5,11,17,23-тетракис[біс(дигідроксифосфорил)метил]калікс[4]арен або його na-сіль як інгібітори полімеризації фібрину

1. 5,11,17,23Тетракис[біс(дигідроксифосфорил)метил]калікс[4]арен формули: 2 3 97011 Винаход стосується галузі органічної хімії та біохімії, а саме синтезу хімічних сполук: 5,11,17,23біс(дигідроксифосфорил)метилкалікс[4]арену (каліксарен С-192) та його натрієвої солі (каліксарен С-145) з формулами: HO O O P P OH HO OH HO HO OH O P OH OH O P HO OH P HO P O HO OH OH HO HO OH O P HO O P HO OH OH OH , O O P P HO OH ONa OH HO HO NaO OH O P OH OH O P NaO OH P P HO P O ONa O HO OH NaO O P OH HO HO O OH C-192 NaO він не проявляє достатньої інгібуючої дії відносно полімеризації фібрину. Відомо, що інгібіторні властивості щодо зсідання фібриногену в плазмі крові мають сполуки карбоксаміди [4]. Однак відсутня інформація про величину їх інгібуючої активності та про стадію зсідання фібриногену, на яку діють ці сполуки. Найбільш близьким аналогом за будовою [5] та за дією [6] до запропонованих сполук є 5,17біс[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропоксикалікс[4]арен (каліксарен С-98) з формулою: OH P O 4 P O C-145 O ONa OH ONa , та застосування їх як специфічних інгібіторів полімеризації фібрину. Виявлені властивості дозволяють їх використання як субстанції для створення антитромботичних препаратів. Синтез та фізико-хімічні властивості каліксарену С-192 та його натрієвої солі (каліскарен С-145), що заявляються, у літературі не описані. Відомо, що очищений природний пептид, виділений з фрагмента D субодиниці 1 фібриногену, який має амінокислотну послідовність Thr-Arg-Trp-Tyr-Ser-Met-Lys-Lys-ThrThr-Met-Lys-Ile-Ile-Pro-Phe-Asn-Arg-Leu-Thr-Ile-GlyGlu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-GlnAla-Gly-Asp-V, є інгібітором полімеризації фібрину [1]. Проте через велику молекулярну масу та високу вартість даний пептид не може розглядатися як основа антитромботичного препарату. Відомо, що інгібітором полімеризації фібрину є синтетичний пептид Gly-Pro-Arg-Pro [2, 3]. Однак HO P P O O OH OH . Інгібіторна активність каліксарену С-98 на полімеризацію фібрину, виявлена за допомогою турбідиметричного аналізу, показала, що значення концентрації каліксарену, при якій процес полімеризації інгібується на 50 % (ІС50), складає -4 1,3-10 М [6], що свідчить про недостатню афінність даної сполуки та не дозволяє розглядати каліксарен С-98 як основу для створення антитромботичних препаратів. В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу створення низькомолекулярної сполуки непептидної природи з ряду каліксаренів, яка була б ефективним інгібітором полімеризації фібрину. Поставлена задача досягається синтезом каліксарену С-192 та його Na-солі (С-145). Каліксарен С-192 отримують послідовною реакцією тетраформілкаліксарену (X) з діізопропілфосфітом в присутності металевого натрію та наступним деалкілуванням отриманого тетрабісфосфонату (Y) за допомогою триметилбромсилану та метанолу. Na-сіль каліксарену С192 (С-145), що заявляється, отримують, шляхом реакції каліксарену С-192 з метилатом натрію при мольному співвідношенні 1:8 в розчині абсолютного метанолу та випарювання розчину в вакуумі при 20 °C. 5 97011 6 iPrO O OH O P P iPrO (iPrO)2P(O)H HO Na O OH iPrO OH OH O P iPrO OiPr iPrO X P OiPr O HO P O iPrO OiPr OH iPrO O OiPr OiPr iPrO OiPr O P OH O O P O 2. MeOH OiPr P O 1. Me3SiBr OiPr Y HO O O P P NaO OH HO OH OH OH O P HO OH P HO P O OH O HO P O HO OH OH HO P O O P P HO HO HO OH O P O 8 NaOH MeOH HO NaO OH O P OH OH O P NaO OH OH HO NaO де: (іРrО)2Р(O)Н - діізопропілфосфіт; iPr - ізопропільні групи; Me3SiBr - триметилбромсилан; МеОН - метиловий спирт. Каліксарен С-192, що заявляється, за даними турбідиметричного аналізу специфічно гальмує зсідання фібриногену під дією тромбіну. В присутності каліксарену С-192 значення ІС50 -6 складає 0,510 М. Аналіз отриманих даних показує, що каліксарен С-192, який заявляється як інгібітор полімеризації фібрину, є на 2 порядки ефективнішим порівняно з найближчим аналогом каліксареном С-98 [5, 6]. Про високу специфічність інгібування каліксарену С-192, що заявляється, свідчить те, що 50 %-не інгібування полімеризації фібрину досягається при молярному співвідношенні каліксарену С-192 до фібриногену як 1,7: 1. Зсідання фібриногену під дією тромбіну включає дві реакції: 1) перетворення фібриногену на фібрин під дією тромбіну та 2) полімеризацію мономерного фібрину з утворенням його тривимірної сітки, яка є каркасом тромбу. Інгібіторна дія каліксарену С-192, що заявляється, проявляється не лише при зсіданні фібриногену -6 під дією тромбіну (ІС50=0,510 М), а й при полімеризації мономерного фібрину (ІС50=0,510 6 М). Таким чином, інгібуюча дія каліксарену С-192, що заявляється, здійснюється за рахунок його взаємодії з фібрином. Для Na-солі каліксарену С-192 (каліксарен С145), що заявляється, виявлено, що значення ІС50 -6 складає 2,510 М, що свідчить про високу інгібіторну дію в процесі полімеризації фібрину. Крім того, завдяки електронейтральності молекули P P O ONa O HO P O HO ONa OH OH C-192 ONa OH P O OH ONa C-145 каліксарену-145, він може бути більш придатним для введення до живого організму як інгібітор полімеризації фібрину, а, значить, і процесу тромбоутворення. Достовірність представлених даних підтверджується тим, що при порівняльному дослідженні відомого інгібітору полімеризації фібрину - синтетичного пептиду Gly-Pro-Arg-Pro ми експериментально отримали практично таке ж -4 значення ІС50 (0,510 М), яке отримували й інші -4 автори (0,8510 М) [2]. На сьогоднішній день ще не описана жодна низькомолекулярна сполука непептидної природи з такою великою інгібіторною активністю відносно полімеризації фібрину, яку виявляють каліксарени С-192 та С-145, що заявляються. Одержані дані свідчать про те, що каліксарени С-192 та С-145, що заявляються, гальмують зсідання фібриногену не за рахунок інгібування активного центру тромбіну чи його зв'язування з фібриногеном, а за рахунок інгібування процесу полімеризації фібрину. В присутності каліксарену С-192, що заявляється, в середовищі полімеризації фібрину, як показано на Фіг.1, суттєво зменшується максимальна швидкість полімеризації Vmax, збільшується лаг-період () і зменшується максимальна мутність фібринового згустку. В присутності натрієвої солі каліксарену С-192 (каліксарену С-145, що заявляється) в середовищі полімеризації фібрину ААВВ, як показано на Фіг.2, суттєво зменшується максимальна швидкість полімеризації фібрину (Vmax), максимальна мутність фібринового згустку (h) та збільшується лаг-період (). 7 За допомогою трансмісійної електронної мікроскопії, проведеної на мікроскопі Н-600 ("Hitachi", Japan) при збільшенні 50000, встановлено, що каліксарен С-192, що заявляється, інгібує першу стадію полімеризації фібрину - побудову протофібрил з мономерних молекул. Для з'ясування можливості використання каліксаренів як антитромботичних препаратів досліджено інгібіторний ефект каліксарену С-192, що заявляється, відносно зсідання крові. Додавання каліксарену С-192, що заявляється, до плазми крові, як показано на Фіг.3, приводить до збільшення як протромбінового часу, так і активованого часткового тромбопластинового часу (АЧТЧ). Концентрація каліксарену, при якій протромбінове відношення збільшується в два -5 рази, в протромбіновому тесті дорівнює 7,010 М, -5 у АЧТЧ тесті - 1,710 М (Фіг.3) [6]. Таким чином, присутність компонентів плазми крові не впливає на інгібіторний ефект каліксарену С-192, що заявляється, відносно полімеризації фібрину. Тому каліксарени С-192 і С-145 рекомендовано використовувати як суспензію для створення антитромботичних препаратів для живих організмів. Попередні дослідження, проведені на здорових статевозрілих мишах за методом [8], показали, що каліксарен С-192, який заявляється, є середньо токсичною сполукою (LD50 становить 780мг/кг при пероральному введенні). Винахід ілюструється наступними прикладами. Приклад 1. Отримання 5,11,17,23тетракис[біс(діізопропоксифосфорил)метил]калікс[4]арену (Y) В 15мл діізопропілфосфіту розчиняють металічний натрій (0,69г, 29ммоль), до отриманого таким чином розчину додають тетраформілкаліксарен (X) (1г, 1,86ммоль), реакційну масу перемішують при температурі 20 °C протягом 48 год., потім реакційну масу виливають у воду (100мл) і екстрагують продукт реакції хлороформом (3×50мл). Залишок після випарювання хлороформу висушують у вакуумі при 0,05мм рт.ст. протягом 10год. при температурі 100 °C. Утворену маслоподібну речовину промивають гексаном. Отримують 3г тетрабісфосфонату (Y) у вигляді світло-коричневих кристалів (вихід близько 95 %). 1 Тпл. 65-67 °C. Н ЯМР (300МГц, СD3ОD): , м.ч.: 7,18 (с, 8Н, РhОH); 4,85 (м, 8Н, ОСH); 4,38 (м, 8Н, ОСH); 3,95 (уш. с, 8Н, АrСH2); 3,45 (т, 4Н, Jрн=25Гц, РСH); 1,35, 1,25, 1,18, 0,95 (д, 30Н+30Н+18Н+18Н); 31 P ЯМР  19,5. Приклад 2. Отримання 5,11,17,23тетракис[біс(дигідроксифосфорил)метил]калікс[4]арену (каліксарену С-192) До розчину тетрабісфосфонату (Y) (1г, 0,55ммоль) у сухому хлороформі (15мл) додають триметилбромосилан (5,46г, 35ммоль). Реакційну суміш перемішують при температурі 20 °C протягом 48год. Потім розчинник випарюють і залишок розчиняють в абсолютному метанолі (15мл). Реакційну суміш перемішують при температурі 50 °C протягом 2год., метанол випарюють при 97011 8 зниженому тиску. Залишок висушують у вакуумі 0,05мм рт.ст. протягом 10год. Отримують 0,59г каліксарену С-192 у вигляді світло-коричневих кристалів (вихід 98 %). 1 Тпл.>200 °C (розкл.). Н ЯМР (300МГц, CD3OD): 7,45 (с, 8Н, РhОH); 4,25 (д, 4Н, Jнн=13Гц, АrСH2); 3,65 (д, 4Н, Jнн=13Гц, АrСH2); 3,55 (т, 4Н; Jрн=25Гц, 31 РСH); Р ЯМР  16,5. Приклад 3. Отримання октанатрієвої солі 5,11,17,23-тетракис[біс(дигідроксифосфорил)метил]калікс[4]арену (каліксарену С-145) До наважки каліксарену С-192 (0,2г 0.179ммоль) в абсолютному метанолі (5 мл) додають розчин метилату натрію (77мг, 1,428ммоль) в розчині абсолютного метанолу (5мл). Реакційну суміш перемішують одну годину при кімнатній температурі, метанол упарюють у вакуумі при кімнатній температурі. Отримують 230мг солі С145 у вигляді білих кристалів (вихід 99,6 %). 31 Тпл.>100 °C (розкл.). Р ЯМР  14,5. Приклад 4. Турбідиметричний аналіз полімеризації фібрину дезААВВ та фібрину в системі фібриноген+тромбін в присутності та за відсутності каліксаренів С-192 та С-145, що заявляються. Фібриноген одержують з плазми крові людини [9], препарат фібрину дезААВВ в 0,02М оцтовій кислоті одержують в реакції фібриноген+тромбін [10], полімеризацію фібрину дезААВВ та фібрину проводять в системі фібриноген+тромбін [7]. В досліді в системі фібриноген+тромбін в середовище полімеризації вносять каліксарен С-192, що заявляється, в концентрації 0,5мкМ. Значення максимальної швидкості полімеризації фібрину (Vmax) при цьому значно зменшується, суттєво збільшується лаг-період () і зменшується максимальна мутність фібринового згустку (h) (Фіг.1). При дослідженні впливу каліксарену С-192, що заявляється, на полімеризацію фібрину дезААВВ його вносять в середовище полімеризації в концентрації 0,5мкМ. При дослідженні впливу каліксарену С-145, що заявляється, в системі фібрину дезААВВ його вносять в середовище полімеризації в концентрації 0,5мкМ При цьому теж відбувається зменшення максимальної швидкості полімеризації фібрину (Vmax), суттєво збільшується лаг-період () і зменшується максимальна мутність фібринового згустку (h) (Фіг.2). Приклад 5. Дослідження полімеризації фібрину дезAABB в системі фібриноген+тромбін за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії в присутності та за відсутності каліксаренів С-192 та С-145, що заявляються. Зразки фібрину дезAABB, що полімеризується в присутності та за відсутності каліксарену С-192, що заявляється, відбирають з реакційного середовища в різні проміжки часу, поміщають на решітку, вкриту вуглецем, де витримують 2хв., а потім поміщають в 1 %-й розчин уранілацетату, де витримують 1хв., та досліджують з використанням електронного мікроскопа Н-600 ("Hitachi", Japan) при збільшенні 50000. Аналіз отриманих електронних мікрофотографій фібрину, що утворився в системі фібриноген+тромбін через різні проміжки 9 часу після початку полімеризаційного процесу за відсутності каліксарену С-192 (Фіг.4, А, В) та в присутності каліксарену С-192 (Фіг.4, С, D), показує, що каліксарен С-192, який заявляється, інгібує першу стадію полімеризації фібрину - побудову протофібрил з мономерних молекул. Приклад 6. Визначення протромбінового часу та активованого часткового тромбопластинового часу при зсіданні плазми крові людини у присутності каліксарену С-192. Вплив каліксарену С-192 на зсідання плазми крові людини проводять за допомогою коагулометра СТ 2410 ("Solar" Білорусь). Використовують наступні реактиви ("НПО Ренам", Росія): контрольна плазма крові з нормальним рівнем системи гемостазу; "Ренампластин" - стандартизований за міжнародним індексом чутливості реагент для визначення протромбінового часу, який відображає активацію зовнішнього шляху системи зсідання крові; АЧТЧ-тест - для визначення активованого часткового тромбопластинового часу, який відображає активацію внутрішнього шляху системи зсідання крові. За допомогою коагулометра вимірюють протромбінове відношення, яке розраховують за формулою: ПВ=ПЧд/ПЧк (1), де: ПЧд - протромбіновий час в плазмі крові, що досліджується, ПЧк - протромбіновий час в контрольній плазмі. Протромбіновий час визначають за методом [11], в досліді окрім контрольної плазми крові в кювети вносять розчинений каліксарен С-192 в концентрації 50мкМ. Розраховане за формулою (1) протромбінове відношення при цьому дорівнює 1,6. Активований частково тромбопластиновий час визначають за методом [11]. В АЧТЧ-тесті порівнюють час утворення фібринового згустку контрольних зразків - чиста плазма крові з досліджуваними зразками - плазми крові, в якій розчинено каліксарен С-192 в концентрації 50мкМ. Розраховане за формулою (1) протромбінове відношення при цьому дорівнює 5,4. Отже, отримані дані протромбінового відношення в двох різних методах (в методі визначення протромбінового часу - 1,6 та в АЧТЧтесті - 5,4) свідчить про те, що інгібування полімеризації фібрину каліксареном С-192 відбувається й в присутності всіх компонентів плазми крові. Цей факт дає можливість розглядати 97011 10 цю речовину як основу для створення антитромботичного препарату. Таким чином, двома незалежними методами показано, що каліксарен С-192 та його натрієва сіль - каліксарен С-145, що заявляються, є високоспецифічними інгібіторами полімеризації фібрину та зсідання плазми крові людини. Полімеризація фібрину приводть до утворення тривимірної сітки фібрину - каркасу тромбу. Тому каліксарени, що заявляються, мають призначення як субстанції для високоефективних антитромботичних препаратів. Джерела інформації: 1. Пат. 4455290 US. June 19, 1984. 2. Pandya В.V., Gabriel J.L., O'Brien J., Budzynski A.Z. Polymerization site in the beta chain of fibrin: mapping of the В beta 1-55 sequence // Biochemistry.-1991.-30, 1.-P. 162-168. 3. Laudano A.P., Doolittle R.F. Synthetic peptide derivatives that bind to fibrinogen and prevent the polymerization of fibrin monomers. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1978. - V. 75. - P.3085-3089. 4. Заявка 94032284/04 RU, 07.09.1994. 5. Vovk A.I., Kalchenko V.I., Cherenok S.A., Kukhar V.P., Muzychka O.V., Lozynsky M.О. Calix[4]arene methylenebisphosphonic acids as calf intestine alkaline phosphatase inhibitors // Org. Biomol. Chem.-2004. -Vol.2.-P.3162-3166. 6. Гриценко П.Г., Луговськой Е.В., Кошель Т.А., Черенок С.О., Ющенко О.А., Чернишов В.І., Кальченко В.І., Комісаренко С.В. Вплив каліксаренметиленбісфосфонових кислот на полімеризацію фібрину. // Доповіді Національної академії наук України.-2010.-1.-С.175-179. 7. Lugovskoi Е.V., Makogonenko Е.M., Chudnovets V.S., Derzskaya S.G., Gogolinsikaja G.K., Kolesnikova I.N., Bukhanevich A.M., Komisarenko S.V. The study of fibrin polymerization with monoclonal antibodies // Biomedical Science-1991.-2.-249-296. 8. Беленький M.Л. Элементы количественной оценки фармокологического эффекта. Государственное издание медицинской литературы. Ленинград.-1963.-148с. 9. Varetskaya Т.V. Microheterogeneity of fibrinogen. Cryofibrinogen // Укр. біохім. журн.-1960.-32. Р.13-24. 10. Belitser V.A., Varetskaja Т.V., Malneva G.V. Fibrinogen-fibrin interaction // Biochim. Biophys. Acta.-1968.-154. - P. 376-380. 11. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза // М.: Ньюдиамед.-2001.-292с. 11 Комп’ютерна верстка Н. Лисенко 97011 Підписне 12 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601