Спосіб стандартизації квіток цмину піскового (helichrysum arenarium l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Реферат: Спосіб стандартизації квіток цмину піскового (Helichrysum arenarium L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах здійснюють з використанням методу ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографії). Наявність та вміст квіток цмину піскового в рослинних сумішах, що містять в своєму складі квітки цмину піскового, плоди глоду колючого, корені алтею лікарського, корені солодки голої, корені цикорію дикого, корені кульбаби лікарської, шишки хмелю, траву кропиви собачої, листя та квітки глоду, траву звіробою та насіння льону, визначають шляхом приготування рослинної суміші, її очищенням. Далі здійснюють хроматографування в градієнтному режимі з використанням водно-ацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки за наявністю та вмістом апігеніну, вміст якого повинен бути не менше ніж 0,12 % у перерахунку на висушену сировину. UA 76686 U (54) СПОСІБ СТАНДАРТИЗАЦІЇ КВІТОК ЦМИНУ ПІСКОВОГО (HELICHRYSUM ARENARIUM L.) В БАГАТОКОМПОНЕНТНИХ РОСЛИННИХ СУМІШАХ UA 76686 U UA 76686 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до фітохімії, і може бути використана для стандартизації лікарської рослинної сировини та рослинних сумішей. Відомо, що препарати на основі біологічно активних речовин квіток цмину піскового широко використовуються в медичній практиці як у вигляді монопрепаратів, так і у вигляді складових частин багатокомпонентних рослинних лікарських засобів [1]. Даній лікарській сировині притаманний широкий спектр біологічної дії, зокрема жовчогінні, протизапальні, протибактеріальні, спазмолітичні та антиоксидантні властивості тощо [2, 3]. Виходячи з того, що за літературними даними саме флавоноїдна фракція обумовлює антиоксидантні властивості в рослині [3], вважалось за доцільне дослідити можливість використання саме флавоноїдів як маркерних сполук для визначення цмину піскового в рослинних сумішах. Зокрема, флавоноїду апігеніну, який є мажоритарним представником даного класу сполук в цмині пісковому та, за даними літератури, має широкий спектр біологічної дії [3, 4, 5]. За прототип нами вибрано методику кількісного визначення в фармакопейній статті Державної фармакопеї Радянського Союзу 11 видання "Квітки цмину піскового". В даній статті стандартизація сировини цмину піскового проводиться за кількісним вмістом суми флавоноїдів, в перерахунку на ізосаліпурпозид, що проводиться за допомогою методу УФ-спектрофотометрії. В прототипі адсорбція досліджуваних розчинів після комплексоутворення вимірюється за довжини хвилі 315 нм [6]. Недоліком існуючого способу стандартизації сировини є те, що найближчий аналог передбачає стандартизацію моносировини квіток цмину піскового. Об'єкт, який підлягає удосконаленню - спосіб ідентифікації та визначення вмісту біологічно активних речовин, що містяться в сировині квіток цмину піскового в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять квітки цмину піскового, плоди глоду колючого, корені алтею лікарського, корені солодки голої, корені цикорію дикого, корені кульбаби лікарської, шишки хмелю, трава кропиви собачої, листя та квітки глоду, трава звіробою та насіння льону. Зазначена лікарська сировина широко використовується для виготовлення полікомпонентних фітозасобів, до складу яких входять квітки цмину піскового, що представлені на фармацевтичному ринку України [1]. Як зазначалося, в сировині квіток цмину піскового міститься біологічно активна речовина апігенін [3]. Виходячи з цього, з застосуванням методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), нами було розроблено хроматографічну методику визначення апігеніну в сировині цмину піскового. За розробленою методикою були проаналізовані препарати цмину піскового різних вітчизняних виробників. Зокрема, було проаналізовано: квітки цмину піскового в упаковці по 50 г (виробник: ЗАТ "Ліктрави" (серії: 101111, 111211, 30212, 40212) та квітки цмину піскового в упаковці по 20 г (виробник: ЗАТ ФФ "Віола" (серія 231110)). Вміст апігеніну в різних серіях квіток цмину піскового представлено в таблиці 1. Згідно з даними, представленими в таблиці 1, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено флавоноїд апігенін, вміст якого в досліджуваній сировині лежить в межах від 0,1453±0,0068 % до 0,1657±0,0085 % в перерахунку на висушену сировину. Таблиця 1 Вміст апігеніну в досліджуваних препаратах коренів цмину піскового № п/п 1 2 3 4 5 Препарат цмину піскового Виробник, № серії Квітки цмину піскового в пачці по 50 г Квітки цмину піскового в пачці по 50 г Квітки цмину піскового в пачці по 50 г Квітки цмину піскового в пачці по 50 г Квітки цмину піскового в пачці по 20 г ЗАТ "Ліктрави", серія 111211 ЗАТ "Ліктрави", серія 101111 ЗАТ "Ліктрави", серія 30212 ЗАТ "Ліктрави", серія 40212 ЗАТ ФФ "Віола", серія 081011 Вміст апігеніну у перерахунку на висушену сировину, % 0,1575±0,0073 0,1570±0,081 0,1657±0,0085 0,1453±0,0068 0,1608±0,0083 Процес ідентифікації та кількісного визначення флавоноїду апігеніну, як компонента сировини цмину піскового в багатокомпонентних рослинних сумішах, полягає в знаходженні 1 UA 76686 U 5 10 15 20 25 30 35 умов для хроматографічного розділення апігеніну як компонента квіток цмину піскового та біологічно активних речовин інших рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу - удосконалити стандартизацію сировини квіток цмину піскового в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності флавоноїду апігеніну та визначення його вмісту, і, таким чином, забезпечити можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина квіток цмину піскового. Поставлена задача вирішується тим, що нами запропонована ідентифікація та кількісне визначення апігеніну як компонента квіток цмину піскового за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водно-ацетонітрильної рухомої фази з додаванням трифтороцтової кислоти, застосування якої дозволяє добитися розділення піків апігеніну квіток цмину піскового та біологічно активних речовин інших рослин. Приклади конкретного виконання. Приклад 1. Приготування досліджуваного розчину: 5 г рослинної суміші наступного складу: квіток цміну піскового - 1 г, плодів глоду колючого - 1 г, коренів алтею лікарського - 1 г, коренів солодки голої - 1 г, коренів цикорію дикого - 1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, шишок хмелю - 1 г, трави кропиви собачої - 1 г, листя та квіток глоду - 1 г, трави звіробою - 1 г, насіння льону - 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному обігрівачі протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витяжок до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину достовірного зразка апігеніну поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором, в наступних умовах: колонка Synergy 4U Fusion RP, розміром 250 мм  4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки - 35 °C; довжина хвилі детектування - 330 нм; швидкість потоку рухомої фази - 1мл/хв; рухома фаза: Час хроматографування (хв) 0-5 5-30 30-40 40-45 45-60 40 50 Елюент Б, % 5 5  40 40  50 50 5 Елюент А: 0,05 % розчин трифтороцтової кислоти в воді; Елюент Б: 0,05 % розчин трифтороцтової кислоти в ацетонітрилі. Вміст апігеніну в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (%) обчислюється за наступною формулою: X 45 Елюент А, % 95 95  60 60  50 50 95 Aпр * Сст *100 *100 *100 Aпр * mпр * (100  W ) , де Апр - площина піка апігеніну на хроматограмі досліджуваного розчину; Aст - площина піка апігеніну на хроматограмі розчину порівняння апігеніну; Сст- концентрація апігеніну в розчині порівняння апігеніну, г/мл; mпр - наважка досліджуваної суміші, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування розчину порівняння апігеніну: 0,010 г достовірного стандарту апігеніну вміщують в мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють в 50 мл 96 % етилового спирту, доводять 2 UA 76686 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тим же розчинником до мітки та перемішують. 1 мл отриманого розчину вміщують в мірну колбу об'ємом 25 мл, доводять до мітки 96 % етиловим спиртом та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піка апігеніну на хроматограмі розчину порівняння апігеніну. На підставі експериментальних даних для сировини квіток цмину піскового нами рекомендовано наступний граничний вміст апігеніну - не менше 0,12 % в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином. Модельна суміш без вмісту квіток цмину піскового. 5 г рослинної суміші наступного складу: плодів глоду колючого - 1 г, коренів алтею лікарського - 1 г, коренів солодки голої - 1 г, коренів цикорію дикого - 1 г, коренів кульбаби лікарської - 1 г, шишок хмелю - 1 г, трави кропиви собачої - 1 г, листя та квіток глоду - 1 г, трави звіробою - 1г, насіння льону - 1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному обігрівачі протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витяжок до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Екстракт квіток цмину піскового. 1 г квіток цміну піскового вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному обігрівачі протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витяжок до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Хроматограми розчину порівняння апігеніну, екстракту квіток цмину піскового, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту квіток цмину піскового представлені на Фіг. 1, Фіг. 2, Фіг. 3 та Фіг. 4 відповідно. За даних умов аналізу пік апігеніну має час виходу близько 33,3 хвилин (Фіг. 1). На хроматограмах екстракту квіток цмину піскового та досліджуваного розчину присутній пік апігеніну (Фіг. 2 та Фіг. 3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту квіток цмину піскового (Фіг. 4) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять квітки цміну піскового, плоди глоду колючого, корені алтею лікарського, корені солодки голої, корені цикорію дикого, корені кульбаби лікарської, шишки хмелю, трава кропиви собачої, листя та квітки глоду, трава звіробою та насіння льону, присутність та вміст квіток цмину піскового можна визначати за наявністю та кількісним вмістом флавоноїду апігеніну. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини квіток цмину піскового в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять квітки цміну піскового, плоди глоду колючого, корені алтею лікарського, корені солодки голої, корені цикорію дикого, корені кульбаби лікарської, шишки хмелю, трава кропиви собачої, листя та квітки глоду, трава звіробою та насіння льону, за наявністю та вмістом флавоноїду апігеніну як фізіологічно активного компонента, що присутній в квітках цмину піскового. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та корисній моделі наведено в таблиці 2. 3 UA 76686 U Таблиця 2 Характеристика способів стандартизації квіток цмину піскового № п/п Об'єкт Компонент Об'єкт дослідження Метод визначення Метод УФспектрофотометрії. Сума Можливість кількісної Найближчий флавоноїдів в Моносировина квіток цмину 1 стандартизації аналог перерахунку на піскового моносировини квіток ізосаліпурпозид цмину піскового; неспецифічне визначення. Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: квітки цміну Метод ВЕРХ. піскового, плоди глоду Можливість кількісної колючого, корені алтею стандартизації сировини лікарського, корені солодки 2 Корисна модель Апігенін та багатокомпонентних голої, корені цикорію дикого, рослинних сумішей квіток корені кульбаби лікарської, цмину піскового; шишки хмелю, трава кропиви специфічне визначення собачої, листя та квітки глоду, трава звіробою та насіння льону 5 10 15 Перелік посилань: 1. Справочник "Компендиум-2011 - лекарственные препараты"/ Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова. - К.: Морион, 2011. - 2270 С. 2. Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник/ Відп. ред. Гродзінський А. М. - К.: Головна ред. УРЕ, 1989. - С. 544. 3. Sroka Z., Kuta I., Cisowski W., Drys A. Antiradical activity of hydrolyzed and non-hydrolyzed extracts from Helichrysi inflorescentia and its phenolic contents// Z. Naturforsch. С - 2004. - Vol. 59, N 5-6. - P. 363-367. 4. Carneiro C, Amorim J., Cadena S., Noleto G., Di Mascio P., Rocha M., Martinez G. Effect of flavonoids on 2'-deoxyguanosine and DNA oxidation caused by singlet molecular oxygen// Food Chem. Toxicol. - 2010. - Vol. 48. - P. 2380-2387. 5. Sandhar H., Kumar В., Prasher S., Tiwari P., Salhan M., Sharma P. A Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids// Internationale Pharmaceutica Sciencia. - 2011. Vol.1, Iss. 1. - P. 25-41. 6. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье/ МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - С. 400. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб стандартизації квіток цмину піскового (Helichrysum arenarium L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографії), який відрізняється тим, що наявність та вміст квіток цмину піскового в рослинних сумішах, що містять в своєму складі квітки цмину піскового, плоди глоду колючого, корені алтею лікарського, корені солодки голої, корені цикорію дикого, корені кульбаби лікарської, шишки хмелю, траву кропиви собачої, листя та квітки глоду, траву звіробою та насіння льону, визначають шляхом приготування рослинної суміші, її очищенням та хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водно-ацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки за наявністю та вмістом апігеніну, вміст якого повинен бути не менше ніж 0,12 % у перерахунку на висушену сировину. 35 4 UA 76686 U 5 10 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5