см3), що не викликає незворотніх змін у морфології та життєздатності клітин у порівнянні з контролем (фактично вона відповідає ТЦД0). 86087 8 Розрахунок ТЦД50 проводили за методом Ріда і Менча за формулами: log2ТЦД50=log2А-(50-b)×log2d/(а-b) чи log2ТЦД50=log2В+(а-50)×log2d/(а-b), де log2А і log2В - логарифми концентрацій за основою 2, що викликали ефекти відповідно більше чи менше 50%, але найближчі до 50%: а і b ефект, викликаний концентраціями А і В, %: log2d логарифм за основою 2 співвідношення між досліджуваними концентраціями. Другим параметром, за яким оцінювали токсичність доз препаратів було пригнічення їх життєздатності. [Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа. Методические указания. Сост. проф. В.И. Ильенко. - Л. - 1977. - 35с]. Підрахунок клітин та визначення їх життєздатності через 24 та 48 годин інкубації проводили після фарбування клітин водним розчином вітального фарбника трипанового синього. При відсутності токсичного ефекту клітини засвоювали вітальний барвник. Забарвлення контрольних культур приймали за 100%. Розведення препарату, що викликало засвоєння фарбника на 50% вважали токсичним. Приклад 9. Вивчення інтерфероніндукуючих властивостей. Інтерфероніндукуючу активність синтезованих сполук вивчали як описано [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. За редакцією член-кореспондента АМН України О.В. Стефанова. / Міністерство охорони здоров'я України. Державний фармакологічний центр., Київ, 2001. С 392]. Інтерфероніндукуючу активність препаратів в умовах in vitro вивчали в культурі клітин ПТП. Препарати в різних дозах (30-250мкг/см ) додавали до сформованого моношару клітин і культивували при 37°С на протязі 24 та 48год, після чого надосадову рідину збирали і в ній визначали активність інтерферону за раніше опублікованою методикою. [Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. За редакцією членкореспондента АМН України О.В. Стефанова. / Міністерство охорони здоров'я України. Державний фармакологічний центр., Київ, 2001. С. 392] (пригнічення цитопатогенної дії вірусу везикулярного стоматиту). Визначення активності інтерферону здійснювали через 24-48год, коли доза внесеного вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) 100 ТЦД50 викликає повну дегенерацію клітин у контролі вірусу (KB) за відсутністю дегенерації у неінфікованій культурі. За титр інтерферону в одиницях дії (ОД) приймали величину, зворотну розведенню препарату, при якому культура клітин в 50% лунок була повністю захищена від цитопатогенної дії індикаторного вірусу. Титр індукованого інтерферону (максимальне розведення супернатанту, при якому в 50% лунок цілком запобігалася дегенерація клітинного моношару) визначали в трьох паралельних експериментах. 9 86087 Виявлено, що в умовах in vitro досліджені речовини спричиняють утворення інтерферону (дані - діапазон значень, що отримані у трьох паралельних експериментах - наведені в таблиці). 10 Дані про цитотоксичність та інтерфероніндукуючу активність сполук 10-13 та сполук порівняння 1-9 наведені в таблиці. Таблиця Інтеркалююча здатність, цитотоксичність та інтерфероніндукуюча активність сполук, що заявляються Сполука lgKa токсичність, -lgLC50 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 6.99 5.38 5.29 5.57 6.56 6.93 5.57 5.50 5.54 5.66 5.31 5.46 4.42 3.54 3.89 4.40 4.44 3.87 4.38 3.58 3.29 3.17 3.31 3.63 Противируснаактивність, % живих клітин 30.5 72.2 44.4 16.6 16.6 30.5 2.8 100 100 100 100 88.8 Як видно з наведених даних, сполуки, що заявляються, є інтеркаляторами помірної сили та індукторами інтерферону, причому за своєю актив Комп’ютерна верстка В. Клюкін Інтерфероніндукуюча активність (X log2) L929 ПТП (2.5mМ) (11mМ) (2.5mМ) (11mМ) 3 5 1 1 2.4 4.5 0.5 5 7 2 4 4.5 7 2 2 4 6 3 4 4.5 7 3.5 4 4 6.5 2 3 5 7 0 0 5 6 0 0 4.8 6.5 4 3 5 2 1 1 5 6.5 4.3 3.2 ністю перевершують сполуки порівняння. Водночас, цитотоксична концентрація їх дещо вища за ЦТК сполук порівняння. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601