Спосіб стандартизації квіток осоту в багатокомпонентних рослинних сумішах

Реферат: Спосіб стандартизації квіток осоту городнього в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Крім цього квітки осоту городнього в рослинних сумішах, що містять в своєму складі квітки осоту городнього, плоди шипшини, листя кропиви дводомної, плоди глоду, кореневища з коренями валеріани лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону, визначають хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водно-ацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки за наявністю та вмістом флавоноїду лютеоліну, вміст якого повинен бути не менше ніж 0,03 % у перерахунку на висушену сировину. UA 95984 U (54) СПОСІБ СТАНДАРТИЗАЦІЇ КВІТОК ОСОТУ В БАГАТОКОМПОНЕНТНИХ РОСЛИННИХ СУМІШАХ UA 95984 U UA 95984 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до фітохімії, і може бути використана для стандартизації лікарської рослинної сировини та рослинних сумішей. Відомо, що сировина осоту городнього має багаторічний досвід успішного використання в народній медицині та входить до складу великої кількості багатокомпонентних біологічних добавок [1, 2]. Даній лікарській сировині притаманний широкий спектр біологічної дії, зокрема жовчогінні, антиоксидантні, сечогінні, потогінні та кровоспинні властивості [1-6]. За літературними даними антиоксидантна дія квіток осоту городнього пов'язана з високим вмістом флавоноїдів [3, 4]. Виходячи з того, що мажоритарним представником фракції флавоноїдів в квітках рослини є флавоноїд лютеолін [2-4], вважалось за доцільне дослідити можливість використання цієї сполуки як маркера для визначення квіток осоту городнього в рослинних сумішах. У зв'язку з тим, що сировина осоту городнього ще є маловивченою та у відкритому доступі не представлено жодної методики стандартизації зазначеної сировини, за прототип було прийнято спосіб ідентифікації квіток кульбаби лікарської за наявністю лютеоліну, що проводиться за допомогою методу ТШХ, з використанням хроматографічної пластинки "Kieselgel-60 F254, розміром 10 см × 15 см та рухомої фази бензол-етилацетат-мурашина кислота (40:10:5 мл). Проявлення плям відбувається за допомогою боратно-лимонної суміші [7]. Суттєвим недоліком існуючого методу ідентифікації сировини є те, що за методикою прототипу можливе визначення лютеоліну тільки напівкількісним методом, що унеможливлює застосування зазначеної методики для кількісної стандартизації як самої досліджуваної рослинної сировини, так і її сумішей. В основу корисної моделі поставлено задачу - удосконалити ідентифікацію сировини квіток осоту городнього в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять квітки осоту городнього, плоди шипшини, листя кропиви дводомної, плоди глоду, кореневища з коренями валеріани лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону, шляхом підтвердження наявності флавоноїду лютеоліну та визначення його вмісту, і таким чином забезпечити можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина квіток осоту городнього. Поставлена задача вирішується тим, що нами запропоновано ідентифікацію та кількісне визначення лютеоліну як компонента квіток осоту городнього за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водно-ацетонітрильної рухомої фази з додаванням трифтороцтової кислоти, застосування якої дозволяє добитися розділення піків лютеоліну квіток осоту городнього та біологічно активних речовин інших рослин. Як зазначалося, в сировині квіток осоту міститься біологічно активна речовина флавоноїд лютеолін [2-4]. Виходячи з цього, з застосуванням методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), нами було розроблено хроматографічну методику визначення лютеоліну в сировині квіток осоту городнього. За розробленою методикою була проаналізована сировина квіток осоту городнього, зібрана в Київській області в 2014 р. в період цвітіння (липень). Згідно з отриманими даних, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено флавоноїд лютеолін. Його вміст в досліджуваній сировині знаходився в межах від 0,0391±0,0019 % до 0,0435±0,0017 % у перерахунку на абсолютно суху сировину. Приклади конкретного виконання. Приклад 1: Приготування досліджуваного розчину: 5 г рослинної суміші наступного складу: квіток осоту городнього - 1 г, плодів шипшини - 1 г, листя кропиви дводомної - 1 г, плодів глоду 1 г, кореневищ з коренями валеріани лікарської - 1 г, коренів цикорію дикого - 1 г, насіння льону - 1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному нагрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину достовірного зразку лютеоліну поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором в наступних умовах: колонка Phenomenex Luna С18(2), розміром 250 мм × 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки - 35 °C; довжина хвилі детектування - 368 нм; швидкість потоку рухомої фази - 1 мл/хв; 1 UA 95984 U рухома фаза: Час хроматографування (хв.) 0-5 5-35 35-40 40-60 60-65 65-70 70-85 5 10 Елюент А, % 95 95→75 75 75→50 50→20 20 95 Елюент Б, % 5 5→25 25 25→50 50→80 80 5 Елюент А: 0.1 % розчин трифтороцтової кислоти в воді; Елюент Б: 0.1 % розчин трифтороцтової кислоти в ацетонітрилі. Вміст флавоноїду лютеоліну в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: A пр  C ст  100  100  100 ; X A ст  mпр  100  W  де A пр - площина піку лютеоліну на хроматограмі досліджуваного розчину; A ст - площина піку лютеоліну на хроматограмі розчину порівняння лютеоліну; Cст - концентрація лютеоліну в розчині порівняння лютеоліну, г/мл; m пр - наважка досліджуваної суміші, г; 15 20 25 30 35 40 45 W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування розчину порівняння лютеоліну: 0,005 г (точна наважка) достовірного стандарту лютеоліну вміщують в мірну колбу місткістю 10 мл, розчиняють в 15 мл метанолу, доводять метанолом до мітки та перемішують. 1 мл отриманого розчину вміщують в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять до мітки метанолом та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку лютеоліну на хроматограмі розчину порівняння лютеоліну. На підставі експериментальних даних для сировини квіток осоту городнього нами рекомендований наступний граничний вміст флавоноїду лютеоліну: не менше 0,03 % в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Модельна суміш без вмісту квіток осоту городнього. 5 г рослинної суміші наступного складу: плодів шипшини - 1 г, листя кропиви дводомної - 1 г, плодів глоду - 1 г, кореневищ з коренями валеріани лікарської - 1 г, коренів цикорію дикого - 1 г, насіння льону - 1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному нагрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. Екстракт квіток осоту городнього. 1 г квіток осоту городнього вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному нагрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Хроматограми розчину порівняння лютеоліну, екстракту квіток осоту городнього, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту квіток осоту городнього представлені на фіг. 1, фіг. 2, фіг. 3 та фіг. 4 відповідно. За даних умов аналізу пік лютеоліну має час виходу близько 46,8 хвилини (фіг. 1). На хроматограмах екстракту квіток осоту городнього та досліджуваного розчину присутній пік лютеоліну (фіг. 2 та фіг. 3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту квіток осоту городнього (фіг. 4) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять квітки осоту городнього, плоди шипшини, листя кропиви дводомної, плоди глоду, кореневища з коренями валеріани лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону, 2 UA 95984 U 5 присутність та вміст квіток осоту городнього можливо визначати за наявністю та кількісним вмістом флавоноїду лютеоліну. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини квіток осоту городнього в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять квітки осоту городнього, плоди шипшини, листя кропиви дводомної, плоди глоду, кореневища з коренями валеріани лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону за наявністю та вмістом флавоноїду лютеоліну як фізіологічно активного компонента, що присутній в квітках осоту городнього. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та корисній моделі наведено в таблиці. 10 Таблиця Характеристика способів стандартизації прототипу та корисної моделі № п/п 1 2 15 20 25 30 Об'єкт Найближчій аналог Корисна модель Компонент Об'єкт дослідження Лютеолін Квітки кульбаби лікарської Лютеолін Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: квітки осоту городнього, плоди шипшини, листя кропиви дводомної, плоди глоду, кореневища з коренями валеріани лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону. Метод визначення Метод ТШХ якісне специфічне визначення. Можливість напівкількісної стандартизації сировини. Метод ВЕРХ кількісне специфічне визначення. Можливість кількісної стандартизації сировини та багатокомпонентних рослинних сумішей квіток осоту городнього; специфічне визначення Джерела інформації: 1) Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. Гродзінський А.М. - К.: Головна ред. УРЕ, 1989. – 544 с. 2) Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейство Asteraceae (Compositae). СПб.: Наука, 1993. – 351 с. 3) Yin, J., Kwon G. J., Wang M. H. The antioxidant and cytotoxic activities of Sonchus oleraceus L. extracts / Nutrition research and practice. - 2007. - Vol. 1. - 189-194. 4) Yin, J., Si C, Wang M. Antioxidant activity of flavonoids and their glucosides from Sonchus oleraceus L. / Journal of Applied Biology Chemistry. - 2008. - Vol. 51. - P. 57-60. 5) Schaffer S., Schmitt-Schillig S., Muller W.E., Eckert, G.P. Antioxidant properties of Mediterranean food plant extracts: Geographical differences / Journal of physiology and pharmacology. - 2005. - Vol. 56. - P. 115-124. 6) Simopoulos A. P. Omega-3 fatty acids and antioxidants in edible wild plants / Biological Research. - 2004. - Vol. 37. - P. 263-277. 7) Пат. на корисну модель 16657 Україна, МПК G01N 30/02. Спосіб ідентифікації квіток кульбаби лікарської / Цуркан О.О., Ковальчук Т.В., Шкляєв С.А., Гудзенко А.В.; заявник і патентовласник ДУ „Інститут фармакології та токсикології АМН України". - № u 200602243; заявл. 01.03.2006; опубл. 15.08.2006, Бюл. № 8. 8) Справочник "Компендиум-2011 - лекарственные препараты": в 2-х т. / Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова. - К.: Морион, 2011. - 2270 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб стандартизації квіток осоту городнього в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), який відрізняється тим, що квітки осоту городнього в рослинних сумішах, що містять в своєму складі квітки осоту городнього, плоди шипшини, листя кропиви дводомної, плоди глоду, кореневища з коренями валеріани лікарської, корені цикорію дикого та насіння льону, визначають хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водно-ацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки за наявністю та вмістом флавоноїду лютеоліну, вміст якого повинен бути не менше ніж 0,03 % у перерахунку на висушену сировину. 3 UA 95984 U Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4