Спосіб модифікації середовища yma для виділення ендофітної мікробіоти винограду

Реферат: Спосіб модифікації середовища YMA для виділення ендофітної мікробіоти винограду. Середовище готують з дріжджового екстракту, маніту, К2НРО4×3Н2О, MgSO4×12H2O, NaCl, агарагару та застосовують для виділення представників мікробіоти рослин. Концентрація дріжджового екстракту складає 0,6 г/л, а маніту - 6,0 г/л. Використовують середовище для виділення як патогенної, так і сапрофітної мікробіоти рослин. UA 95964 U (54) СПОСІБ МОДИФІКАЦІЇ СЕРЕДОВИЩА YMA ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ ЕНДОФІТНОЇ МІКРОБІОТИ ВИНОГРАДУ UA 95964 U UA 95964 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до способів виділення мікроорганізмів з рослин і представляє собою спосіб модифікації середовища для зменшення собівартості мікробіологічних досліджень та розширення спектру виділюваних бактерій. Дане середовище може використовуватися у мікробіології для виділення більшої кількості представників мікробіоти рослин, а також у біотехнології для пошуку штамів мікроорганізмів з корисними властивостями. Відома невелика кількість живильних середовищ для виділення мікроорганізмів з рослин. Досягнутий рівень в області середовищ для виділення представників ендофітної мікробіоти описано в наступних джерелах. Відоме середовище YPGA ("yeast peptone glucose agar" - глюкозо-пептонний дріжджовий агар), описане в Lelliot R.A., Stead D.E. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. In Methods in plant pathology. - Vol. 2. - 1987. - P. 216. Склад середовища: дріжджовий екстракт - 5 г, глюкоза - 10 г, пептон - 5 г, агар-агар - 15 г. Недоліком середовища є те, що до його складу входять компоненти з високою собівартістю - пептон і глюкоза, і підвищена концентрація дріжджового екстракту, а саме середовище рекомендується лише для виділення фітопатогенів. Відоме середовище YEM ("yeast-mannitol medium" - дріжджово-маннітолове середовище), описане в Wang Kan (Ed.). Agrobacterium protocols. - Vol. 1. - 2006, Humana Press: Totowa, New Jersey. - P. 3-15. Склад середовища: маніт - 10 г, дріжджовий екстракт - 0,4 г, K2НРО4 - 0,5 г, MgSO4 - 0,2 г, агар-агар - 15 г. Недоліком середовища є те, що до його складу входить маніт у високій концентрації (10 г/л), що робить високою собівартість середовища, і лише дві солі, що обмежує ріст деяких мікроорганізмів, а використовують його лише для виділення агробактерій. Найбільш близьким до запропонованого є середовище YMA (прототип), описане в Bishop A.L., Katz B.H., Burr T.J. Infection of grapevines by soilborne Agrobacterium tumefaciens biovar 3 and population dynamics in host and nonhost rhizosphere // Phytopathology. - 1988. - Vol. 78, № 9. - P. 945-948. Склад середовища: дріжджовий екстракт - 1 г, маніт - 10 г, К2НРО4×3Н2О - 0,65 г, MgSO4×12H2O - 0,2 г, NaCl - 0,12 г, агар-агар - 15 г. Недоліком середовища є те, що до його складу також входить манітол у високій концентрації (10 г/л), що робить високою собівартість середовища, висока концентрація дріжджового екстракту (1 г/л), і те, що його використовують лише для виділення патогенних агробактерій. В основу корисної моделі поставлено задачу створити ефективне живильне середовище зі зниженою собівартістю, яке б дозволяло виділяти широкий спектр представників мікробіоти рослин (патогенних і сапрофітних). Ця задача вирішується середовищем, яке складається з дріжджового екстракту, маніту, K2НРО4×3Н2О, MgSO4×12H2O, NaCl, агар-агару і призначається для виділення представників мікробіоти рослин, і відрізняється тим, що концентрація дріжджового екстракту складає 0,6 г/л, а маніту - 6,0 г/л (зменшення на 40 %), а використовують середовище для виділення як патогенної, так і сапрофітної мікробіоти рослин. На середовище висівають екстракти з судин пагонів винограду, вирощують добу при 28 °C і отримують рясний ріст представників ендофітної мікробіоти винограду. Загальними ознаками прототипу і запропонованого середовища є те, що до складу середовища входять дріжджовий екстракт, маніт, К2НРО4×3Н2О, MgSO4×12H2O, NaCl, агар-агар, і середовище використовують для виділення представників мікробіоти рослин. Відмінними ознаками від прототипу є те, що концентрація дріжджового екстракту та маніту у складі середовища зменшена на 40 %, а модифіковане середовище використовують для виділення більш широкого спектру представників мікробіоти рослин (не тільки патогенних, а і сапрофітних). Запропоноване середовище застосовують наступним чином. Середовище готують, змішуючи такі кількості компонентів (в 1 л дистильованої води): дріжджовий екстракт - 0,6 г, маніт - 6,0 г, К2НРО4×3Н2О - 0,65 г, MgSO4×12Н2О - 0,2 г, NaCl - 0,12 г, агар-агар - 15 г. Для досліджень відбирають здерев'янілу лозу завдовжки 10 см, миють її під проточною водою з детергентом, ретельно ополіскують, фламбують, а потім подрібнюють на диски завтовшки 0,5 см. Диски поміщають в стерильні бюкси і заливають стерильною дистильованою водою так, щоб подрібнений матеріал був повністю покритий водою. Бюкси поміщають в холодильник при 4 °C, а через добу отриману суспензію висівають в кількості 100 мкл на запропоноване середовище. Посіви інкубують одну добу при 28 °C. Надалі обраховують кількість колоній, що виросли, і відбирають колонії, потрібні для наступних досліджень. Дослідження модифікованого середовища для виділення ендофітної мікробіоти винограду проведено на кафедрі мікробіології, вірусології та біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова. 1 UA 95964 U Проводили оптимізацію поживного середовища YMA, для чого зменшували концентрації компонентів, собівартість яких була найбільшою - дріжджового екстракту і маніту (табл. 1). Таблиця 1 Концентрація клітин через добу культивування (кл/мл) штаму штаму Alcaligenes Agrobacterium vitis faecalis ОНУ 452 U6 Концентрація компонентів (г/л) Варіант Органічні компоненти І II III IV (контроль) V VI 5 10 15 20 25 30 35 Дріжджовий екстракт 0,8; маніт - 8,0 Дріжджовий екстракт 0,6; маніт - 6,0 Дріжджовий екстракт 0,4; маніт - 4,0 Дріжджовий екстракт 1,0; Маніт - 10,0 Дріжджовий екстракт 0,6; Маніт - 10,0 Дріжджовий екстракт 1,0; маніт - 6,0 Солі (2,1±0,2)×10 8 (7,6±0,5)×10 (1,1±0,2)×10 6 (7,2±0,3)×10 (2,1±0,6)×10 8 (7,5±0,2)×10 (1,7±0,2)×10 7 (7,6±0,6)×10 (2,1±0,4)×10 (7,4±0,3)×10 (2,6±0,4)×10 К2НРО4×3Н2О 0,65; MgSO4×12Н2О 0,2; NaCl - 0,12 8 7 8 (7,8±0,3)×10 7 7 7 7 7 У рідкому середовищі різних варіантів вивчали ріст двох представників ендофітної мікробіоти винограду - сапрофітного виду Alcaligenes faecalis штам ОНУ 452 та фітопатогенного виду Agrobacterium vitis штам U6. 1 % добової культури цього штаму засівали у рідкі середовища вищенаведених складів, поміщали у термостат при 28 °C і кожні дві години відбирали культуру, що росте, для визначення концентрації клітин на спектрофотометрі. На основі отриманих даних будували криві росту штамів R. vitis U6 та A. faecalis ОНУ 452 у середовищах різного складу, порівнюючи з кривою росту на стандартному середовищі YMA. У І, II та VI варіантах ріст бактерій штаму R. vitis U6 не відрізнявся від такого у контролі (табл. 1). Для штаму A. faecalis ОНУ 452 можна було використовувати усі тестовані нами концентрації (табл. 1). Оскільки в II варіанті концентрація органічних компонентів була найменшою (дріжджовий екстракт - 0,6; маніт - 6,0 г/л, зменшення на 40 %), то даний оптимізований склад може бути рекомендовано для використання замість звичайного складу середовища YMA, що дозволить зменшити його собівартість. Отже, для виділення ендофітної мікробіоти винограду можна використовувати середовище YMA модифікованого складу (г/л): дріжджовий екстракт - 0,6; маніт - 6,0; К2НРО4×3Н2О 0,65; MgSO4×12Н2О - 0,2; NaCl - 0,12; агар-агар - 15 г. Ефективність запропонованого середовища підтверджується наступними прикладами. Приклад 1 Здійснювали посіви з 8 зразків лози винограду сорту Піно чорний на середовище модифікованого складу. Для цього здерев'янілу лозу завдовжки 10 см мили під проточною водою з детергентом, ретельно ополіскували, фламбували, а потім подрібнювали на диски завтовшки 0,5 см. Диски поміщали в стерильні бюкси і заливали стерильною дистильованою водою так, щоб подрібнений матеріал був повністю покритий водою. Бюкси поміщали в холодильник при 4 °С, а через добу отриману суспензію висівали в кількості 100 мкл на середовища для культивування мікроорганізмів, виділених з рослинних тканин. Посіви інкубували добу при 28 °C. Порівнювали чисельність мікробіоти, встановлену таким чином, з чисельністю, підрахованою при рості бактерій на контрольному середовищі YMA звичайного складу (табл. 2). 2 UA 95964 U Таблиця 2 № зразка 1 2 3 4 5 6 7 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 YMA контроль 6 (2,0±0,7)×10 5 (4,5±0,4)×10 5 (3,7±0,2)×10 6 (7,5±1,3)×10 5 (1,1±0,3)×10 6 (2,5±0,4)×10 5 (2,2±0,3)×10 6 (2,6±0,5)×10 YMA модифікованого складу 6 (5,4±1,8)×10 6 (3,5±0,6)×10 5 (3,1±0,5)×10 7 (1,4±0,2)×10 6 (4,0±0,7)×10 7 (2,5±0,4)×10 5 (3,0±0,8)×10 6 (2,0±0,4)×10 Видно, що чисельність мікробіоти або не відрізнялась від такої на контрольному середовищі YMA звичайного складу (зразки №№ 1, 3, 7, 8), або була більшою на порядок (зразки №№ 2, 4, 5, 6). Отже, модифіковане середовище можна успішно застосовувати для виділення ендофітної мікробіоти винограду. Приклад 2 Здійснювали висів мікробіоти винограду з лози 10 рослин, інфікованих бактеріальним раком, так само, як це було описано у прикладі 1. Для виявлення фітопатогенних Agrobacterium vitis і Agrobacterium tumefaciens серед усіх інших виділених штамів використовували метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Тестували ДНК із суміші усіх колоній, для чого використовували тест-набір для виділення ДНК ("АмплиСенс", Росія). Реакційну суміш для проведення ПЛР з метою виявлення збудника бактеріального раку готували згідно з методикою, запропонованою J. Haas et al. (1995): 5,8 мкл дейонізованої води; 4 мкл 5х ПЛР буфера ("АмплиСенс", Росія); 2,0 мкл 2 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатів (200 мкМ); 1,0 мкл кожного із 10 мМ праймерів (0,5 мкМ); 0,4 мкл Taq-полімерази; 0,8 мкл 50 мМ Mg++; 5 мкл проби ДНК. Використовували праймери до ділянки гена ізопентенилтрансферази ipt, ділянки гена ендонуклеази VirD2 та ділянки гена virC ДНК збудників бактеріального раку. ДНК бактерій ампліфікували з даними праймерами шляхом чергування 1 хвилини денатурації при 94 °C, 1 хвилини відпалу при 52 °C, 1 хвилини елонгації при 72 °C, і кількість таких циклів дорівнювало 40. За позитивний контроль мали патогенний штам A. tumefaciens C58, за негативний контроль деіонізовану воду. Облік результатів класичної ПЛР проводили за допомогою електрофорезу. Виявилося, що в усіх досліджених зразках за допомогою модифікованого нами середовища було виділено збудники бактеріального раку, належність яких до виду Agrobacterium vitis була підтверджена наявністю в геномах виділених штамів генних послідовностей virC, ipt та virD2 до генів патогенності, які кодують синтез цитокінінів, регуляторні функції та ендонуклеази фактори патогенності, притаманні збудникам бактеріального раку. Отже, за допомогою модифікованого середовища можна успішно виділяти фітопатогенні бактерії. Приклад 3. Виділяли мікробіоту судин винограду на живильне середовище модифікованого складу так само, як це було описано у прикладі 1. З колоній, що виросли на різних живильних середовищах після посівів ендофітної мікробіоти винограду, здійснювали пересіви шляхом переколу бактеріальною петлею безпосередньо на бактеріальний газон A. tumefaciens С58. Газон попередньо засівали добовою культурою фітопатогена, використовуючи 0,8 % середовище LB. Надалі газони культивували при 28 °C протягом 1-2 діб, а потім виявляли наявність зон затримки росту культури фітопатогена. Виявилося, що один з виділених штамів утворював велику зону затримки росту на газоні фітопатогена R. radiobacter C58. Розмір зони затримки росту становив 8-10 мм. З колонії, що створювала зону затримки росту патогену, здійснювали пересів біомаси для подальшої ідентифікації. За біохімічними властивостями виділений штам-антагоніст було віднесено до виду Alcaligenes faecalis. Отже, запропоноване середовище можна застосовувати для виділення штамів-антагоністів. Таким чином, встановлено, що запропоноване середовище передбачає використання меншої кількості компонентів, що здешевлює його використання, і дозволяє виділяти як фітопатогенні бактерії, так і сапрофітні бактерії-антагоністи. 3 UA 95964 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб модифікації середовища YMA для виділення ендофітної мікробіоти винограду, який полягає в тому, що середовище готують з дріжджового екстракту, маніту, K2НРО4×3Н2О, MgSO4×12H2O, NaCl, агар-агару та застосовують для виділення представників мікробіоти рослин, який відрізняється тим, що концентрація дріжджового екстракту складає 0,6 г/л, а маніту - 6,0 г/л, а використовують середовище для виділення як патогенної, так і сапрофітної мікробіоти рослин. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4