Спосіб кількісного визначення оротової кислоти в натуральному молоці

Реферат: Винахід належить до аналітичної хімії, зокрема до способу визначення оротової кислоти в молоці. Запропонований спосіб люмінесцентного визначення оротової кислоти у молоці оснований на використанні твердофазної сенсибілізованої люмінесценції іона тербію(III) в комплексі з оротовою кислотою, яка реєструється у фазі сорбенту на пластинці для тонкошарової хроматографії. Інтенсивність люмінесценції сорбату, яка зростає у присутності неіоногенної речовини - тритону Х-100, реєструють при рН 6,8-7,2. Вміст оротової кислоти визначають за градуювальним графіком. Запропонований спосіб забезпечує підвищення селективності визначення і дозволяє знизити межу визначення оротової кислоти. UA 99549 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до аналітичної хімії, зокрема до способу визначення попередника піримідинових нуклеотидів - оротової кислоти у молоці. Відомий спосіб визначення оротової кислоти методом катодної інверсійної вольтамперометрії з ртутним електродом "висяча крапля" [Calvo L., Rodziguez Y., Vinagre F., Sanchez A., Fresenius Z. Anal. Chem., 1988, V. 330. №2, P. 146-148]. Спосіб передбачає попереднє адсорбційне накопичення оротової кислоти на краплинному Hg-електроді після пропускання через розчин азоту. Методика розроблена для чистих розчинів оротової кислоти і навряд чи відбуватиметься накопичення оротової кислоти на електроді при наявності в розчині інших органічних компонентів. Крім того, спосіб передбачає використання токсичної ртуті та газоподібного азоту, що ускладнює виконання аналізу. Найбільш близьким до заявленого винаходу є спосіб визначення оротової кислоти (див. Кравченко Т.Б., Бельтюкова С.В., Грицай Т.Л., Полуэктов Н.С. Люминесцентные свойства оротата тербия и использование его в анализе. Укр. хим. журнал.-1982, т. 48, № 9, с. 972-975), оснований на реєстрації сенсибілізованої люмінесценції іона тербію(III) у присутності оротової кислоти. Визначення проводять наступним чином: у пробирку додають 1 мл розчину з вмістом -2 оротової кислоти 0,5-15 мкг, додають 1 мл розчину хлориду тербію (2·10 моль/л), додають 5 мл диметилсульфоксиду, 0,4 мл 40 %-го водного розчину уротропіну і дистильованої води до 10 мл. Через 5 хв. реєструють інтенсивність люмінесценції розчину при 545 нм; вміст оротової кислоти визначають за допомогою калібрувального графіку або методом добавок. Дане рішення вибране прототипом. Прототип і винахід, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - відбір проби, - взаємодія проби з хімічним реагентом, - вимірювання аналітичного сигналу. Проте спосіб, запропонований за прототипом, передбачає аналіз чистих розчинів оротової кислоти. Він не є селективним, тому що при аналізі харчових продуктів, що містять різні органічні компоненти, на інтенсивність люмінесценції іону Тb(III) впливають амінокислоти, піримідинові основи і інші складові. В результаті цього результати визначення будуть недостовірні. Спосіб передбачає також використання органічного розчинника диметилсульфоксиду. Крім того, межа виявлення оротової кислоти, передбачена цим методом, -6 недостатньо низька. Вона складає 5·10 моль/л. В основу винаходу поставлена задача створити спосіб, в якому за рахунок застосування відокремлення оротової кислоти з аналізованої проби на хроматографічній пластинці та використання твердофазної люмінесценції іону тербію(III) в тонкому шарі сорбенту на пластинці забезпечують підвищення селективності та зниження межі визначення ортової кислоти. Поставлена задача вирішена в способі визначення оротової кислоти, що включає відбір проби, взаємодію її з хімічними реагентами та вимірювання аналітичного сигналу, тим, що спочатку здійснюють відокремлення оротової кислоти методом тонкошарової хроматографії, відокремлену таким чином оротову кислоту піддають взаємодії в шарі сорбенту з іонами тербію(III) в присутності тритону Х-100 та уротропіну при рН 6,8-7,2 і вимірюють інтенсивність люмінесценції іону Тb(III) в тонкому шарі сорбенту. Новим у винаході, що заявляється, є використання реакції взаємодії оротової кислоти з іонами тербію(III), яка проходить у фазі сорбенту на пластинці для тонкошарової хроматографії, з метою відокремлення кислоти із розчину і підсилення сенсибілізованої твердофазної люмінесценції іона Тb(ІІІ) у присутності неіоногенної поверхнево-активної речовини тритону X100 та уротропіну при рН 6,8-7,2. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак і досягненням технічного результату полягає в наступному. Підвищення селективності визначення, зниження межі виявлення стало можливим завдяки наступним прийомам: 1. Застосуванню методу тонкошарової хроматографії для відокремлення оротової кислоти. Застосування такого прийому дозволяє поєднувати стадію попереднього відокремлення оротової кислоти в тонкому шарі сорбенту з отриманням сорбату комплексу, який проявляє люмінесцентні властивості в твердій фазі сорбенту, що дозволяє проводити селективне твердофазне люмінесцентне визначення оротової кислоти. 2. Застосування сорбції оротової кислоти в шарі сорбенту сприяє збільшенню інтенсивності люмінесценції сорбатів комплексів внаслідок зменшення безвипромінювальних втрат енергії збудження, що веде до зниження межи визначення оротової кислоти. 1 UA 99549 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Сенсибілізована люмінесценція іона Тb(III) в шарі сорбенту посилюється у присутності неіоногенної поверхнево-активної речовини тритону Х-100, що сприяє дегідратації утвореного комплексу і тим самим зменшенню безвипромінювальних втрат енергії збудження. Найбільша інтенсивність люмінесценції спостерігається при використанні проявного розчину -2 з концентрацією Тb(III) 1·10 моль/л. При більших концентраціях спостерігається зростання інтенсивності люмінесценції "холостої" проби. Як проявний розчин використаний розчин -2 хлориду Тb(III) з концентрацією 1·10 моль/л. Інтенсивність люмінесценції (Ілюм) сорбату тербію(III) залежіть від кількості тритону Х-100 у розчині. Найбільша Ілюм виявляється в присутності тритону Х-100 у розчині 0,2 %. Сорбат комплексу Тb(III) з оротовою кислотою має люмінесцентні властивості в інтервалі значень рН від 5,5 до 8,5 з максимумом люмінесценції при рН 6,8-7,2. Для створення необхідного значення рН використовували розчин уротропіну 4 %-ого. Як рухома фаза оптимальною виявилася суміш бензол:метанол:оцтова кислота у співвідношенні 10:5:1. Вивчення впливу об'єму проби, що наноситься на пластинку, показало, що найкращий результат досягається при нанесенні проби об'ємом 2 мкл. При менших або більших кількостях проби плями на пластинці набувають витягнутої форми. Приклад. Визначення оротової кислоти проводили в натуральному молоці. Вплив білкових компонентів молока, що заважають, усували їх попереднім осадженням. Для цього проби натурального коров'ячого молока об'ємом 10 мл поміщали у мірні колби об'ємом 100 мл, обробляли 1 мл 1,7 моль/л розчином оцтової кислоти і 1 мл 1 моль/л розчином ацетату натрію, додавали 60 мл дистильованої води і нагрівали на водяній бані (40 °C) протягом 5 хвилин при перемішуванні. Потім охолоджували до кімнатної температури і доводили до мітки дистильованою водою, сирну масу фільтрували через подвійний паперовий фільтр "синя стрічка", заздалегідь оброблений гарячою водою. Отриману сироватку попередньо розбавляли дистильованою водою в 5 разів. Для цього до 2 мл сироватки додавали 8 мл дистильованої води. 2 мкл розбавленої проби наносили мікрошприцем на лінію старту хроматографічної пластинки розміром 30×80 мм. Паралельно на пластинку наносили стандартний розчин оротової кислоти. Пластинку поміщали в хроматографічну камеру з рухомою фазою (суміш бензолу:метанолу:оцтової кислоти у співвідношенні 10:5:1). Коли фронт розчинника досягав висоти 70 мм, пластинку витягали з камери і відмічали положення фронту розчинника. Отриману хроматограму висушували при температурі 40 °C протягом 2 хвилин і рівномірно -2 послідовно обробляли пляму оротової кислоти проявними розчинами хлориду тербію (1·10 моль/л), а потім тритону Х-100 (0,2 %-им) і уротропіну 4 %-им. Ідентифікацію оротової кислоти на пластинці проводили за появою зеленої люмінесценції іону тербію(III) під люмінесцентною лампою зі світлофільтром УФС-2 (збудж = 365 нм), візуально порівнюючи інтенсивність люмінесценції проби і стандарту. Кількісне визначення оротової кислоти проводили за калібрувальним графіком, для побудови якого виконували наступне. На пластинку наносили різні кількості стандартного розчину оротової кислоти і далі проводили хроматографування і проявлення хроматограми, як описано вище. Потім з пластинки вирізали плями з оротової кислоти, вміщували в кювету для твердих зразків і вимірювали Ілюм при випр = 545 нм. За отриманими даними будували калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис концентрацію оротової кислоти, а на осі ординат значення інтенсивності люмінесценції. За допомогою цього графіка визначали вміст оротової кислоти в аналізованої пробі. В коров'ячому молоці знайдено 10 мкг/мл оротової кислоти. Точність і відтворюваність визначення перевірена методом статистичної обробки результатів. При n=5 і Р=0,95 величина відносного стандартного відхилення (Sr) складає 0,07-3 0,09. Межа виявлення оротової кислоти складає (1·10 моль/л) 2·10 мкг/мл. Результати визначення оротової кислоти в молоці перевірена методом "введено-знайдено" (табл.), за допомогою якого показано правильність методики. 2 UA 99549 C2 Таблиця Результати визначення оротової кислоти в молоці методом "введено-знайдено" (мкг/мл) (n=5, Р=0,95) Введено 10 25 Знайдено 10,1 20,2 34,8 Sr 0,09 0,09 0,08 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб кількісного визначення оротової кислоти в натуральному молоці, що включає відбір проби, взаємодію її з хімічними реагентами та вимірювання аналітичного сигналу, який відрізняється тим, що в пробі молока попередньо осаджують білкові компоненти, після чого здійснюють відокремлення оротової кислоти шляхом тонкошарової хроматографії, відокремлену таким чином оротову кислоту піддають взаємодії в шарі сорбенту з іонами тербію(III) в присутності тритону Х-100 та уротропіну при рН 6,8-7,2 і вимірюють інтенсивність люмінесценції іону Тb(III) в тонкому шарі сорбенту. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3