Спосіб стандартизації вакцин проти злоякісної пухлинної хвороби (рак)

Реферат: Винахід належить до ветеринарної медицини, а саме до імунології. Спосіб стандартизації вакцин проти злоякісної пухлинної хвороби включає використання противірусних вакцин за винаходом як моделей щодо розробки методики стандартизації протипухлинних вакцин. UA 99550 C2 (12) UA 99550 C2 UA 99550 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до гуманної та ветеринарної медицини, а більш конкретно до імунології, яка передбачає обов'язкове проведення оцінки вакцин за показниками імуногенності. З відкриттям вірусу лейкозу великої рогатої худоби - збудника злоякісної пухлинної хвороби [1], в доступній літературі появились повідомлення про розробку проти лейкозних вакцин, виготовлених з різних тилів антигенів: інактивований вірус лейкозу, глюкопротеїди вірусу, лейкоцити хворих на лейкоз корів, імуностимулюючі специфічні комплекси крові хворих на лейкоз тварин тощо. Однак, запропоновані вакцини не знайшли широкого впровадження у ветеринарній практиці через складність технологій виготовлення та застосування і низькі імуногенні властивості. Наприклад, Нагаєва Л.І. та співавт. [2] запропонували інактивовану вакцину виготовлену з лімфоцитів хворих на лейкоз корів, якою дозволялось щеплювати тільки працівникам приватної фірми "Лейкопол". Застосування вакцини в неблагополучних щодо лейкозу ВРХ господарствах давало неоднозначні результати, але вони не відрізнялись від результатів отриманих після проведення заходів за вимогами чинної інструкції по боротьбі з лейкозом, де не застосовується вакцина [3]. За технологією виготовлення вірус-вакцини Cervarix [4], яка використовується для профілактики захворювання на рак шийки матки у жінок, спричинених вірусами ВПЛ - 16 та ВПЛ - 18, рівень імуногенності вакцини визначають за допомогою тест системи ELISA. Показники рівня імунітету отримані в тест-системі прирівнюються до показників нейтралізації псевдовіріонів в організмі. Такий підхід до визначення імуногенності є опосередкованим і не завжди корелює з її захисними властивостями in vivo. Крім того, для проведення тесту ELISA необхідно мати дороге за вартістю обладнання, високо кваліфікованих фахівців та спеціальні дорогі реактиви. Щоб спростити проведення досліджень на імуногенність протипухлинних вакцин, ми пропонуємо простий і інформативний метод з використанням лабораторних тварин, наприклад морських свинок. Досліди проводились із застосуванням протипухлинних вакцин "Лейкозав" та "Лейкозав - Н". Свинок імунізували однією з вакцин, визначали напругу поствакцинального імунітету, а потім 3 заражали вірусовмісним матеріалом, (0,5 см крові корови в гематологічній стадії розвитку лейкозу). Встановлено, що тварини, у яких рівень специфічних противірусних антитіл в сироватці крові становить 1:2-1:8 (за РІД проти стандартного лейкозного антигену) були стійкими до зараження десятками ІД100 (ІД100 становить 0,0005 см крові хворої на лейкоз тварини в гематологічній стадії розвитку хвороби). Висока імуногенність вакцини була підтверджена в дослідах на вівцях. Нами вперше розроблена технологія визначення імуногенних властивостей протиракових вакцин за рівнем (титр) специфічних противірусних антитіл в сироватці крові, щеплених вакциною морських свинок. В досліді були використані вакцини Лейкозав та Лейкозав - Н, якими щеплювали піддослідних морських свинок і овець. Методика визначення. Відбирають п'ять клінічно здорових морських свинок масою 350-400 г (три піддослідні, дві 3 контрольні). Трьом піддослідним свинкам вводять в подушечки лівих задніх лапок по 0,3 см вакцини, дотримуючись правил асептики й антисептики. Контрольним свинкам вводять фізіологічний розчин в такій же дозі. 3 Через п'ять днів вакцину вводять по 0,3 см в подушечки правих задніх лапок. Контрольним тваринам вводять фізіологічний розчин. Через наступних п'ять днів кожній піддослідній свинці вводять підшкірно в ділянці живота по 0,5 см вакцини, а контрольним свинкам фізіологічний розчин. Через 10 днів після підшкірного введення вакцини від усіх свинок відбирають по 5 см' крові і залишають для відстоювання сироватки. Готують чотири ряди по 5 чистих пробірок. Починаючи з другої в кожну пробірку вносять по 3 3 1 см фізіологічного розчину. В першу і другу пробірки відповідного ряду вносять по 1 см нативної сироватки крові свинки. Після внесення сироватки в другу пробірку отримують розведення 1:2. Один сантиметр вмісту другої пробірки вносять в третю пробірку і отримують 3 розведення 1:4, з третьої ~ в четверту - 1:8, з четвертої - в п'яту - 1:16, з п'ятої 1 см виливають геть. Реакцію імунодифузії в агаровому гелі ставлять за методикою прийнятою у вірусології [5]. У 3 стерильну чашку Петрі наливають 15 см 1-1,5 % розчину агар - гель, який після охолодження залишається прозорим. В агаровому гелі чашки вирізають спеціальним штампом "три зірки" по 6 лунок в кожній. Видаляють агарові пробки і на дно кожної лунки вносять за допомогою пастерівської піпетки з 1 UA 99550 C2 5 10 15 20 тонко витягнутим кінцем краплю розплавленого агару, щоб загерметизувати дно і запобігти підтіканню компонентів реакції під агар. Після охолодження крапель агару в лунках, ставлять РІД проти стандартного антигену з діагностичного лейкозного набору. Сироватки досліджують в нативному вигляді та з кожним розведенням. Компоненти реакції вносять в лунки автоматичною піпеткою із змінним наконечником 3 об'ємом 0,4 см . На кожний компонент реакції беруть окремий стерильний наконечник. В центральну лунку зірки вносять стандартний лейкозний антиген. У лунку на 12 годин позитивну сироватку з лейкозного набору. В лунку на 6 годин - сироватку крові від свинки з контрольної групи. Накривку кожної чашки застилають шматком фільтрувального паперу для збору конденсату. Всі заправлені чашки ставлять у вологу баню (ексикатор з водою на дні) на 72 години. Облік реакції починається з огляду контрольних чашок на наявність лінії преципітації між центральною лункою (антиген) і лункою з позитивною сироваткою, з лейкозного набору. Після переконання в наявності ліній преципітації в контрольній чашці починають обстеження лунок в чашці з дослідними сироватками. Імуногенність вакцини визначають за наявністю ліній преципітації між лункою з антигеном і досліджуваними розведеннями сироватки крові (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). Під час виготовлення протипухлинних вакцин можуть бути окремі порушення виробничого характеру, а отримані серії неоднакові за своїми імуногенними властивостями. Щоб запобігти цьому і не допустити таку вакцину на ринок, ми пропонуємо методику стандартизації протипухлинних вакцин за здатністю формувати поствакцинальний імунітет відповідної напруги. Результати таких досліджень подані в таблиці 1. Таблиця 1 Результати досліджень за РІД сироваток крові морських свинок, щеплених вакциною Лейкозав. № тварини 1 2 3 4 5 Дослідження сироватки крові за РІД розведення нативна 1:2 1:4 1:8 Дослід + + + + + + + Контроль + + 1:16 Примітки: (+) - позитивна РІД (-) - негативна РІД 25 З даних таблиці 1 видно, що протипухлинна вакцина Лейкозав формує специфічний противірусний імунітет з титром преципітуючих антитіл переважно 1:2-1:8 в тест системі за РІД. Такі ж результати було отримано при дослідженні вакцини для імунізації людей (Лейкозав-Н) таблиця 2. 2 UA 99550 C2 Таблиця 2 Підсумки визначення в РІД напруги антитіл (титр) в сироватці крові морських свинок, щеплених вакциною Лейкозав-Н № тварини (дослід, контроль) нативна 1 2 3 + + + 4 6 Дослідження сироватки крові за РІД розведення 1:2 1:4 1:8 Дослід + + + + + + + + Контроль 1:16 (+) - позитивна (-) - негативна 5 З даних табл. 1 та 2 видно, що протипухлинні вакцини для великої рогатої худоби (Лейкозав) та для людей (Лейкозав - Н) мають достатні імуногенні властивості, щоб захистити дослідних тварин від експериментального зараження вірусовмісним матеріалом. Це підтверджено в гострому досліді із зараженням імунних овець десятками ІД 100 3 вірусовмісного матеріалу (ІД100 становлять 0,0005 см "хворої крові") таблиця 3. Таблиця 3 Стійкість до зараження вірусом лейкозу типу С, щеплених вакциною Лейкозав овець Досліджено Інв. № тварини 0135 0596 0082 13896 10 15 20 25 Оброблено Досліджено лабораторією Лейкоцити, тис./мкл перед початком РІД заражено кров'ю досліду вакцина, (60 тис. лейкоцитів, Розведення сироватки гематологічні 3 РІД см 86 % лімфоцитів крові лейкоцити, 3 см тис./мкл нативна 1:2 1:4 1:8 6,600 2+2 0,5 + + + +> 10,600 6,200 2+2 0,5 + + + +> 6,400 8,800 2+2 0,5 не досліджувались контроль 5,400 0,5 + 4+ +> 12,00-92 % Дані табл. 3 підтверджують, що після щеплення вакциною в організмі овець формується противірусний імунітет з титром специфічних антитіл 1:2-1:8, який захищає тварин від експериментального зараження кров'ю гематологічно хворої корови. Щоб підтвердити інфекційність (заразність) вірусовмісного матеріалу паралельно з піддослідними тваринами було заражено інтактну вівцю № 13896, яка захворіла. Вівці щеплені вакциною і заражені "хворою" кров'ю були в досліді два роки і не захворіли на лейкоз. Висновки 1. Інактивована вакцина проти злоякісної пухлинної хвороби (рак) тварин (Лейкозав) і людей (Лейкозав-Н) формує в організмі поствакцинальний противірусний імунітет, який захищає їх від експериментального та спонтанного зараження. 2. Протипухлинні вакцини, які застосовується у ветеринарній та гуманній медицині для підшкірного щеплення повинні формувати у морських свинок поствакцинальний імунітет з титром специфічних антитіл 1:2-1:8 за РІД. Джерела інформації: 1. Miller J.M., Miller Y.D., Olson С, Yilteffe K.Y. Vims-Like particles in phitohem-agglutinin simulated Lymphocyte cultures with reference to bovine Limfosarcoma // J. Natl. Cancer Inst.-1969.43. - p. 1297-1305. 3 UA 99550 C2 5 10 15 2. Нагаєва Л. Вірусогенетичне обґрунтування вакцини проти лейкозу рогатої худоби та її роль у системі оздоровчих заходів/Нагаєві Л., Вербицький П., Горжеєв В.//Вет. мед. України.2001.-№ 7. - С. 14-15. 3. Інструкція по профілактиці та оздоровленню великої рогатої худоби від лейкозу. - Київ. № 15-15/220-28.09.1992. ТМ 4. Церварикс - вакцина для профилактики заболеваний, вызываемых папиломавирусной инфекцией//тЬіт1: fila//F: Cervarix.mht. 5. Метод иммунодифузии//Руководство по ветеринарной вирусологии. - М.-1966.-С. 307-308. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб стандартизації вакцин проти злоякісної пухлинної хвороби (рак), що включає опосередковано оцінку напруги поствакцинального імунітету за показниками нейтралізації псевдовіріонів в тест-системі ELISA, який відрізняється тим, що наявність та напругу поствакцинального імунітету, встановлюють, як показник стандарту, шляхом імунізації морських свинок вакциною з наступним визначенням в сироватці їх крові специфічних противірусних антитіл в титрі 1:2-1:8 за РІД проти стандартного лейкозного антигену. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4