Спосіб відбору трансгенних рослин із підвищеним рівнем стійкості до водного стресу

Реферат: Спосіб відбору трансгенних рослин із підвищеним рівнем стійкості до водного стресу включає виділення трансформантів, отриманих в результаті Agrobacterium-опосередкoвaнoї трансформації in vitro та/або in planta, із підвищеним рівнем проліну та стійкістю до осмотичних стресів. При цьому масовий скринінг здійснюють in vitro на середовищі, до якого вносять летальні для звичайних рослин дози маніту, а потім життєздатні варіанти аналізують за рівнем проліну та молекулярно-генетичними маркерами. UA 97229 U (54) СПОСІБ ВІДБОРУ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН ІЗ ПІДВИЩЕНИМ РІВНЕМ СТІЙКОСТІ ДО ВОДНОГО СТРЕСУ UA 97229 U UA 97229 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до генетичної інженерії, та може бути застосована при одержанні нових форм рослин шляхом Agrobacterium - опосередкованої трансформації in vitro та/або in planta. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення та спрощення процедури масового скринінгу in vitro біотехнологічних рослин. В результаті створюються умови для прискорення відбору трансгенних рослин з підвищеним рівнем стійкості до водного дефіциту. Метод Agrobacterium - опосередкованої трансформації in vitro та/або in planta полягає у перенесенні в клітини та інтеграції в геном реципієнтних рослин, створених векторних конструкцій із подальшим скринінгом значної кількості отриманих варіантів для виділення форм з новими бажаними характеристиками. Загалом метод включає використання конструкцій, до складу яких входять цільовий ген (ген інтересу) і маркерний (селективний) ген. Після здійснення процедури трансформації та отримання покоління Т0 відбір індивідуальних трансформованих рослин у загальному масиві Т0 проводять в два етапи [1]. Першим етапом є селекція за маркерним геном (ознакою). Здебільшого - це гени npt II, Gus тощо. На другому етапі ведуть тестування експресії цільової ознаки у варіантах, відібраних на першому етапі. Застосування конструкції із маркерними генами подовжує алгоритм відбору нових форм, з одного боку, та посилює негативний тиск на довкілля, з другого. Тому в останній час починають залучати до генетичної трансформації конструкції лише з цільовим геном, а тестування здійснюють створюючи модельні системи відбору. Патент Росії (RU 2324736) "Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина": застосовується конструкція, яка сприяє підвищеному синтезу вільного проліну; трансгенні форми відбираються in vitro на середовищі із додаванням 200 мМ NaCl [2]. Патент Росії (RU 2324737) "Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина": застосовується конструкція, яка сприяє підвищенню рівня проліну за рахунок репресії ферменту катаболізму цієї амінокислоти; трансгенні форми відбирають in vitro на середовищі із додаванням 250 мМ NaCl [3]. Патент Росії (RU 2350653) "Способы повышения толерантности к абиотическому стрессу и / или биомассы у растений и получаемые таким образом растения". В цьому разі трансгенні форми арабідопсису виділяють, обприскуючи рослини 100 мМ розчином NaCl [4]. Недоліком вказаних методів є вибрана концентрація провокуючого стресору (NaCl). У випадку Agrobacterium - опосередкованої трансформації in vitro, коли отримується незначна кількість регенерантів, можливий індивідуальний аналіз кожного і підбір селективної концентрації стресового чинника. Однак, нелетальні концентрації не дають повної гарантії відбору трансгенних форм, особливо при трансформації in planta, яка дає можливість масового отримання покоління Т0. Використання летальних концентрацій стресового чинника дозволить гарантовано відібрати трансгенні варіанти. Це має особливе значення у разі необхідності перевірити значну кількість варіантів Т0, наприклад зернівок у колосі, початку або сім'янок у кошику та інтактних рослин. Поставлена задача вирішується тим, що створюється система in vitro для масового скринінгу, яка моделює водний дефіцит. На селективному середовищі із додаванням летальної для звичайних рослин дози маніту відбирають життєздатні проростки. Після процедури відбору життєздатні варіанти оцінюють за рівнем проліну та молекулярно-генетичними маркерами. Трансгенні рослини характеризуються підвищеним рівнем стійкості до водного дефіциту. Приклад реалізації корисної моделі При розробці способу відбирали трансгенні рослини кукурудзи (трансформація in planta) і соняшника (трансформація in vitro). В обох випадках використовували штам Agrobacterium tumifaciens LBA 4404, що несе векторну конструкцію рВі2Е із цільовим геном - дволанцюговим РНК супресором гена проліндегідрогенази (ПДГ). ПДГ є ферментом, який відповідає за катаболізм проліну - амінокислоти, яка захищає рослини при абіотичних і біотичних стресах довкілля. Про акумуляцію проліну під час посухи відзначається у літературі [5]. Для створення системи добору in vitro визначали селективну (летальну) концентрацію маніту (Фіг. 1 - схема встановлення селективної концентрації маніту для добору трансформантів соняшника). Для кукурудзи і соняшника вона становила 0,8 М. Цю дозу маніту застосовували при відборі зернівок або сім'янок (Фіг. 2 - відбір транформантів кукурудзи в умовах дії селективної (летальної) концентрації маніту). У відібраних трансформантів впродовж культивування вимірювали вміст проліну, який за нормальних умов в тканинах рослин варіював у широких межах, проте за абсолютною величиною не перевищував 20,56±2,04 мг % / сиру масу. За дії водного стресу вміст проліну зростав (Фіг. 3 - вміст вільного проліну у рослин соняшника і кукурудзи на 21-у добу дії модельованого водного стресу). 1 UA 97229 U 5 10 15 20 25 30 Флуктуації рівня проліну - це звичайне явище, яке може бути обумовлене фізіологічним статусом тканин, віком рослини, часом проведення вимірювання [6]. Відібрані рослини Т0, які відзначалися підвищеним рівнем проліну при культивуванні за умов довготривалого модельованого осмотичного стресу, були перенесені в польові умови. ДНК таких рослин піддавали молекулярно-генетичному аналізу. ПЛР-аналіз із використанням праймерів до першого екзону і інтрону дволанцюгового РНКсупресора гена проліндегідрогенази 1 арабідопсиса показав наявність цільового гена у тотальній ДНК листків стійких до летальних концентрацій маніту рослин (Фіг. 4 електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК соняшника, де № 1, 2, 4, 7 - ДНК трансформантів соняшника, відібраних на середовищі з летальною концентрацією маніту; № 3 - ДНК не трансгенної рослини соняшника; № 8 - позитивний контроль; № 9 - негативний контроль; Μ маркер молекулярної маси GeneRuler™ DNA Ladder Mix, Fermentas). Джерела інформації:: 1. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук - М.: Мир, 1984.- 480 с. 2. Патент № 2324737, Российская Федерация, МПК C12N 015/82 "Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина" / Титов С.Е., Кочетов А.В., Колодяжная Я.С. и др.; Заявитель и патентообладатель Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) № 2006136956/13; заявл. 18.10.2006; опубл. 20.05.2008. 3. Патент № 2324736, Российская Федерация, МПК C12N 015/82 "Способ получения трансгенных растений табака с повышенным содержанием пролина" / Титов С.Е., Герасимова С.В., Кочетов А.В. и др.; Заявитель и патентообладатель Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (СО РАН) - № 2006136954/13; заявл. 18.10.2006; опубл. 20.05.2008. 4. Патент № 2350653, Российская Федерация, МПК С12N 5/14, С12N 15/82, С12N 15/29 "Способы повышения толерантности к абиотическому стрессу и/или биомассы у растений и получаемые таким образом растения" Карчи X., Мейсснер Р., Ронен Д., Голан Е.; Заявитель и патентообладатель Эводжин ЛТД; - № 2005140106/13. 5. Сергеева Л.Е. Клеточная селекция с ионами тяжелых металлов для получения генотипов растений с комплексной устойчивостью к абиотическим стрессам. - К.: Логос, 2013. - 211 с. 6. Kavi Kishor P.В., Sangam S., Amrutha R.N. et al. Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implication in plant growth and abiotic stress tolerance // Current Sci. 2005. - V. 88, №3. - P. 424-438. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб відбору трансгенних рослин із підвищеним рівнем стійкості до водного стресу, що включає виділення трансформантів, отриманих в результаті Agrobacterium-опосередкoвaнoї трансформації in vitro та/або in planta, із підвищеним рівнем проліну та стійкістю до осмотичних стресів, який відрізняється тим, що масовий скринінг здійснюють in vitro на середовищі, до якого вносять летальні для звичайних рослин дози маніту, а потім життєздатні варіанти аналізують за рівнем проліну та молекулярно-генетичними маркерами. 2 UA 97229 U 3 UA 97229 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4