Нова дельта-9-елонгаза для одержання олій, збагачених поліненасиченими жирними кислотами

Реферат: Винахід належить до виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що кодує елонгазну активність, та до поліненасиченої жирної кислоти, продукованої поліненасиченої жирної кислоти, що містить елемент ненасиченості в вуглецю, за допомогою функціонально активної елонгази, кодованої з молекули нуклеїнової кислоти. поліпептид, що має шляхом подовження положенні 9 атому заявленої виділеної UA 107468 C2 (12) UA 107468 C2 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний опис відноситься до виділених полінуклеотидів, що кодують дельта-9-елонгазу, дельта-9-елонгаз, які кодують зазначені виділені полінуклеотиди, векторів експресії, що містять зазначені виділені полінуклеотиди, клітин-хазяїв, що містять зазначені вектори експресії, та способів одержання дельта-9-елонгаз та поліненасичених жирних кислот. Поліненасичені жирні кислоти (ПНЖК) грають велику роль в правильному функціонуванні живих організмів. Наприклад, ПНЖК являють собою важливі компоненти плазматичної мембрани клітини, у якій вони присутні у вигляді фосфоліпідів. Вони також є попередниками простациклінів, ейкозаноїдів, лейкотриєнів та простагландинів ссавців. Крім того, ПНЖК необхідні для правильного формування головного мозку немовля, що розвивається, а також для утворення та відновлення тканин. У зв'язку з біологічною значимістю ПНЖК, робляться спроби ефективного одержання ПНЖК, а також проміжних продуктів, що дозволяють їх одержати. В біосинтез ПНЖК залучена множина ферментів, в основному десатураз та елонгаз (див. Фігуру 1). Десатурази каталізують введення елементів ненасиченості (наприклад, подвійних зв'язків) між атомами вуглецю в субстраті – алкільному ланцюгу жирної кислоти. Елонгази каталізують додавання 2-вуглеводневої одиниці до жирної кислоти - субстрату. Наприклад, лінолеву кислоту (ЛК, 18:2n-6) отримують з олеїнової кислоти (ОК, 18:1n-9) за допомогою дельта-12-десатурази. Ейкозандієнову кислоту (ЕДК, 20:2n-6) отримують з лінолевої кислоти (ЛК, 18:2n-6) за допомогою дельта-9-елонгази. Дигомо-гама-ліноленову кислоту (ДГЛК, 20:3n-6) отримують з ейкозандієнової кислоти (ЕДК, 20:2n-6) за допомогою дельта-8-десатурази. Арахідонову кислоту (АРК, 20:4n-6) отримують з дигомо-гама-ліноленової кислоти (ДГЛК, 20:3n6) за допомогою дельта-5-десатурази (див. Фігуру 1). Елонгази каталізують перетворення гама-ліноленової кислоти (ГЛК, 18:3n-6) в дигомо-гамаліноленову кислоту (ДГЛК, 20:3n-6) та перетворення стеаридонової кислоти (СДК, 18:4n-3) в ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК, 20:4n-3). Елонгаза також каталізує перетворення арахідонової кислоти (АРК, 20:4n-6) в адренову кислоту (АДК, 22:4n-6) та перетворення ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:5n-3) в омега-3-докозапентаєнову кислоту (22:5n-3). Дельта-9-елонгаза подовжує поліненасичені жирні кислоти, що містять елемент ненасиченості в положенні 9 атому вуглецю. Наприклад, дельта-9-елонгаза каталізує перетворення лінолевої кислоти (ЛК, 18:2n-6) в ейкозандієнову кислоту (ЕДК, 20:2n-6) та перетворення альфа-ліноленової кислоти (АЛК, 18:3n-3) в ейкозатриєнову кислоту (ЕТрК, 20:3n-3). Омега-3-ЕТрК потім можна перетворити в омега-3-ЕТК за допомогою дельта-8-десатурази. Омега-3-ЕТК потім можна використовувати для одержання інших поліненасичених жирних кислот, таких як омега-3-ЕПК, які можна додавати в фармацевтичні композиції, харчові композиції, корма для тварин, а також інші продукти, такі як косметичні засоби. Виявлені раніше елонгази відрізняються за субстратами, на які вони діють. Більше того, вони присутні як у тварин, так і у рослинах. Елонгази, виявлені у ссавців, мають здатність використовувати як субстрат насичені, мононенасичені та поліненасичені жирні кислоти. Навпаки, виявлені в рослинах елонгази специфічні до насичених або мононенасичених жирних кислот. Таким чином, існує потреба в елонгазі, специфічній до ПНЖК, для одержання поліненасичених жирних кислот в рослинах. Вважають, що як у рослин, так і у тварин процес елонгації складається з чотирьох етапів (Lassner та др., The Plant Cell 8:281-292 (1996)). КоА являє собою переносник ацильної групи. Перший етап включає конденсацію малоніл-КоА з довголанцюговим ацил-КоА з одержанням діоксиду вуглецю та β-кетоацил-КоА, у якому ацильону молекула подовжилась на два атоми вуглецю. Наступні реакції включають відновлення до β-гідроксиацил-КоА, дегідрування з одержанням еноїл-КоА та повторне відновлення з одержанням подовженого ацил-КоА. Вихідна реакція конденсації являє собою не тільки субстрат-специфічний етап, але і стадію, що лімітує швидкість реакції. Слід відмітити, що тварини не можуть зменшувати насиченість нижче положення дельта-9 та, отже, не можуть перетворювати олеїнову кислоту (ОК, 18:1n-9) в лінолеву кислоту (ЛК, 18:2n-6). Аналогічним чином, альфа-ліноленова кислота (АЛК, 18:3n-3) не може бути синтезована ссавцями, так як у них відсутня дельта-15-десатуразна активність. Тем не менше, у ссавців та водоростей альфа-ліноленова кислота може бути перетворена в стеаридонову кислоту (СДК, 18:4n-3) за допомогою дельта-6-десатурази (див. WO 96/13591; див. також патент США номер 5552306), а потім піддана елонгації з одержанням ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК, 20:4n-3). Ця поліненасичена жирна кислота (тобто ЕТК, 20:4n-3) потім може бути перетворена в ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК, 20:5-3) за допомогою дельта-5-десатурази. Інші еукаріоти, включаючи гриби та рослини, містять ферменти, які зменшують насиченість в положеннях атомів вуглецю 12 (див. WO 94/11516 та патент США номер 5443974) та 15 (див. WO 93/11245). 1 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отже, основні поліненасичені жирні кислоти тварини отримують з їжі та/або в результаті десатурації та елонгації лінолевої кислоти або альфа-ліноленової кислоти. У зв'язку з нездатністю ссавців утворювати зазначені незамінні довголанцюгові жирні кислоти, великий інтерес являє виділення генів, залучених в біосинтез ПНЖК, з видів, які в природі продукують дані жирні кислоти, та експресування даних генів в системі мікроорганізму, рослини або тварини, яку можна змінити, щоб забезпечити одержання промислових кількостей однієї або декількох ПНЖК. Отже, існує виражена потреба в ферментах елонгазах, генах, що кодують дані ферменти, а також рекомбінантних способах одержання зазначених ферментів. У зв'язку з приведеним обговоренням, також існує певна потреба в оліях, що містять ПНЖК на більш високому, ніж присутні в природі, рівні, а також в оліях, збагачених новими ПНЖК. Такі олії можна одержати шляхом виділення та експресії генів елонгази. Однією з найбільш важливих довголанцюгових ПНЖК є ейкозапентаєнова кислота (ЕПК). ЕПК виявляють в грибах, а також в маслах з морепродуктів. Докозагексаєнова кислота (ДГК) являє собою іншу важливу довголанцюгову ПНЖК. ДГК частіше за все виявляють в риб'ячому жирі, а також її можна виділити з тканини головного мозку ссавця. Арахідонова кислота (АРК) являє собою третю важливу довголанцюгову ПНЖК. АРК виявляють в міцеліальних грибах, та її також можна виділити з тканин ссавця, включаючи печінку та наднирковики. АРК, ЕПК та/або ДГК, наприклад, можна одержати або за допомогою альтернативного шляху з участю дельта-8-десатурази/дельта-9-елонгази, або за допомогою звичайного шляху дельта-6 (див. Фігуру 1). Раніше були ідентифіковані елонгази, які активні у відношенні жирних кислот - субстратів в звичайному шляху дельта-6 одержання довголанцюгових ПНЖК, особливо АРК, ЕПК та ДГК. В звичайному шляху дельта-6 перетворення ЛК в ДГЛК та АЛК в омега-3-ЕТК використовують фермент дельта-6-десатуразу для перетворення ЛК в ГЛК та АЛК в стеаридонову кислоту (СДК) та фермент дельта-6-елонгазу для перетворення ГЛК в ДГЛК та СДК в омега-3-ЕТК. Тим не менше, в деяких випадках, альтернативний шлях за участю дельта8-десатурази/дельта-9-елонгази може виявитися кращим у порівнянні із звичайним шляхом дельта-6. Наприклад, якщо певні залишкові проміжні продукти омега-6 або омега-3 жирних кислот, такі як ГЛК або СДК, не бажані в процесі одержання ДГЛК, омега-3-ЕТК, АРК, ЕПК, омега-3-докозапентаєнової кислоти, омега-6-докозапентаєнової кислоти, АДК та/або ДГК, як альтернатива звичайному шляху дельта-6 можна застосовувати інший шлях за участю дельта8-десатурази/дельта-9-елонгази, щоб уникнути утворення ГЛК та СДК. В даному описі, ідентифікували нове джерело дельта-9-елонгази для одержання довголанцюгових ПНЖК, зокрема ДГЛК, ЕТК, АРК, ЕПК, омега-3-докозапентаєнової кислоти, омега-6-докозапентаєнової кислоти, АДК та/або ДГК. Фермент дельта-9-елонгаза згідно даному опису перетворює, наприклад, ЛК в омега-6-ЕДК та АЛК в омега-3-ЕТрК. Одержання ДГЛК з омега-6-ЕДК та АРК з ДГЛК потім каталізується ферментом дельта-8-десатуразою та дельта-5десатуразою, відповідно. КОРОТКИЙ опис ВИНАХОДУ У одному своєму аспекті, даний винахід відноситься до виділеної молекули нуклеїнової кислоти, або фрагменту зазначеної нуклеїнової кислоти, яка включає виділену нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, що має елонгазну активність, або яка є комплементарною зазначеній послідовності, при цьому послідовність амінокислот зазначеного поліпептиду щонайменше на 68 % ідентична послідовності амінокислот, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 18 та SEQ ID NO: 20. У іншому своєму аспекті, даний винахід відноситься до виділеної нуклеотидної послідовності, або фрагменту зазначеної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше 68 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19. Зазначена виділена нуклеотидна послідовність або фрагмент зазначеної послідовності кодує функціонально активну елонгазу, яка використовує поліненасичену жирну кислоту як субстрат, зокрема, функціонально активну дельта-9-елонгазу. Зазначену нуклеотидна послідовність можна одержати, наприклад, з Euglenoid sp., зокрема, можна виділити, наприклад, з Euglena deses Ehr. CCMP 2916. В іншому аспекті, даний винахід відноситься до очищеного поліпептиду, який кодує описану вище виділену нуклеотидну послідовність, а також до очищеного поліпептиду, який подовжує поліненасичені жирні кислоти, що містять елемент ненасиченості в положенні атому вуглецю 9, та має щонайменше 68 % ідентичності амінокислотної послідовності з послідовністю амінокислот, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 18 та SEQ ID NO: 20. В ще одному аспекті, даний винахід відноситься до вектору експресії. Зазначений вектор експресії містить нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з регуляторною послідовністю, при цьому зазначена нуклеотидна послідовність включає або комплементарна 2 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше 68 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19. Даний винахід також відноситься до клітини-хазяїну, що містить зазначений вектор експресії. Клітина-хазяїн може являти собою, наприклад, еукаріотичну клітину або прокаріотичну клітину. Підходящі еукаріотичні клітини та прокаріотичні клітини описані в даній заявці. Даний винахід також відноситься до трансгенного насіння, що містить зазначений вектор експресії. В іншому аспекті, даний винахід відноситься до клітини рослини, насіння рослини, рослини або тканини рослини, що містять описаний вище вектор експресії, при цьому експресія нуклеотидної послідовності зазначеного вектору експресії приводить до продукування щонайменше однієї поліненасиченої жирної кислоти зазначеними клітиною рослини, рослиною або тканиною рослини. Поліненасичена жирна кислота може бути вибрана, наприклад, з групи, що складається з омега-6-ЕДК та омега-3-ЕТрК та комбінації перерахованих жирних кислот. Даний винахід також охоплює одне або декілька рослинних масел або жирних кислот, експресованих описаною вище клітиною рослини, насінням рослини, рослиною або тканиною рослини. Крім того, даний винахід відноситься до способу одержання дельта-9-елонгази. Зазначений спосіб включає наступні етапи: a) виділення нуклеотидної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше на 68 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19; b) конструювання вектору експресії, що містить: i) зазначену виділену нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з ii) регуляторною послідовністю; та c) введення зазначеного вектору експресії в клітину-хазяїна на час та за умов, які достатні для експресування дельта-9-елонгази, у відповідних випадках. Зазначена клітинахазяїн може, наприклад, являти собою еукаріотичну клітину або прокаріотичну клітину. Зокрема, еукаріотична клітина може являти собою, наприклад, клітину ссавця, клітину комахи, клітину рослини або клітину гриба. Клітина рослини може бути одержана з олійної рослини, вибраної з групи, що складається з сої, видів Brassica, сафлори, соняшнику, кукурудзи, бавовнику та льону. Додатково, даний винахід відноситься до способу одержання поліненасиченої жирної кислоти, який включає наступні етапи: a) виділення нуклеотидної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше на 68 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19; b) конструювання вектору експресії, що містить зазначену виділену нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з регуляторною послідовністю; c) введення зазначеного вектору експресії в клітину-хазяїна на час та за умов, які достатні для експресування дельта-9-елонгази; та d) забезпечення взаємодії зазначеної експресованої дельта-9-елонгази та поліненасиченої жирної кислоти – субстрату з тим, щоб перетворити зазначену поліненасичену жирну кислоту - субстрат в першу поліненасичену жирну кислоту - продукт. Зазначена "поліненасичена жирна кислота - субстрат" являє собою, наприклад, ЛК або АЛК, та "перша поліненасичена жирна кислота – продукт" являє собою, наприклад, омега-6-ЕДК або омега-3-ЕТрК, відповідно. Даний спосіб може додатково включати етап впливу на першу поліненасичену жирну кислоту - продукт щонайменше однієї десатурази, щонайменше однієї додаткової елонгази або комбінації перерахованих ферментів з тим, щоб перетворити зазначену першу поліненасичену жирну кислоту - продукт у другу або наступну поліненасичену жирну кислоту - продукт. Зазначена друга або наступна поліненасичена жирна кислота – продукт може являти собою, наприклад, ДГЛК або омега-3-ЕТК, АРК, ЕПК, ДПК, ДГК або комбінації перерахованих жирних кислот. В іншому аспекті, даний винахід відноситься до способу одержання поліненасиченої жирної кислоти в клітині-хазяїні, який включає наступні етапи: a) виділення нуклеотидної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше на 68 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19; b) конструювання вектору експресії, що містить зазначену виділену нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з регуляторною послідовністю; c) введення i) зазначеного вектору експресії та ii) щонайменше однієї додаткової конструкції рекомбінантної ДНК, що містить зазначену виділену нуклеотидну послідовність, що кодує дельта-8-десатуразу та функціонально зв'язану з щонайменше однією регуляторною послідовністю, в клітину-хазяїна на час та за умов, які достатні для експресування дельта-9-елонгази та дельта-8-десатурази; та d) забезпечення взаємодії зазначених експресованої дельта-9-елонгази та дельта-8-десатурази на поліненасичену жирну кислоту - субстрат, вибрану з групи, що складається з ЛК, АЛК та комбінації перерахованих жирних кислот з тим, щоб перетворити зазначену поліненасичену жирну кислоту – субстрат в першу поліненасичену жирну кислоту -продукт. Зазначена перша поліненасичена жирна кислота – продукт може являти собою, наприклад, ДГЛК, омега-3-ЕТК або комбінації перерахованих жирних кислот. Даний спосіб може додатково включати етап впливу на 3 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зазначену першу поліненасичену жирну кислоту - продукт щонайменше однієї десатурази, щонайменше однієї додаткової елонгази або комбінації перерахованих ферментів з тим, щоб перетворити зазначену першу поліненасичену жирну кислоту – продукт у другу або наступну поліненасичену жирну кислоту - продукт. Зазначена друга або наступна поліненасичена жирна кислота – продукт може являти собою, наприклад, АРК, ЕПК, ДПК, ДГК або комбінацію перерахованих жирних кислот. В одному аспекті, зазначений спосіб може додатково включати введення в клітину-хазяїна конструкції рекомбінантної ДНК, що містить i) виділену нуклеотидну послідовність, що кодує дельта-5-десатуразу, функціонально зв'язану з ii) регуляторною послідовністю. Зазначена клітина-хазяїн може являти собою описану вище клітину-хазяїна. В іншому своєму аспекті, даний винахід відноситься до способу одержання трансгенної рослини, який включає трансформування клітини рослини щонайменше однієї виділеної послідовністю нуклеотидів, або фрагментом зазначеної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше 68 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19,, та регенерування трансгенної рослини з трансформованої клітини рослини. Зазначену клітину рослини можна одержати з олійної рослини, вибраної з групи, що складається з сої, видів Brassica, сафлори, соняшнику, кукурудзи, бавовнику та льону. В іншому аспекті, даний винахід відноситься до насіння, отриманого з такої трансгенної рослини, отриманої за допомогою зазначеного способу. Також слід відмітити, що кожній нуклеотидній послідовності та амінокислот, згаданій в даному описі, був привласнений конкретний ідентифікаційний номер послідовності. В Переліку послідовностей (який прикладений до даного опису), включеному в дану заявку шляхом посилання, перераховані всі такі послідовності та відповідні їм номери. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На Фігурі 1 показаний шлях біосинтезу жирних кислот та роль дельта-9-елонгази у цьому шляху. На Фігурах 2A та 2B показано вирівнювання послідовностей нуклеотидів SEQ ID NO: 26 та SEQ ID NO: 27, які являють собою нуклеотидній послідовності варіантів Eug-MO7-ELO#10 та Eug-MO7-ELO#14, відповідно, клонованих в сайти Bam HI/Hind III вектору pYX242, що обговорюється в Прикладі 3. Варіанти обведені прямокутниками. На Фігурах 3A та 3B показано вирівнювання послідовностей амінокислот дельта-9-елонгази з Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO-10) (SEQ ID NO: 18) з відомими дельта-9елонгазами з Euglena gracialis (SEQ ID NO: 4), Isochrysis galbana (SEQ ID NO: 2); елонгазою Elov14 миші (номер доступу AAG47667; SEQ ID NO: 21), елонгазою ELOVL2 людини (номер доступу NP_060240; SEQ ID NO: 22) та елонгазою C. elegans (номер доступу AF244356; SEQ ID NO: 23). Незмінні залишки заштриховані. На Фігурі 4A показана послідовність амінокислот дельта-9-елонгази з Pavlova salina (номер доступу AAY15135; SEQ ID NO: 1). На Фігурі 4B показана послідовність амінокислот дельта-9-елонгази з Isochrysis galbana (номер доступу AF390174; SEQ ID NO: 2). На Фігурі 4C показана послідовність амінокислот дельта-9-елонгази з Eutreptiella sp. (SEQ ID NO: 3). На Фігурі 4D показана послідовність амінокислот дельта-9-елонгази з Euglena gracialis (номер доступу CAT16687; SEQ ID NO: 4). На Фігурі 4E показана послідовність амінокислот дельта-9-елонгази з Euglena anabena (SEQ ID NO: 5). На Фігурі 5A показана нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO: 6) клону plate2_MO7, одержання якого описане в Прикладі 1. На Фігурі 5B показана прогнозована послідовність амінокислот (SEQ ID NO: 7) клону plate2_MO7, одержання якого описане в Прикладі 1. На Фігурі 6A показана нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO: 13) передбачуваного 3’-кінця фрагменту гену plate2_MO7, одержання якого описане в Прикладі 2. На Фігурі 6B показана прогнозована послідовність амінокислот (послідовності SEQ ID NO: 14 та 30-32) передбачуваного 3’-кінця фрагменту гену plate2_MO7, одержання якого описане в Прикладі 2. Послідовності SEQ ID NO: 14 та 30-32 відділені значком “*”, який являє собою стопкодон. На Фігурі 6C показана послідовність SEQ ID NO: 14. На Фігурі 6D показана послідовність SEQ ID NO: 30. На Фігурі 6E показана послідовність SEQ ID NO: 31. На Фігурі 6F показана послідовність SEQ ID NO: 32. На Фігурі 7A показана нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO: 17) передбачуваної дельта-9 4 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 елонгази з Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#10), одержання якого описане в Прикладі 3. На Фігурі 7B показана прогнозована послідовність амінокислот (SEQ ID NO: 18), що кодується нуклеотидною послідовністю (SEQ ID NO: 17) передбачуваної дельта-9-елонгази з Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#10), одержання якого описане в Прикладі 3. На Фігурі 8A показана нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO: 19) варіанту дельта-9елонгази з Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#14), одержання якого описане в Прикладі 3. На Фігурі 8B показана прогнозована послідовність амінокислот (SEQ ID NO: 20), що кодується нуклеотидною послідовністю (SEQ ID NO: 19) варіанту дельта-9-елонгази з Euglena deses Ehr. CCMP 2916 (Eug-MO7-ELO#14), одержання якого описане в Прикладі 3. На Фігурі 9A показана послідовність амінокислот елонгази Elov14 миші (номер доступу AAG47667; SEQ ID NO: 21). На Фігурі 9B показана послідовність амінокислот елонгази ELOVL2 людини (номер доступу NP_060240; SEQ ID NO: 22). На Фігурі 9C показана послідовність амінокислот елонгази C. elegans (номер доступу AF244356; SEQ ID NO: 23). ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід відноситься до послідовностей нуклеотидів (наприклад, гену) та трансльованих послідовностей амінокислот гену дельта-9-елонгази з Euglenoid sp., наприклад, Euglena deses Ehr., зокрема Euglena deses Ehr. CCMP 2916. Більше того, даний винахід також охоплює варіанти застосування зазначеного гену та ферменту, що кодується зазначеним геном. Наприклад, ген та відповідний фермент можна застосовувати для одержання поліненасичених жирних кислот, таких як, наприклад, омега-6-ЕДК, омега-3-ЕТрК, ДГЛК, омега-3-ЕТК, АРК, ЕПК, омега-3-докозапентаєнова кислота, омега-6-докозапентаєнова кислота, АДК, ДГК або будь-яка комбінація перерахованих жирних кислот, які можна додати в фармацевтичні композиції, харчові композиції та в інші корисні продукти. Визначення В даній заявці, форми однини включають посилання на множину, якщо в контексті явно не зазначено інше. При перерахуванні в даній заявці числових діапазонів, передбачається, що кожне число, що знаходиться в межах даних діапазонів, вказане в явній формі з однаковим ступенем точності. Наприклад, передбачається, що в діапазоні 6-9, на додаток до 6 та 9, вказані числа 7 та 8, а в діапазоні 6,0-7,0 в явній формі вказані числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 та 7,0. Химерна конструкція: В даній заявці, формулювання "химерна конструкція" відноситься до комбінації молекул нуклеїнових кислот, які звичайно не зустрічаються разом в природі. Відповідно, химерна конструкція може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, які отримують з різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, отримані з одного і того ж джерела, але розташовані в порядку, що відрізняється від того, що звичайно зустрічається в природі. Кодуюча послідовність: В даній заявці, термін "кодуюча послідовність" відноситься до послідовності ДНК, яка кодує певну послідовність амінокислот. "Регуляторні послідовності" відносяться до послідовностей нуклеотидів, розташованих проти ходу транскрипції (5’некодуючі послідовності), всередині або по ходу транскрипції (3’-некодуючі послідовності) від кодуючої послідовності, при цьому зазначені нуклеотидній послідовності впливають на транскрипцію, процесинг або стабільність РНК або трансляцію зв'язаної з ними кодуючої послідовності. Регуляторні послідовності можуть включати, але не обмежені перерахованими, промотори, послідовності, що направляють трансляцію, інтрони та регуляторні послідовності поліаденілювання. Комплементарність: В даній заявці, термін "комплементарність" відноситься до ступеню схожості між двома фрагментами ДНК. ЇЇ визначають шляхом вимірювання здатності смислової нитки одного фрагменту ДНК гібридизуватися з антисмисловою ниткою іншого фрагменту ДНК за умов, що підходять для утворення подвійної спіралі. В подвійній спіралі, аденін присутній на одній нитці, тимін присутній на іншій нитці. Аналогічно, там, де гуанін присутній на одній нитці, цитозин виявляють на іншій. Чим більше схожість між послідовностями нуклеотидів двох фрагментів ДНК, тим більше здатність утворювати гібридні дуплекси між нитками двох зазначених фрагментів ДНК. Кодується, гібридизація та строгі вимоги: В даному описі, формулювання "кодується" відноситься до послідовності нуклеїнових кислот, яка кодує поліпептидну послідовність, при цьому зазначена поліпептидна послідовність або її частина містить амінокислотну 5 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність, що складається з щонайменше трьох послідовних амінокислот, більш переважно з щонайменше восьми послідовних амінокислот та ще більш переважно з щонайменше 15 послідовних амінокислот поліпептиду, що кодується зазначеною послідовністю нуклеїнових кислот. В обсяг даного винаходу також входить виділена нуклеотидна послідовність, яка кодує фермент, що має активність елонгази ПНЖК, та яка здатна гібридизуватися при помірно строгих умовах з нуклеїновою кислотою, що має нуклеотидну послідовність, яка включає або комплементарна нуклеотидній послідовності, що включає SEQ ID NO: 17 або SEQ ID NO: 19 (як показано на Фігурах 7A та 8A, відповідно). Молекула нуклеїнової кислоти "здатна гібридизуватися" з іншою молекулою нуклеїнової кислоти, якщо одноланцюгова форма зазначеної молекули нуклеїнової кислоти може випалюватися з іншою молекулою нуклеїнової кислоти за підходящих умов, тобто при підходящій температурі та іонній силі (див., Sambrook та др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, друге видання (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спрінг Харбор, Нью-Йорк)). Умови (температура та іонна сила) визначають "строгість" гібридизації. Для "гібридизації" необхідно, щоб дві нуклеїнові кислоти містили комплементарні послідовності. Тим не менше, в залежності від строгості гібридизації, можуть зустрічатися неспівпадіння між основами. Підходяща строгість гібридизації нуклеїнових кислот залежить від довжин нуклеїнових кислот та ступеню їх комплементарності. Такі параметри добре відомі спеціалістам в даній галузі. Зокрема, чим більше ступінь подібності або гомології між двома послідовностями нуклеотидів, тим більше значення Tm для гібридів нуклеїнових кислот з даними послідовностями. Для гібридів довжиною більше, ніж 100 нуклеотидів, вивели рівняння для обчислення Tm (див., Sambrook та ін., вище). Для гібридизації з більш короткими нуклеїновими кислотами, положення неспівпадінь стає більш суттєвим, та довжина олігонуклеотиду визначає його специфічність (див., Sambrook та ін., вище). Звичайно, строгі умови являють собою такі умови, при яких концентрація солі менше, ніж приблизно 1,5 M іонів Na, звичайно концентрація іонів Na (або інших солей) приблизно становить від 0,01 до 1,0 M при pН від 7,0 до 8,3 та температура становить щонайменше приблизно 30 °C для коротких зондів (наприклад, розміром від 10 до 50 нуклеотидів) та щонайменше приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, розміром більше, ніж 50 нуклеотидів). Строгих умов також можна добитися шляхом додавання дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Приклад умов низької строгості включає гібридизацію в буферному розчині із вмістом формаміду від 30 до 35 %, 1 M NaCl, 1 % ДСН (додецилсульфату натрію) при 37 °C та промивання від 1 X до 2 X SSC (20 X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M тринатрієвого цитрату) при температурі від 50 до 55 °C. Приклад помірковано строгих умов включає гібридизацію в буферному розчині із вмістом формаміду від 40 до 45 %, 1 M NaСl, 1 % ДСН при 37 °C та промивання від 0,5 X до 1 X SSC при температурі від 55 до 60 °C. Приклад високо строгих умов включає гібридизацію в буферному розчині з 50 % формамідом, 1 M NaСl, 1 % ДСН при 37 °C та промивання 0,1 X SSC при температурі від 60 до 65 °C. Екзон: У даній заявці, термін "екзон" відноситься до частини послідовності гену, яка транскрибується та виявляється в зрілій інформаційної РНК, отриманій із зазначеного гену, але не обов'язково є частиною послідовності, яка кодує кінцевий продукт гену. Експресія, антизначеннєве інгібування та ко-супресія: У даній заявці, термін "експресія" відноситься до одержання функціонального кінцевого продукту. Експресія гену включає транскрипцію гену та трансляцію мРНК із утворенням білку-попереднику або зрілого білку. У даній заявці, формулювання "антизначеннєве інгібування" відноситься до одержання транскриптів антизначеннєвих РНК, здатних пригнічувати експресію цільового білку. У даній заявці, термін "ко-супресія" відноситься до продукції значеннєвих транскриптів РНК, здатних пригнічувати експресію ідентичних або по суті подібних чужорідних або ендогенних генів (див. патент США номер 5231020). Фрагмент або частина фрагменту, який функціонально еквівалентний: Терміни "фрагмент або частина фрагменту, який функціонально еквівалентний" та "функціонально еквівалентений фрагмент або частина фрагменту", які використовують взаємозамінно в даному описі, відносяться до частини або підпослідовності виділеної молекули нуклеїнової кислоти, у якої зберігається здатність змінювати експресію гену або викликати деякий фенотип незалежно від того, кодує або ні зазначений фрагмент або частину фрагменту активний фермент. Наприклад, фрагмент або частину фрагменту можна застосовувати при розробці химерних конструкцій для одержання бажаного фенотипу у трансформованої рослини. Химерні конструкції можна розробити спеціально, щоб застосовувати для ко-супресії або антизначеннєвого інгібування, шляхом приєднання фрагменту або частини фрагменту нуклеїнової кислоти, незалежно від того, кодує він або ні активний фермент, у підходящій орієнтації по відношенню до промоторної 6 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності рослини. Ген, нативний ген, чужорідний ген та трансген: У даній заявці, термін "ген" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, яка експресує певний білок, включаючи регуляторні послідовності, що передують (5’-некодуючі послідовності) та наступні (3’-некодуючі послідовності) за кодуючою послідовністю. У даній заявці, формулювання "нативний ген" відноситься до гену в такому вигляді, у якому він зустрічається в природі, з його власними регуляторними послідовностями. "Чужорідний" ген відноситься до гену, що звичайно не зустрічається в організмі хазяїна, але який був введений в організм хазяїна шляхом переносу генів. Чужорідні гени можуть включати нативні гени, вставлені в ненативний організм, або химерні конструкції. У даній заявці, термін "трансген" відноситься до гену, який був введений у геном за допомогою процедури трансформації. Види Gossypium: В даній заявці, формулювання "види Gossypium" відноситься до будь-якої з перерахованих рослин: Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium hirsutum, Gossypium hirsutum var hirsutum, Gossypium hirsutum var marie-galante, Gossypium lapideum, Gossypium sturtianum, Gossypium thuberi, Gossypium thurberi, Gossypium tomentosum або Gossypium tormentosum. Гомологія: Терміни "гомологія", "гомологічний", "по суті подібний" та "по суті відповідний" використовуються взаємозамінно в даному описі та відносяться до молекул нуклеїнових кислот, у яких зміна однієї або декількох нуклеотидних основ не впливає на здатність зазначеної молекули нуклеїнової кислоти опосередковувати експресію гену або визначати деякий фенотип. Дані терміни також відносяться до модифікацій молекул нуклеїнових кислот згідно даного опису, таких як делеція або вставка одного або декількох нуклеотидів, які по суті не змінюють функціональних властивостей отриманої в результаті цього молекули нуклеїнової кислоти в порівнянні з вихідною, немодифікованою молекулою. Отже, для фахівців у даній галузі повинно бути очевидно та зрозуміло, що в обсяг даного винаходу входять не тільки конкретні типові послідовності. Клітина-хазяїн: У даній заявці, під формулюванням "клітина-хазяїн" мають на увазі клітину, яка містить виділену послідовність нуклеїнових кислот або її фрагмент згідно даного опису. Клітини-хазяїни можуть являти собою прокаріотичну клітину (наприклад, таку як Escherichia coli, ціанобактерії та Bacillus subtilis) або еукаріотичну клітину (наприклад, таку як клітина гриба, комахи, рослини або ссавця). Приклади клітин гриба, які можна використовувати, являють собою Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp. та Pichia spp. Особливо кращою клітиною гриба є Saccharomyces cerevisiae. Клітини рослини можуть бути клітинами однодольної або дводольної рослини. Особливо кращі клітини рослини отримують із олійних рослин, таких як Glycine max (наприклад, соя), види Brassica, Carthamus tinctorius L. (наприклад, сафлор), Helianthus annuus (наприклад, соняшник), Zea mays (наприклад, кукурудза), види Gossypium (бавовник) та Linum usitatissimum (наприклад, льон). Ідентичність, ідентичність послідовностей та відсоток ідентичності послідовностей (% ідентичності): Терміни "ідентичність" або "ідентичність послідовностей", які використовують взаємозамінно в даному описі, коли вони використовуються в контексті послідовностей нуклеотидів або послідовностей поліпептидів, відносяться до основ нуклеїнових кислот або до амінокислотних залишків у двох послідовностях, які виявляються однаковими, коли їх вирівнюють на максимальну відповідність у рамках певного вікна порівняння. Таким чином, ідентичність визначають як ступінь однаковості, відповідності або еквівалентності між однаковими нитками (або значеннєвими, або антизначеннєвими) двох фрагментів ДНК або поліпептиду. "Відсоток ідентичності послідовностей" або “% ідентичності" розраховують шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей на протязі певної ділянки, визначення кількості положень, у яких зустрічаються ідентичні основи в обох послідовностях, для одержання кількості співпадаючих положень, ділення кількості таких положень на загальну кількість положень у порівнюваному фрагменті та множення результату на 100. Оптимальне вирівнювання послідовностей можна здійснити за допомогою алгоритму Сміта-Ватермана, Appl. Math. 2:482 (1981), за допомогою алгоритму Нідлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), за допомогою способу по Пірсону та Ліпману, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), та за допомогою комп'ютерних програм, які здійснюють відповідні алгоритми (наприклад, Higgins та др., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical 7 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Information; Altschul та ін., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Медісон, Вісконсин) або GAP, BESTFIT, FASTA та TFASTA (пакет програм Wisconsin Genetics, версія 7.0, Genetics Computer Group, Медісон, Вісконсин) (див. патент США номер 5912120). Підходящі приклади відсотку ідентичності послідовностей включають, але не обмежені перерахованими, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %. Ідентичність можна визначити за допомогою будь-яких з комп'ютерних програм, описаних у даній заявці. Опосередковано або безпосередньо: У даній заявці, в обсяг терміну "опосередковано", коли він використовується стосовно використання гену та відповідного ферменту для одержання поліненасичених жирних кислот, входить випадок, коли перша кислота перетворюється в другу кислоту (тобто інтермедіат шляху) під впливом першого ферменту (наприклад, ЛК в омега-6ЕДК, наприклад, за допомогою дельта-9-елонгази), а потім друга кислота перетворюється в третю кислоту під впливом другого ферменту (наприклад, омега-6-ЕДК у ДГЛК, наприклад, за допомогою дельта-8-десатурази). У даній заявці, в обсяг терміну "безпосередньо", коли він використовується стосовно використання гену та відповідного ферменту для одержання поліненасичених жирних кислот, входить випадок, коли фермент безпосередньо перетворює першу кислоту в другу кислоту, при цьому друга кислота потім використовується в композиції (наприклад, перетворення ЛК в омега6-ЕДК, наприклад, за допомогою дельта-9-елонгази, або омега-3-ЕТрК в омега-3-ЕТК, наприклад, за допомогою дельта-8-десатурази). Інтрон: У даній заявці, термін "інтрон" відноситься до послідовності, що знаходиться усередині гену, яка не кодує частину послідовності білку. Отже, такі послідовності транскрибуються в РНК, але потім вирізаються та не транслюються. Даний термін також використовують для вирізаних послідовностей РНК. Виділений: У даній заявці, термін "виділений" або "виділена" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), або до білку, або до біологічно активної його частини, які відділені від оточення, у якому вони зустрічаються в природі, або від їх джерела за допомогою звичайних методик, відомих у даній галузі (наприклад, від бактерій, водоростей, грибів, рослин, хребетних, ссавців та т.д.). Виділені молекули нуклеїнових кислот або білки практично або по суті вільні від компонентів, які звичайно супроводжують або взаємодіють із молекулами нуклеїнових кислот або білками в оточенні, що зустрічається в природі. Виділений фрагмент нуклеїнової кислоти або виділена послідовність нуклеїнових кислот: У даній заявці, формулювання "виділений фрагмент нуклеїнової кислоти" або "виділена послідовність нуклеїнових кислот" відноситься до полімеру РНКабо ДНК, який складається з одного або двох ланцюжків та можливо містить синтетичні, штучні або змінені нуклеотидні основи. Виділений фрагмент нуклеїнової кислоти у вигляді полімеру ДНК може складатися з одного або декількох фрагментів кДНК, геномної ДНК або синтетичної ДНК ("фрагмент" певного полінуклеотиду відноситься до полінуклеотидної послідовності, яка включає безперервну послідовність, що складається щонайменше із приблизно 6 послідовних нуклеотидів, переважно щонайменше із приблизно 8 послідовних нуклеотидів, більш переважно щонайменше із приблизно 10 послідовних нуклеотидів, щонайменше із приблизно 15 послідовних нуклеотидів, щонайменше із приблизно 20 послідовних нуклеотидів, щонайменше із приблизно 25 послідовних нуклеотидів та т.д., ідентичну або комплементарну ділянці даної нуклеотидної послідовності). Для опису нуклеотидів (звичайно знаходяться в 5'-монофосфатній формі) користуються однобуквеними позначеннями, описаними далі: "A" для аденілату або дезоксиаденілату (для РНК або ДНК, відповідно), "C" для цитидилату або дезоксицитидилату, "G" для гуанілату або дезоксигуанілату, "U" для уридилату, "T" для дезокситимідилату, "R" для пуринів (A або G), "Y" для піримідинів (C або T), "K" для G або T, "H" для A, або C, або T, "I" для інозину та "N" для будь-якого нуклеотиду. Зрілий та попередник: У даній заявці, термін "зрілий", коли він використовується по відношенню до терміну "білок", відноситься до поліпептиду, який піддався післятрансляційному процесингу; тобто, до поліпептиду, з якого були вилучені всі пре- або про-послідовності, що присутні в первинному продукті трансляції. У даній заявці, термін "попередник", коли він використовується по відношенню до терміну "білок", відноситься до первинного продукту трансляції мРНК; тобто до поліпептиду, у якому усе ще присутні пре- або пропослідовності. Преабо пропослідовності можуть являти собою, але не обмежені сигналами внутрішньоклітинної локалізації. 3’-некодуючі послідовності: У даній заявці, формулювання "3’-некодуючі послідовності" відноситься до послідовностей ДНК, розташованих по ходу транскрипції від кодуючої 8 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, які містять регуляторні послідовності поліаденілювання та інші послідовності, кодуючі регуляторні сигнали, здатні впливати на процесинг мРНК або експресію гену. Сигнал поліаденілювання звичайно описують як сигнал, що впливає на додавання ділянок поліаденілової кислоти до 3'-кінця попередника мРНК. Приклади застосування різних 3’некодуючих послідовностей описані у Ingelbrecht та ін., (1989) Plant Cell 1:671 Те, що не зустрічається в природі: У даному описі, формулювання "те, що не зустрічається в природі" відноситься до чого-небудь штучного, що не відповідає звичайно тому, що зустрічається в природі. Функціонально зв'язаний: У даній заявці, формулювання "функціонально зв'язаний" відноситься до такого зв'язку послідовностей нуклеїнових кислот в одній молекулі нуклеїнової кислоти, що функція однієї з послідовностей регулюється іншою з них. Наприклад, промотор називають функціонально пов'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він здатний регулювати експресію даної кодуючої послідовності (тобто, зазначена кодуюча послідовність знаходиться під транскрипційним контролем даного промотору). Кодуючі послідовності можуть бути функціонально пов'язані з регуляторними послідовностями в значеннєвій або антизначеннєвій орієнтації. В іншому прикладі, комплементарні ділянки РНК згідно даного винаходу можуть бути функціонально зв'язані або безпосередньо, або опосередковано, з 5'-сторони від цільової мРНК або з 3'-сторони від цільовий мРНК, або усередині цільової мРНК, або перша комплементарна ділянка знаходиться з 5'-сторони та комплементарна йому ділянка знаходиться з 3'-сторони від цільовий мРНК. Рослина: У даній заявці, термін "рослина" відноситься до цілих рослин, органів рослини, тканин рослини, насіння, клітин рослини, зерен та потомства рослини. Клітини рослини включають, без обмеження, клітини насіння, суспензійних культур, зародків, меристематичних ділянок, калусної тканини, листя, коріння, пагонів, гаметофітів, спорофітів, пилку та мікроспор. Полімеразна ланцюгова реакція або ПЛР: У даній заявці, формулювання "полімеразна ланцюгова реакція" або "ПЛР" відноситься до способу синтезування великих кількостей певних фрагментів ДНК, що складаються з ряду повторюваних циклів (Perkin Elmer Cetus Instruments, Норуолк, Коннектикут). Звичайно, двониткову ДНК денатурують нагріванням, відпалюють при низькій температурі два праймери, комплементарні до 3'-границям цільового фрагмента, а потім подовжують при проміжній температурі. Один набір цих трьох послідовних етапів називають циклом. ПЛР являє собою ефективний спосіб для ампліфікації ДНК у мільйони разів шляхом повторних реплікацій матриці за короткий період часу (Mullis та ін., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 273 (1986); Erlich та ін., заявка на європейський патент 50424; заявка на європейський патент 84796; заявка на європейський патент 258017, заявка на європейський патент 237362; Mullis, заявка на європейський патент 201184, Mullis та ін., патент США номер 4683202; Erlich, патент США номер 4582788; та Saiki та ін., патент США номер 4683194). У даному процесі в якості зародку для синтезу ДНК використовують набори специфічних синтезованих in vitro олігонуклеотидів. Розробка праймерів залежить від послідовностей ДНК, які потрібно проаналізувати. Зазначений спосіб здійснюють за допомогою великої кількості циклів (звичайно 20 – 50) плавлення матриці при високій температурі, дозволяючи праймерам відпалюватися на комплементарні послідовності матриці, а потім реплікування матриці під впливом ДНК полімерази. Продукти ПЛР аналізують шляхом розділення в агарозних гелях, а потім фарбування бромистим етидієм та візуалізації шляхом УФ-трансілюмінації. Як альтернативу, можна додати в ПЛР радіоактивні дНТФ, щоб ввести мітку в продукти. У цьому випадку, продукти ПЛР візуалізуют шляхом експонування гелю з рентгенівською плівкою. Додаткова перевага радіоактивного мічення продуктів ПЛР полягає в тому, що можна зробити кількісний аналіз рівнів окремих продуктів ампліфікації. Промотор та енхансер: У даній заявці, термін "промотор" відноситься до послідовностей ДНК, здатних контролювати експресію кодуючої послідовності або функціональної РНК. Промоторна послідовність складається із близьких та більш віддалених розташованих проти ходу транскрипції елементів, останні елементи часто називають енхансерами. У даній заявці, термін "енхансер" відноситься до послідовностей ДНК, які можуть стимулювати активність промотору та можуть являти собою природний елемент промотору або гетерологічний елемент, вставлений для підвищення рівня активності або тканеспецифічності промотору. Промоторні послідовності також можуть розташовуватися всередині транскрибуємих ділянок генів, та/або по ходу транскрипції від транскрибуємих послідовностей. Промотори можуть бути отримані повністю з нативного гену або можуть складатися з різних елементів, отриманих з різних промоторів, що зустрічаються у природі, або навіть можуть включати синтетичні фрагменти ДНК. Для фахівця в даній галузі повинно бути очевидно, що 9 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 різні промотори можуть направляти експресію гену в різних тканинах або типах клітин, або на різних стадіях розвитку, або у відповідь на різні умови навколишнього середовища. Промотори, які викликають експресування гену у більшості типів клітин у більшість моментів часу, звичайно називають "конститутивними промоторами". Постійно виявляють нові промотори різних типів, придатні для клітин рослини; численні їх приклади можна знайти в збірнику Okamuro та Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15:1 82. Також повинно бути очевидно, що оскільки в більшості випадків точні границі регуляторних послідовностей повністю не визначені, молекули ДНК із деякими варіаціями можуть мати ідентичну промоторну активність. Рекомбінантний: У даній заявці, термін "рекомбінантний" відноситься до штучному з'єднанню двох в іншому випадку окремих фрагментів послідовності, наприклад, шляхом хімічного синтезу або шляхом маніпулювання над виділеними фрагментами нуклеїнових кислот за допомогою методик генної інженерії. Рекомбінантна конструкція, експресійна конструкція та рекомбінантна експресійна конструкція: Формулювання "рекомбінантна конструкція", "експресійна конструкція" та "рекомбінантна експресійна конструкція" використовують взаємозамінно в даному описі, та вони відносяться до функціональних одиниць генетичного матеріалу, які можна вставити в геном клітини, застосовуючи стандартну методику, добре відому фахівцеві в даній галузі. Таку конструкцію можна застосовувати саму по собі або разом з вектором. Якщо використовують вектор, тоді вибір вектору залежить від способу, який буде використовуватися для трансформування рослин-хазяїв, що добре відомо фахівцям у даній галузі. Наприклад, можна застосовувати плазмідний вектор. Кваліфікований фахівець добре обізнаний у генетичних елементах, які повинні бути присутніми у векторі для успішної трансформації, селекції та розмноження клітин-хазяїв, що містять будь-яку з виділених молекул нуклеїнових кислот згідно даного опису. Для кваліфікованого фахівця також повинно бути очевидно, що різні незалежні події трансформації приведуть до різних рівнів та паттернів експресії (Jones та ін., (1985) EMBO J. 4:2411 2418; De Almeida та ін., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78 86), і, отже, що потрібно здійснити скринінг багатьох подій для одержання ліній, що мають бажаний рівень та паттерн експресії. Такий скринінг можна здійснити шляхом аналізу ДНК по Саузерну, Нозерн-аналізу експресії мРНК, аналізу методом вестерн-блот експресії білку або фенотипового аналізу. РНК-транскрипт, інформаційна РНК, кДНК, функціональна РНК та ендогенна РНК: У даному описі, формулювання “ РНК-транскрипт" відноситься до продукту, що виник у результаті транскрипції послідовності ДНК, що каталізується РНК-полімеразою. Якщо РНК-транскрипт являє собою ідеально комплементарну копію послідовності ДНК, його називають первинним транскриптом, або РНК-транскрипт може являти собою послідовність РНК, отриману в результаті післятранскрипційного процесингу первинного транскрипту, тоді його називають зрілою РНК. У даній заявці, формулювання "інформаційна РНК (мРНК)” відноситься до РНК, яка не містить інтронів та яка може транслюватися в білок у клітині. У даній заявці, термін "кДНК" відноситься до ДНК, яка синтезована по матриці мРНК за допомогою ферменту зворотної траскриптази та комплементарна їй. кДНК може бути одноланцюговою, або її можна перетворити у двониткову форму, застосовуючи фрагмент Кленова ДНК-полімерази I. "Значеннєва" РНК відноситься до РНК-транскрипту, який включає мРНК та може транслюватися в білок всередині клітини або in vitro. "Антизначеннєва РНК" відноситься до РНК-транскрипту, який комплементарний всьому цільовому первинному транскрипту, або мРНК, або її частини, який блокує експресію цільового гену (патент США номер 5107065). Комплементарність антизначеннєвої РНК може спостерігатися з будь-якою ділянкою транскрипту певного гену, тобто, з 5'-некодируючою послідовністю, 3'-некодуючою послідовністю, з інтронами або з кодуючею послідовністю. У даному описі, формулювання "функціональна РНК" відноситься до антизначеннєвої РНК, рибозиму РНК або іншої РНК, яка може не транслюватися, але незважаючи на це, впливає на клітинні процеси. Терміни "комплемент" та "зворотний комплемент" використовують взаємозамінно в даному описі по відношенню до мРНК-транскриптів, та вони призначені для визначення антизначеннєвої РНК по відношенню до інформаційної. У даній заявці, формулювання "ендогенна РНК" відноситься до будь-якої РНК, яка кодується будь-якою послідовністю нуклеїнових кислот, що присутня у геномі хазяїна, перед трансформуванням рекомбінантною конструкцією згідно даного опису, або такою, що зустрічається в природі, або такою, що не зустрічається в природі, тобто, введеною за допомогою рекомбінантних засобів, мутагенезу та т.д. Подібність: Термін "подібність", якщо він використовується для опису "подібності" між двома 10 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностями амінокислот, білками або поліпептидами, відноситься до присутності деякої кількості ідентичних, а також консервативних амінокислотних залишків в обох послідовностях. Чим вище ступінь подібності між двома послідовностями амінокислот, тим більше відповідність, подібність або еквівалентність двох послідовностей. Стабільна трансформація, тимчасова трансформація та трансформація: У даній заявці, формулювання "стабільна трансформація" відноситься до переносу молекули нуклеїнової кислоти в геном організму хазяїна, включаючи як геном ядра, так і геном органелл, що приводити до генетично стабільного спадкування. Навпаки, у даній заявці формулювання "тимчасова трансформація" відноситься до переносу молекули нуклеїнової кислоти в ядро або в утримуючу ДНК органеллу організму хазяїна, що приводити до експресії гену без вбудовування в геном або стабільного спадкування. Організми хазяїна, трансформовані молекулами нуклеїнових кислот, називають "трансгенними" організмами. Кращий спосіб трансформування клітин рису, кукурудзи та інших однодольних являє собою спосіб трансформування за допомогою прискорення часток або "генної гармати" (Klein та ін., (1987) Nature (Лондон) 327:70 73; патент США номер 4945050), або спосіб, опосередкований Agrobacterium, із застосуванням підходящої Ti-плазміди, що містить трансген (Ishida Y. та ін., (1996) Nature Biotech. 14:745 750). У даній заявці, термін "трансформація" відноситься як до стабільної трансформації, так і до тимчасової трансформації. Послідовність, що напрямляє трансляцію: У даній заявці, формулювання "послідовність, що напрямляє трансляцію" відноситься до послідовностей ДНК, розташованих між промоторною послідовністю гену та кодуючою послідовністю. Послідовність, що напрямляє трансляцію, присутня у повністю процесованій мРНК та розташована проти ходу транскрипції від послідовності, що ініціює трансляцію. Послідовність, що напрямляє трансляцію, може впливати на процесинг первинного транскрипту до мРНК, на стабільність мРНК або на ефективність трансляції. Приклади напрямних трансляцію послідовностей описані в Turner, R. та Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225. Усі патенти, публікації патентів та пріоритетні документи, цитовані в даному описі, повністю включені в дану заявку за допомогою посилання. Ген дельта-9-елонгази та кодований ним фермент Фермент, що кодується геном дельта-9-елонгази згідно даного опису, незамінний для одержання (за допомогою альтернативного шляху за участю дельта-8-десатурази/ дельта-9елонгази) довголанцюгових поліненасичених жирних кислот (ДЛ-ПНЖК), що мають довжину 20 або більше атомів вуглецю. Послідовність нуклеотидів виділеного гену дельта-9-елонгази CCMP 2916 Euglena deses Ehr. показана на Фігурі 7A, та прогнозована послідовність амінокислот відповідного білку показана на Фігурі 7B. Перетворення ЛК у ДГЛК та АЛК в омега-3-ЕТК за допомогою ферменту дельта-9-елонгази та ферменту дельта-8-десатурази називають альтернативним шляхом за участю дельта-8десатурази/дельта-9-елонгази. У звичайному дельта-6-шляху перетворення ЛК у ДГЛК та АЛК в омега-3-ЕТК, фермент дельта-6-десатуразу застосовують для перетворення ЛК у ГЛК та АЛК у СДК, а дельта-6-елонгазу застосовують для перетворення ГЛК у ДГЛК, та СДК в омега-3-ЕТК, відповідно. У кожному шляху, одержання АРК або ЕПК потім каталізується, наприклад, дельта5-десатуразою. ДГК, наприклад, можна одержати шляхом перетворення ЕПК в омега-3докозапентаєнову кислоту (ДПК), а потім омега-3-докозапентаєнової кислоти в ДГК, застосовуючи, наприклад, дельта-5-елонгазу та дельта-4-десатуразу, відповідно. Хоча, наприклад, ДГЛК, омега-3-ЕТК, АРК, ЕПК, омега-3-докозапентаєнову кислоту, омега-6докозапентаєнову кислоту, АДК та/або ДГК можна одержати за допомогою будь-якого з альтернативних шляхів за участю дельта-8-десатурази/ дельта-9-елонгази або за допомогою звичайного дельта-6-шляху, у деяких випадках, альтернативний шлях за участю дельта-8десатурази/дельта-9-елонгази може виявитися кращим у порівнянні зі звичайним дельта-6шляхом. Наприклад, якщо небажане утворення певних залишкових інтермедіатів омега-6 або омега-3 жирних кислот, таких як ГЛК або СДК, при одержанні ДГЛК, омега-3-ЕТК, АРК, ЕПК, омега-3-докозапентаєнової кислоти, омега-6-докозапентаєнової кислоти, АДК та/або ДГК, можна використовувати альтернативний шлях за участю дельта-8-десатурази/ дельта-9елонгази в якості альтернативи звичайному дельта-6-шляху, щоб уникнути утворення ГЛК та СДК. Вище обговорювалося, що дельта-9-елонгаза являє собою фермент, необхідний для альтернативного шляху синтезу за участю дельта-8-десатурази/дельта-9-елонгази. ЕПК, наприклад, не може бути синтезована за допомогою альтернативного шляху за участю дельта8-десатурази/ дельта-9-елонгази у відсутності гену дельта-9-елонгази та ферменту, що 11 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 кодується ним. На Фігурі 1 показано, що виділений фермент дельта-9-елонгаза згідно даного винаходу перетворює, наприклад, АЛК в омега-3-ЕТрК та ЛК в омега-6-ЕДК. Одержання омега3-ЕТК з омега-3-ЕТрК та ЕПК з омега-3-ЕТК потім каталізується, наприклад, дельта-8десатуразою та дельта-5-десатуразою, відповідно. Завдяки використанню альтернативного шляху за участю дельта-8-десатурази/ дельта-9-елонгази, можна виключити утворення інтермедіатів жирних кислот ГЛК та СДК. Слід відмітити, що в обсяг даного винаходу також входять нуклеотидній послідовності (і відповідні кодовані ними білки), що являють собою послідовності, що включають, складаються або комплементарні щонайменше 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % нуклеотидів у послідовності (тобто, що мають ідентичністю послідовності) з SEQ ID NO: 17 (тобто, виділеної нуклеотидної послідовності гену дельта-9-елонгази CCMP 2916 Euglena deses Ehr.) або з SEQ ID NO: 19 (тобто, варіантом гену дельта-9-елонгази CCMP 2916 Euglena deses Ehr.). Такі послідовності можна одержати від людини, а також з інших джерел, що не відносяться до людини (наприклад, з C. elegans або миші). Більше того, в обсяг даного винаходу також входять фрагменти та похідні, що включають або складаються із нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 17 (показаної на Фігурі 7A) або SEQ ID NO: 19 (показаної на Фігурі 8A)), а також з послідовностей, отриманих з інших джерел та таких, що мають описані вище властивості комплементарності або відповідності. Функціональні еквіваленти описаних послідовностей (тобто, послідовностей, що мають дельта-9-елонгазнц активність) також входять в обсяг даного опису. Фрагменти, отримані з SEQ ID NO: 17 або SEQ ID NO: 19, можуть включати або складатися з від 10 до приблизно 780 нуклеотидів, від 10 до приблизно 700 нуклеотидів, від 10 до приблизно 650 нуклеотидів, від 10 до приблизно 500 нуклеотидів, від 10 до приблизно 250 нуклеотидів, від 10 до приблизно 100 нуклеотидів, від 10 до приблизно 50 нуклеотидів або від 15 до 40 нуклеотидів. В одному аспекті, фрагменти послідовностей SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19 кодують поліпептид, що має дельта-9-елонгазну активність. В іншому аспекті, фрагменти послідовностей SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19 можна застосовувати як праймери та зонди. Способи одержання праймерів та зондів добре відомі фахівцям у даній галузі. Довжина таких праймерів та зондів може досягати від 10 до 50 нуклеотидів, переважно від 15 до 40 нуклеотидів. Варіанти послідовностей нуклеотидів SEQ ID NO: 17 або SEQ ID NO: 19 також передбачені в даній заявці. Такі варіанти можуть включати вставки, заміни або делеції однієї або більше пар основ. Необмежуючі приклади варіантів нуклеотидній послідовності SEQ ID NO: 17, що входять в обсяг даного опису, показані в Таблиці A нижче. Один конкретний приклад варіанту послідовності SEQ ID NO: 17 являє собою послідовність SEQ ID NO: 19 (див. Фігуру 8A). Таблиця A Заміни в нуклеотидній послідовності (SEQ ID NO: 17  SEQ ID NO: 19) GCT24  GCC24 GC83C  GT83C G232TA  A232TA A301TG  T301TG C310TC  A310TC ACA630  ACT630 AAA750  AAG750 40 45 В обсяг даного винаходу також входять нуклеотидній послідовності з інших джерел, які мають описані вище властивості комплементарності або відповідності послідовності SEQ ID NO: 17 або SEQ ID NO: 19. Функціональні еквіваленти SEQ ID NO: 17 або SEQ ID NO: 19 (тобто, послідовності, що мають дельта-9-елонгазну активність) також входять в обсяг даного опису. В обсяг даного винаходу також входять нуклеотидній послідовності або фрагменти зазначених послідовностей, кодуючі поліпептид, що має дельта-9-елонгазну активність, при цьому послідовність амінокислот зазначеного поліпептиду ідентична на щонайменше 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % послідовності амінокислот, що включає SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 20. Такі послідовності 12 UA 107468 C2 5 10 15 20 можна одержати з людини, а також з інших джерел, що не відносяться до людини (наприклад, з C. elegans або миші). В обсяг даного винаходу також входить виділений та/або очищений поліпептид, який подовжує поліненасичені жирні кислоти, що містять елемент ненасиченості в положенні атому вуглецю 9 (тобто, має дельта-9-елонгазну активність) та послідовність якого подібна або ідентична щонайменше на 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % послідовності амінокислот SEQ ID NO: 18 (показаній на Фігурі 7B) або SEQ ID NO: 20 (показаній на Фігурі 8B)). Зокрема, в обсяг даного винаходу входить очищений поліпептид, що має послідовність амінокислот SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 20. Фрагменти поліпептиду, що має послідовність SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 20, також передбачені в даній заявці. Такі фрагменти можуть включати або складатися з від 10 до приблизно 260 послідовних амінокислот, від 10 до приблизно 200 послідовних амінокислот, від 10 до приблизно 100 послідовних амінокислот, від 10 до приблизно 50 послідовних амінокислот, від 10 до приблизно 40 послідовних амінокислот, від 10 до приблизно 30 послідовних амінокислот або від 10 до приблизно 20 послідовних амінокислот. Варіанти поліпептиду, що має послідовність SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 20, також передбачені в даній заявці. Такі варіанти можуть включати одну або більше вставок, замін або делецій амінокислот. Необмежуючі приклади варіантів послідовності амінокислот SEQ ID NO: 18, що входять в обсяг даного опису, показані в Таблиці B нижче. Один конкретний приклад варіанту послідовності SEQ ID NO: 18 являє собою SEQ ID NO: 20 (див. Фігуру 8B). Таблиця B Заміни в послідовності амінокислот (SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 20) A28  V28 V78  I78 M101  L101 L104  I104 25 30 35 40 45 50 Одержання ферменту дельта-9-елонгази Після того, як нуклеїнова кислота (наприклад, ген), кодуюча фермент дельта-9-елонгазу була виділена та/або очищена, її можна ввести або в прокаріотичну, або в еукаріотичну клітинухазяїна за допомогою вектору або конструкції. Зазначений вектор, наприклад, бактеріофаг, косміда або плазміда, може містять нуклеотидну послідовність, що кодує фермент дельта-9елонгазу, а також будь-яку регуляторну послідовність (наприклад, промотор), яка здатна функціонувати в клітині-хазяїні та здатна викликати експресію дельта-9-елонгази, що кодується зазначеною послідовністю нуклеотидів. Регуляторна послідовність знаходиться у функціональному зв'язку або функціонально пов'язана з нуклеотидною послідовністю (вище відзначено, що "регуляторний" означає "функціонально зв'язаний" з кодуючою послідовністю, якщо регуляторна послідовність впливає на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності). Підходящі промотори включають, наприклад, промотори генів, що кодують алкогольдегідрогеназу, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу, фосфоглюкоізомеразу, фосфогліцераткіназу, кислу фосфатазу, промотор T7, промотор TPI, промотори генів, що кодують лактазу, металотіонеін, передранній промотор цитомегаловірусу, промотори генів, що кодують кислий білок молочної сироватки, глюкоамілазу, та промотори, що активуються в присутності галактози, наприклад, GAL1 та GAL10. Крім того, у вектор також можна ввести нуклеотидній послідовності, які кодують інші білки, олігосахариди, ліпіди та т.п., а також інші регуляторні послідовності, такі як сигнал поліаденілювання (наприклад, сигнал поліаденілювання (полі-А) SV-40T-антигену, овальбуміну або гормону росту великої рогатої худоби). Вибір послідовностей, присутніх у конструкції, залежить від продуктів, які необхідно експресувати, а також від природи клітини-хазяїна. Вище відзначено, що як тільки вектор був сконструйований, його можна ввести у вибрану клітину-хазяїна за допомогою способів, відомих середнім фахівцям у даній галузі, включаючи, наприклад, трансфекцію, трансформацію та електропорацію (див. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е вид., том 1-3, ред. Sambrook та ін., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Клітину-хазяїна потім культивують при підходящих умовах, що дозволяють експресію генів, що приводити до продукції клітиною бажаних ПНЖК, які потім витягають та очищають за допомогою звичайних методик, відомих у даній галузі. 13 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклади підходящих прокаріотичних клітин-хазяїв включають, але не обмежені перерахованими, бактерії, такі як Escherichia coli, Bacillus subtilis, а також ціанобактерії, такі як Spirulina spp. (тобто синьо-зелені водорості). Еукаріотична клітина, наприклад, може являти собою клітину ссавця, клітину комахи, клітину рослини або клітину гриба. Клітина гриба може являти собою, наприклад, Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Trichoderma spp. або Pichia spp. Зокрема, клітина гриба може являти собою клітину дріжджів, наприклад, таку як Saccharomyces spp., Candida spp., Hansenula spp. та Pichia spp. Клітина дріжджів також може являти собою клітину Saccharomyces cerevisiae. Клітина рослини включає, але не обмежена клітинами олійних рослин, таких як Glycine max (наприклад, сої), видів Brassica, Carthamus tinctorius L. (наприклад, сафлору), Helianthus annus (наприклад, соняшнику), Zea mays (наприклад, кукурудзи), видів Gossypium (наприклад, бавовнику) та Linum usitatissimum (наприклад, льону). Можна добитися тимчасової або стабільної експресії в клітині-хазяїні. Можна здійснити тимчасову експресію з введених конструкцій, які містять сигнали експресії, що функціонують у клітині-хазяїні, при цьому зазначені конструкції не реплікуються та рідко вбудовуються в клітинухазяїна, або якщо клітина-хазяїн не проліферує. Тимчасову експресію також можна здійснити шляхом стимуляції активності регульованого промотору, функціонально пов'язаного з геном, що цікавить, хоча в таких індукованих систем часто виявляють низький основний рівень експресії. Стабільної експресії можна добитися шляхом впровадження конструкції, яка може вбудовуватися в геном хазяїна або яка автономно реплікується в клітині-хазяїні. Можна здійснити селекцію клітин, стабільно експресуючих ген, що цікавить, шляхом застосування селекційного маркеру, розташованого на експресійній конструкції або трансфікованого разом з нею, а потім селекції клітин, експресуючих зазначений маркер. Якщо стабільна експресія відбувається в результаті вбудовування, місце вбудовування конструкції в геном хазяїна може бути довільним, або його можна вибрати заздалегідь шляхом застосування конструкцій, що містять ділянки гомології з геномом хазяїна, підходящі для спрямованої рекомбінації з відповідним локусом хазяїна. Якщо конструкції призначені для вбудовування в ендогенний локус, усі або деякі з регуляторних областей транскрипції та трансляції можуть забезпечуватися зазначеним ендогеннимлокусом. Для експресії ферменту дельта-9-елонгази та, в остаточному підсумку, ПНЖК, що цікавить(ять), також можна використовувати трансгенного ссавця. Зокрема, як тільки була створена описана вище конструкція, її можна впровадити в пронуклеус зародку. Зародок потім можна імплантувати у реципієнтну самицю. У якості альтернативи, також можна застосовувати спосіб передачі ядра (Schnieke та ін., Science 278:2130-2133 (1997)). Потім дозволяють вагітності та родам йти природнім шляхом (див., наприклад, патент США номер 5750176 та патент США номер 5,700,671). Зразки молока, тканин або інших рідин організму потомства повинні містити змінені рівні ПНЖК, у порівнянні з рівнями, що звичайно виявляються у нетрансгенної тварини. Потім можна контролювати продукцію змінених або підвищених рівнів ПНЖК у наступних поколінь і, таким чином, контролювати впровадження в їх геноми гену, що кодує бажаний фермент десатуразу. Ссавця, використовуваного як хазяїна, можна вибрати із групи, що складається, наприклад, з миші, щура, кролика, свині, кози, вівці, коня та корови. Проте, можна використовувати будь-якого ссавця, за умови, що він має здатність приймати у свій геном ДНК, що кодує фермент, який цікавить. Для експресії поліпептиду дельта-9-елонгази, функціональні ділянки ініціації та термінації транскрипції та трансляції функціонально зв'язують із ДНК, що кодує поліпептид елонгази. Ділянки ініціації та термінації транскрипції та трансляції отримують із безлічі невиняткових джерел, включаючи ДНК, яку потрібно експресувати, гени, про які відомо або передбачається, що вони здатні експресуватися в бажаній системі, вектори експресії, ділянки, отримані шляхом хімічного синтезу; або з ендогенного локусу клітини-хазяїна. Експресія в тканині рослини та/або частині рослини відбувається з деякою ефективністю, особливо якщо тканина або частина рослини являє собою таку тканину або частину, яку збирають рано, наприклад, насіння, листя, фрукти, квіти, коріння та т.д. Експресію в певній частині рослини можна забезпечити шляхом застосування специфічної регуляторної послідовності, такої як регуляторні послідовності, описані в патентах США з номерами 5463174, 4943674, 5106739, 5175095, 5420034, 5188958 та 5589379. У якості альтернативи, експресований білок може являти собою фермент, який викликає утворення продукту, який може впроваджуватися, або безпосередньо, або після додаткових модифікацій, у фракцію соку рослини-хазяїна. Експресія гену дельта-9-елонгази, або антизначеннєвих транскриптів дельта-9-елонгази, може змінювати рівні певних ПНЖК, або їх 14 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 похідних, що виявляються в частинах рослини та/або в тканинах рослини. Ділянку, що кодує поліпептид дельта-9-елонгази, можна експресувати або окремо, або разом з іншими генами (наприклад, з геном, що кодує дельта-8-десатуразу, геном, що кодує дельта-5-десатуразу, геном, що кодує дельта-17-десатуразу, геном, що кодує дельта-5елонгазу та/або геном, що кодує дельта-4-десатуразу), для одержання таких тканин та/або частин рослини, які містять великі кількості бажаних ПНЖК, або в яких склад ПНЖК найбільш близько нагадує такий в грудному молоці людини (див. WO 95/24494). Термінатор можна одержати з 3’-області гену, з якого була отримана ділянка ініціації, або з відмінного гену. Відомо велике число термінаторів, які виявилися досить підходящими для безлічі хазяїв того ж та відмінного роду та виду. Термінатор звичайно вибирають із погляду зручності, а не завдяки якійнебудь конкретній властивості. Вище відзначене, що рослину (наприклад, Glycine max (соя) або Brassica napus (канола)) або тканину рослини також можна використовувати як хазяїн або клітину-хазяїн, відповідно, для експресії ферменту дельта-9-елонгази, який, у свою чергу, можна застосовувати для одержання поліненасичених жирних кислот. Зокрема, бажані ПНЖК можна експресувати у насінні. Способи одержання олій з насіння відомі в даній галузі. Таким чином, на додаток до забезпечення джерела ПНЖК, можна впливати на компоненти олій з насіння шляхом експресії гену дельта-9елонгази, а також, можливо, генів десатураз (наприклад, дельта-8-десатурази, дельта-17десатурази, дельта-5-десатурази, дельта-4-десатурази та т.д.) та генів інших елонгаз (наприклад, дельта-5-елонгази та т.д.), щоб одержати олії з насіння, які можна додати в харчові композиції, фармацевтичні композиції, корм для тварин та косметичні засоби. Знову ж, вектор, який містить послідовність ДНК, що кодує дельта-9-елонгазу, функціонально зв'язану з промотором, будуть вводити в тканину рослини або рослину на якийсь час та за умов, достатніх для експресування гену дельта-9-елонгази. Зазначений вектор також може містити один або більше генів, які кодують інші ферменти, наприклад, дельта-4-десатуразу, дельта-5-десатуразу, дельта-6-десатуразу, дельта-10-десатуразу, дельта-12-десатуразу, дельта-15-десатуразу, дельта-17-десатуразу, дельта-19-десатуразу, дельта-6-елонгазу та/або дельта-5-елонгазу. Тканина рослини або рослина можуть продукувати підходящий субстрат, на який діють ферменти, або можна ввести в тканину рослини, клітину рослини або рослину вектор, що кодує ферменти, який продукує такі субстрати. На додаток, субстрат можна розпорошити на тканині рослини експресуючі підходящі ферменти. Шляхом застосування цих різних методик, можна одержати ПНЖК, використовуючи клітини рослини, тканину рослини або рослину. Також слід відмітити, що в обсяг даного винаходу також входить трансгенна рослина, що містить описаний вище вектор, у якому експресія нуклеотидної послідовності зазначеного вектору приводити до одержання поліненасиченої жирної кислоти, наприклад, у насінні трансгенної рослини. Регенерація, розвиток та культивування рослин з окремих трансформованих протопластів рослини або з різних трансформованих експлантатів добре відомо в даній галузі (Weissbach та Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (ред.), Academic Press, Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, (1988)). Даний процес регенерації та росту звичайно включає етапи селекції трансформованих клітин, культивування цих окремих клітин шляхом проходження ними звичайних стадій ембріонального розвитку, зокрема, стадії пагону, що корениться. Трансгенні зародки та насіння регенерують аналогічним способом. Отримані в результаті цього трансгенні пагони, що кореняться, згодом висаджують у підходяще середовище для вирощування рослин, таке як ґрунт. Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний, екзогенний ген, який кодує білок, що цікавить, добре відомі в даній галузі. Переважно, регенеровані рослини піддають самозапиленню для одержання гомозиготних трансгенних рослин. А якщо ні, тоді, пилок, отриманий з регенерованих рослин, схрещують із вирощуваними з насіння рослинами агрономічно важливих ліній. Як альтернатива, пилок з рослин даних важливих ліній використовують для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину згідно даного опису, що містить бажаний поліпептид, культивують, застосовуючи способи, добре відомі фахівцеві в даній галузі. Існує безліч способів регенерації рослин із тканини рослини. Конкретний спосіб регенерації буде залежати від вихідної тканини рослини та конкретного виду рослини, яку потрібно регенерувати. Способи трансформування дводольних рослин, головним чином, шляхом застосування Agrobacterium tumefaciens, та одержання трансгенних рослин були опубліковані для бавовнику (патент США номер 5004863, патент США номер 5159135, патент США номер 5518908); сої (патент США номер 5569834, патент США номер 5416011, Mccabe та ін., Bioltechnology 6:923 (1988), Christou та ін., Plant Physiol. 87:671 674 (1988)); Brassica (патент США номер 5463174); 15 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 земляного горіха (Cheng та ін., Plant Cell Rep. 15:653 657 (1996), Mckently, та ін., Plant Cell Rep. 14:699 703 (1995)); папайї та гороху (Grant та ін., Plant Cell Rep. 15:254 258, (1995)). Також було опубліковане трансформування однодольних рослин із застосуванням електропорації, бомбардування частками та Agrobacterium. Трансформування та регенерації рослин вдалося добитися для спаржі (Bytebier та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. (США) 84:5354, (1987)); ячменю (Wan та Lemaux, Plant Physiol 104:37 (1994)); Zea mays (Rhodes та ін., Science 240:204 (1988), Gordon-Kamm та ін., Plant Cell, 2:603 618 (1990), Fromm та ін., Bioltechnology 8:833 (1990), Koziel та ін., Bioltechnology 11: 194, (1993), Armstrong та ін., Crop Science 35:550 557 (1995)); вівса (Somers та ін., Bioltechnology 10:15 89 (1992)); ежі збірної (Horn та ін., Plant Cell Rep. 7:469 (1988)); рису (Toriyama та ін., Theorappl. Genet. 205:34, (1986); Part та ін., Plant Mol. Biol. 32:1135 1148, (1996); Abedinia та ін., Aust. J. Plant Physiol. 24:133 141 (1997); Zhang та Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835 (1988); Zhang та ін. Plant Cell Rep. 7:379, (1988); Battraw та Hall, Plant Sci. 86:191 202 (1992); Christou та ін., Bio/Technology 9:957 (1991)); жита (De la Pena та ін., Nature 325:274 (1987)); цукрової тростини (Bower та Birch, Plant J. 2:409 (1992)); вівсяниці гігантської (Wang та ін., Bioltechnology 10:691 (1992)) та пшениці (Vasil та ін., Bio/Technology 10:667 (1992); патент США номер 5631152). Були розроблені аналізи експресії генів, виходячи з тимчасової експресії клонованих конструкцій нуклеїнових кислот, шляхом введення молекул нуклеїнових кислот у клітини рослини за допомогою обробки поліетиленгліколем, електропорації або бомбардування частками (Marcotte та ін., Nature 335:454 457 (1988); Marcotte та ін., Plant Cell 1:523 532 (1989); Mccarty та ін., Cell 66:895 905 (1991); Hattori та ін., Genes Dev. 6:609 618 (1992); Goff та ін., EMBO J. 9:2517 2522 (1990)). Можна застосовувати системи тимчасової експресії для делеційного аналізу генних конструкцій (див., в основному, Maliga та ін., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Повинно бути очевидно, що будь-які з молекул нуклеїнових кислот згідно даного винаходу можна ввести в клітину рослини для постійної або тимчасової експресії в комбінації з іншими генетичними елементами, такими як вектори, промотори, енхансери тощо. На додаток до описаних вище процедур фахівці, що практикують, також знайомі зі стандартними джерелами, у яких описані конкретні умови та процедури для конструювання, маніпулювання та виділення макромолекул (наприклад, молекул ДНК, плазмід та т.д.), одержання рекомбінантних організмів та скринінгу та виділення клонів (див., наприклад, Sambrook та ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga та ін., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren та ін., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Колд Спрінг Харбор, Нью-Йорк (1998); Birren та ін., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Колд Спрінг Харбор, Нью-Йорк (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, ред. Clark, Springer, Нью-Йорк (1997)). Субстрати, які може продукувати клітина-хазяїн або по природі, або в результаті введення трансгену, а також ферменти, які можуть кодуватися послідовностями ДНК, присутніми у векторі, який згодом вводять у клітину-хазяїна, показані на Фігурі 1. Беручи до уваги зазначене вище, в обсяг даного винаходу входить спосіб одержання ферменту дельта-9-елонгази, що включає наступні етапи: 1) виділення нуклеотидної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше 68 % нуклеотидній послідовності, що кодує фермент дельта-9-елонгазу (наприклад, нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19); 2) конструювання вектору експресії, що містить зазначену нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з регуляторною послідовністю; та 3) введення зазначеного вектору в клітину-хазяїна на час та за умов, які достатні для одержання ферменту дельта-9-елонгази. В обсяг даного винаходу також входить спосіб одержання поліненасичених жирних кислот. В одному аспекті, зазначений спосіб включає: 1) виділення нуклеотидної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше 68 % нуклеотидній послідовності, що кодує фермент дельта-9-елонгазу (наприклад, нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19); 2) конструювання вектору експресії, що містить зазначену нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з регуляторною послідовністю; 3) введення зазначеного вектору експресії в клітину-хазяїна на час та за умов, достатніх для одержання ферменту дельта-9-елонгази; та 4) забезпечення взаємодії зазначеної експресованої дельта-9-елонгази з поліненасиченою жирною кислотою субстратом з тім, щоб перетворити зазначену поліненасичену жирну кислоту- субстрат у першу поліненасичену жирну кислоту - продукт. Приклади ПНЖК субстрату включають ЛК, АЛК та комбінації перерахованих жирних кислот. Приклади першої поліненасиченої жирної кислоти - продукту, яку можна одержати за допомогою даного способу, являють собою омега-6-ЕДК, омега-3-ЕТрК або обидві 16 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жирні кислоти омега-6-ЕДК та омега-3-ЕТрК. Наприклад, якщо ЛК піддають впливу ферменту дельта-9-елонгази, вона перетворюється в омега-6-ЕДК. В іншому прикладі, якщо АЛК піддають впливу ферменту дельта-9-елонгази, вона перетворюється в омега-3-ЕТрК. Зазначений спосіб може додатково включати етап(и) впливу на зазначену першу поліненасичену жирну кислоту - продукт щонайменше однієї десатурази, щонайменше однієї додаткової елонгази або комбінаціями перерахованих ферментів, та можливо повторення даного етапу (тобто, вплив на другі або наступні поліненасичені жирні кислоти - продукти десатурази або елонгази (яка може бути такою ж або відмінною від будь-якої використаної раніше десатурази або елонгази) для перетворення зазначеної першої поліненасиченої жирної кислоти - продукту у другу або наступну (наприклад, третю, четверту, п'яту, шосту та т.д.) поліненасичену жирну кислоту - продукт). Даний етап можна повторити стільки разів, скільки необхідно, доти, поки не одержать бажану поліненасичену жирну кислоту - продукт. Наприклад, якщо перша поліненасичена жирна кислота - продукт являє собою омега-6-ЕДК, зазначений спосіб може додатково включати вплив на омега-6-ЕДК, наприклад, дельта-8-десатуразою, яка перетворює омега-6-ЕДК у ДГЛК (друга поліненасичена жирна кислота - продукт). ДГЛК потім при необхідності можна перетворити в АРК (третю поліненасичену жирну кислоту - продукт) шляхом впливу на ДГЛК, наприклад, дельта-5-десатуразою. АРК потім можна піддати впливу дельта-17-десатурази для одержання ЕПК (четвертої поліненасиченої жирної кислотипродукту). Більше того, при необхідності ЕПК можна піддати впливу дельта-5-елонгази для одержання ДПК (п'ятої поліненасиченої жирної кислоти - продукту). ДПК потім при необхідності можна піддати впливу дельта-4-десатурази для одержання ДГК (шостої поліненасиченої жирної кислоти - продукту). В іншому прикладі, якщо перша поліненасичена жирна кислота - продукт являє собою омега-3-ЕТрК, зазначений спосіб може додатково включати вплив на омега-3ЕТрК, наприклад, дельта-8-десатуразою, яка перетворює омега-3-ЕТрК в ЕТК (другу поліненасичену жирну кислоту - продукт). ЕТК потім можна перетворити в ЕПК (третю поліненасичену жирну кислоту - продукт) шляхом впливу на ЕТК, наприклад, дельта-5десатуразою. ЕПК можна додатково перетворити в інші поліненасичені жирні кислоти, описані вище. В іншому аспекті, зазначений спосіб включає: 1) виділення нуклеотидної послідовності, яка включає або комплементарна щонайменше на 68 % нуклеотидній послідовності, що кодує фермент дельта-9-елонгазу (наприклад, нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO: 17 та SEQ ID NO: 19); 2) конструювання вектору експресії, що містить зазначену виділену нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану з регуляторною послідовністю; 3) введення зазначеного вектору експресії та щонайменше однієї додаткової конструкції рекомбінантної ДНК, що містить виділену нуклеотидну послідовність, що кодує дельта-8-десатуразу та функціонально зв'язану з щонайменше однією регуляторною послідовністю, в клітину-хазяїна на час та за умов, які достатні для експресії дельта-9-елонгази та дельта-8-десатурази; та 4) забезпечення взаємодії зазначеної експресованої дельта-9елонгази та дельта-8-десатурази з поліненасиченою жирною кислотою-субстратом, вибраною з групи, що складається з ЛК, АЛК та комбінації перерахованих жирних кислот з тим, щоб перетворити зазначену поліненасичену жирну кислоту – субстрат в першу поліненасичену жирну кислоту - продукт. Приклади першої поліненасиченої жирної кислоти - продукту включають ДГЛК, омега-3-ЕТК та комбінації перерахованих жирних кислот. Більше того, зазначений спосіб може додатково включати етап(и) впливу на першу поліненасичену жирну кислоту - продукт щонайменше однієї додаткової десатурази або щонайменше однієї додаткової елонгази та, можливо, повторення даного етапу (тобто, здійснення впливу на зазначені другу або наступну поліненасичену жирну кислоту - продукт десатурази або елонгази (яка може бути такою ж або відмінною від будь-якої десатурази або елонгази, використаної раніше)) для перетворення першої поліненасиченої жирної кислоти - продукту (наприклад, ДГЛК та/або омега-3-ЕТК) у другу або наступну (наприклад, третю, четверту, п'яту, шосту та т.д.) поліненасичену жирну кислоту - продукт. Даний етап можна повторити декілька разів, скільки необхідно, до тих пір, поки не отримають бажану поліненасичену жирну кислоту - продукт. В одному аспекті, зазначений спосіб додатково включає введення в зазначену клітину-хазяїна конструкції рекомбінантної ДНК, що містить виділену нуклеотидну послідовність, що кодує дельта-5-десатуразу, функціонально зв'язану з регуляторною послідовністю. Таким чином, дельта-9-елонгазу можна застосовувати для одержання поліненасичених жирних кислот, які, в свою чергу, можна застосовувати для певних корисних цілей або можна застосовувати для одержання інших ПНЖК. Застосування гену дельта-9-елонгази Вище відмічено, що виділений ген дельта-9-елонгази та фермент дельта-9-елонгаза, що 17 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодується даним геном, можуть мати багато застосувань. Наприклад, зазначений ген та відповідний фермент можна застосовувати безпосередньо або опосередковано одержання поліненасичених жирних кислот, наприклад, дельта-9-елонгазу можна застосовувати для одержання омега-6-ЕДК, омега-3-ЕТрК, ДГЛК, омега-3-ЕТК, АРК, ЕПК, омега-3докозапентаєнової кислоти, омега-6-докозапентаєнової кислоти, АДК та/або ДГК. Мають на увазі, що в обсяг терміна "безпосередньо" входить випадок, коли фермент безпосередньо перетворює зазначену кислоту в іншу кислоту, останню з яких використовують у композиції (наприклад, перетворення ЛК в омега-6-ЕДК). Мають на увазі, що в обсяг терміну "опосередковано" входить випадок, коли кислота перетворюється в іншу кислоту (тобто, у проміжний продукт шляху синтезу) під впливом ферменту (наприклад, ЛК в омега-6-ЕДК), а потім останню кислоту перетворюють в іншу кислоту за допомогою ферменту, що не є елонгазою (наприклад, омега-6-ЕДК у ДГЛК, наприклад, за допомогою дельта-8-десатурази). Дані поліненасичені жирні кислоти (тобто, жирні кислоти, отримані або безпосередньо, або опосередковано, за допомогою активності ферменту дельта-9-елонгази) можна додати, наприклад, у харчові композиції, фармацевтичні композиції, косметичні засоби та корма для тварин, при цьому все з перерахованих входить в обсяг даного опису. Дані застосування докладно описані нижче. Харчові композиції Даний винахід включає харчові композиції. Такі композиції, для цілей даного опису, включають будь-який продукт харчування або препарат для споживання людиною, включаючи ентеральне або парентеральне споживання, який при прийманні всередину (a) служить для харчування або формування тканин або як джерела енергії та/або (b) для збереження, відновлення або підтримки достатнього харчового статусу або метаболічної функції. Поживна композиція згідно даного винаходу містить щонайменше одну олію або кислоту, отриману безпосередньо або опосередковано шляхом застосування гену дельта-9-елонгази, описаного в даній заявці, та може бути або у твердій, або в рідкій формі. Крім того, зазначена композиція може включати їстівні живильні макроелементи, вітаміни та мінерали в кількостях, необхідних для конкретного застосування. Кількість таких інгредієнтів буде змінюватися в залежності від того, чи передбачається застосування зазначеної композиції нормальними, здоровими дітьми, дітьми або дорослими з певними потребами, наприклад, які супроводжують деякі метаболічні стани (наприклад, метаболічні розлади). Приклади поживних макроелементів, які можна додати в зазначену композицію, включають, але не обмежені перерахованими: їстівні жири, вуглеводи та білки. Приклади таких їстівних жирів включають, але не обмежені перерахованими: кокосову олію, соєву олію та моно- та дигліцериди. Приклади таких вуглеводів включають, але не обмежені перерахованими: глюкозу, їстівну лактозу та гідролізований крохмаль. Крім того, приклади білків, які можна використовувати в поживній композиції згідно даного опису, включають, але не обмежені перерахованими: соєві білки, електродіалізовану молочну сироватку, електродіалізоване знежирене молоко, молочну сироватку або гідролізати даних білків. Що стосується вітамінів та мінералів, у харчові композиції згідно даного винаходу можна додати наступні з них: кальцій, фосфор, калій, натрій, хлорид, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селенів, йод та вітаміни A, E, D, C та комплекс вітамінів групи B. Також можна додати інші подібні вітаміни та мінерали. Компоненти, застосовувані в харчових композиціях згідно даного опису, повинні бути напівочищеними або очищеними. Під напівочищеним або очищеним мають на увазі матеріал, який одержали шляхом очищення природного матеріалу або за допомогою синтезу. Приклади харчових композицій згідно даного винаходу включають, але не обмежені перерахованими: склади для немовлят, харчові добавки, харчові замінники та композиції для регідратації. Харчові композиції, що представляють особливий інтерес, включають, але не обмежені перерахованими: композиції, використовувані для ентеральної та парентеральної підгодівлі немовлят, спеціальні склади для немовлят, добавки для літніх та добавки для суб'єктів з ускладненим травленням та/або зниженим всмоктуванням. Поживну композицію згідно даного винаходу також можна додати в продукт харчування, навіть якщо доповнення до дієти не потрібно. Наприклад, композицію можна додати в продукт харчування будь-якого типу, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: маргарини, модифіковані масла, сири, молоко, йогурт, шоколад, цукерку, закуски, салатні олії, кулінарні олії, кулінарні жири, м'ясо, рибу та напої. У переважному варіанті реалізації згідно даного опису, живильна композиція являє собою ентеральний поживний продукт, більш переважно, ентеральний поживний продукт для застосування дорослими або дітьми. Дану композицію можна вводити дорослим або дітям, 18 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підданим стресу або таким, що мають певні потреби внаслідок хронічних або гострих хворобливих станів. Зазначена композиція може включати, на додаток до поліненасичених жирних кислот, отриманих відповідно до даного опису, поживні макроелементи, вітаміни та мінерали, описані вище. Поживні макроелементи можуть бути присутніми у кількостях, еквівалентних присутнім у молоці людини або еквівалентних у перерахуванні на енергію, тобто, у перерахуванні на калорії. Способи складання рідких або твердих ентеральних та парентеральних живильних формул добре відомі в даній галузі. Ентеральну формулу, наприклад, можна стерилізувати та згодом використовувати як готову до вживання (RTF) або зберігати у вигляді концентрованої рідини або порошку. Порошок можна одержати шляхом розпилювального сушіння формули, отриманої, як зазначено вище, а потім ресуспендувати шляхом регідратації концентрату. Поживні формули для застосування дорослими або дітьми добре відомі в даній галузі та доступні для придбання (наприклад, в Similac®, Ensure®, Jevity® та Alimentum® з підрозділу Ross Products Division, Abbott Laboratories, Колумбус, Огайо). Масло або кислоту, отриману відповідно до даного опису, можна додати в будь-яку з даних формул. Енергетична густина харчових композицій згідно даного опису, що знаходяться у рідкій формі, може бути в діапазоні від приблизно 0,6 ккал до приблизно 3 ккал на мл. У твердій або порошкоподібній формі, живильні добавки можуть включати від приблизно 1,2 до більш ніж 9 ккал на грам, переважно приблизно від 3 до 7 ккал на грам. Звичайно, осмоляльність рідкого продукту повинна бути менше, ніж 700 міліосмоль та, більш переважно, менше, ніж 660 міліосмоль. Поживна формула може включати описані вище живильні макроелементи, вітаміни та мінерали, на додаток до ПНЖК, отриманим відповідно до даного опису. Присутність даних додаткових компонентів допомагає індивідові задовольняти мінімальну щоденну потребу в даних елементах. На додаток до забезпечення ПНЖК, також може бути бажане додавання в композицію цинку, міді, фолієвої кислоти та антиоксидантів. Вважаються, що дані речовини стимулюють піддану стресам імунну систему та, отже, забезпечать додаткову користь для індивіда, що приймає зазначену композицію. У фармацевтичну композицію також можна додати дані елементи. У більш переважному варіанті реалізації, поживна композиція включає, на додаток до антиоксидантів та щонайменше однієї ПНЖК, джерело вуглеводу, при цьому щонайменше 5 відсотків маси зазначеного вуглеводу становить незасвоюваний олігосахарид. У більш переважному варіанті реалізації, поживна композиція додатково включає білок, таурин та карнітин. Вище відзначено, що ПНЖК, отримані відповідно до даного опису, або похідні зазначених ПНЖК, можна додати в харчові замінники або добавки, особливо, у формулу для дітей, для пацієнтів, що одержують харчування внутрішньовенно, або для попередження або лікування виснаження або інших станів або хворобливих станів. У якості теоретичної основи, слід зазначити, що грудне молоко людини має профіль жирних кислот, що включають від приблизно 0,15 % до приблизно 0,36 % ДГК, від приблизно 0,03 % до приблизно 0,13 % ЕПК, від приблизно 0,30 % до приблизно 0,88 % АРК, від приблизно 0,22 % до приблизно 0,67 % ДГЛК і від приблизно 0,27 % до приблизно 1,04 % ГЛК. Таким чином, жирні кислоти, такі як АРК, ЕПК та/або ДГК, отримані відповідно до даного опису, можна застосовувати для зміни, наприклад, композиції в складах для дітей, для кращого відтворення вмісту ПНЖК у грудному молоці людини, або для зміни присутніх ПНЖК, що зазвичай виявляються в молоці ссавця не людини. Зокрема, композиція для застосування у фармакологічній або харчовій добавці, особливо в заміннику грудного молока або добавці до нього, буде переважно включати одну або більше з АРК, ЕПК, ДГЛК і ДГК. Більш переважно, олія буде включати від приблизно 0,3 до 30 % АРК і від приблизно 0,2 до 30 % ДГЛК. Парентеральні харчові композиції, що містять від приблизно 2 до приблизно 30 відсотків маси жирних кислот, в перерахунку на тригліцериди, входять в обсяг даного опису. Можливо можуть бути включені інші вітаміни, особливо жиророзчинні вітаміни, такі як вітамін A, D, E і Lкарнітин. За необхідності, можна додати консервант, такий як альфа-токоферол, у кількості, що становить приблизно 0,1 % за масою. Окрім того, співвідношення АРК і ДГЛК можуть бути придатними для даного конкретного кінцевого застосування. При складанні лікарської форми у вигляді замінника грудного молока або добавки до нього, буде передбачена композиція, яка містить одну або більше з АРК, ДГЛК і ГЛК, у співвідношенні від приблизно 1:19:30 до приблизно 6:1:0,2, відповідно. Наприклад, грудне молоко тварин може різнитися по співвідношенню АРК:ДГЛК:ГЛК у діапазоні від 1:19:30 до 19 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6:1:0,2, який включає проміжні співвідношення, які переважно становлять приблизно 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. При спільному одержанні в клітині-хазяїні, можна змінювати швидкість і відсоток перетворення субстрату-попередника, такого як ЕДК і ДГЛК, в АРК, щоб точно контролювати співвідношення ПНЖК. Наприклад, швидкість перетворення ДГЛК в АРК від 5 % до 10 % можна застосовувати для одержання співвідношення АРК до ДГЛК, рівного приблизно 1:19, тоді як швидкість перетворення, рівну приблизно від 75 % до 80 %, можна застосовувати для одержання співвідношення АРК до ДГЛК, рівного приблизно 6:1. Отже, як у системі культури клітин, так і у тварині-хазяїні можна регулювати час, ступінь і специфічність експресії елонгази, а також експресії десатурази (такої як, але не обмежуючись дельта-8-десатуразою) та інших елонгаз, для модулювання рівнів і співвідношень ПНЖК. ПНЖК/кислоти, отримані відповідно до даного винаходу (наприклад, АРК і ЕПК), потім можна об'єднати з іншими ПНЖК/кислотами (наприклад, ДГЛК) у бажаних концентраціях і співвідношеннях. Додатково, ПНЖК, отримані відповідно до даного опису, або клітини-хазяї, що містять ПНЖК, також можна застосовувати як харчові добавки для тварин, щоб змінити склад жирних кислот у тканині або молоці тварини на більш бажаний для споживання людиною або твариною. Приклади деяких живильних добавок, складів для дітей, живильних замінників і інших живильних розчинів, у яких використовуються поліненасичені жирні кислоти, отримані згідно з даним описом, наведені нижче. Склади для дітей: Приклади складів для дітей включають, але не обмежені перерахованими: склад із залізом Isomil® Soy Formula with Iron, склад від діареї Isomil® DF Soy Formula For Diarrhea, склад із залізом Isomil® Advance® Soy Formula with Iron, готовий до вживання склад із залізом Isomil® Advance® 20 Soy Formula With Iron Ready To Feed, склад для дітей Similac® Infant Formula, склад для дітей із залізом Similac® Advance® Infant Formula with Iron, склад для дітей із залізом Similac® Neosure® Advance® Infant Formula With Iron, готовий до вживання, що збагачує грудне молоко людини з низьким вмістом заліза, склад Similac Natural Care Advance Low-Iron Human Milk Fortifier Ready To Use, кожний з яких доступний для придбання в Abbott Nutrition (Колумбус, Огайо). Різні ПНЖК згідно з даним описом можна замінити та/або додати у формули для дітей, описані в даній заявці, та в інші формули для дітей, відомі фахівцям у даній галузі. Живильні склади: Приклади живильних складів включають, але не обмежені перерахованими: ENSURE®, ENSURE® HIGH PROTEIN, ENSURE PLUS®, ENSURE® POWDER, ENSURE® PUDDING, ENSURE® WITH FIBER, Oxepa™ Nutritional Product, кожний з яких доступний для придбання в Abbott Nutrition (Колумбус, Огайо). Різні живильні добавки, описані вище та відомі фахівцям у даній галузі, можна замінити та/або доповнити ПНЖК, отриманими відповідно до даного опису. Фармацевтичні композиції В обсяг даного винаходу також входить фармацевтична композиція, що містить одну або більше кислот та/або масел, отриманих із застосуванням генів дельта-9-елонгази, описаних у даній заявці, у відповідності зі способами, описаними в даній заявці. Зокрема, така фармацевтична композиція може включати одну або більше кислот та/або масел, а також стандартний, добре відомий, нетоксичний фармацевтично прийнятний носій, ад'ювант або середовище, таке як, наприклад, фосфатно-сольовий буферний розчин, вода, етанол, поліоли, рослинні олії, змочуючий агент або емульсія, така як емульсія вода/масло. Композиція може знаходитися в рідкій або у твердій формі. Наприклад, композиція може бути у вигляді таблетки, капсули, проковтуваної рідини або порошку, ін'єкційного складу або топічної мазі або крему. Необхідну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом забезпечення необхідного розміру часток у випадку дисперсії та шляхом застосування поверхнево-активних речовин. Також може виявитися бажаним включення ізотонічних агентів, наприклад, цукрів, хлориду натрію та їм подібних. Додатково до таких інертних розріджувачів, композиція також може містити ад'юванти, такі як змочувальні агенти, емульгуючі та суспендуючі агенти, підсолоджуючі агенти, ароматизуючі агенти та віддушки. Суспензії, додатково до активних сполук, можуть включати суспендуючі агенти, такі як, наприклад, етоксильовані ізостеарилові спирти, поліоксиетиленсорбіт та складні ефіри сорбітану, мікрокристалічна целюлоза, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант або суміші зазначених речовин. Тверді лікарські форми, такі як таблетки й капсули, можна одержати, застосовуючи методики, добре відомі в даній галузі. Наприклад, ПНЖК, отримані відповідно до даного опису, можна таблетувати разом зі звичайною основою таблетки, такою як лактоза, сахароза та кукурудзяний крохмаль, у комбінації зі зв'язувальними речовинами, такими як гуміарабік, кукурудзяний крохмаль або желатин, дезінтегруючими агентами, такими як картопляний 20 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 крохмаль або альгінова кислота, і змащуючим агентом, таким як стеаринова кислота або стеарат магнію. Капсули можна одержати шляхом включення даних допоміжних речовин у желатинову капсулу разом з антиоксидантами та відповідною(ними) ПНЖК. Компоненти антиоксиданти та ПНЖК повинні відповідати описаним вище нормам. Для внутрішньовенного введення, ПНЖК, отримані відповідно до даного опису, або похідні ПНЖК, можна включити в комерційні склади, такі як Intralipids™. Типовий профіль жирних кислот в нормальній плазмі дорослої людини включає від 6,64 до 9,46 % АРК, від 1,45 до 3,11 % ДГЛК і від 0,02 до 0,08 % ГЛК. Дані ПНЖК або їх метаболічні попередники можна вводити окремо або в комбінації з іншими ПНЖК, щоб досягнути нормального профілю жирних кислот у пацієнта. За необхідності, окремі компоненти складів можуть надаватися окремо, у вигляді набору, для однократного або багаторазового застосування. Типове дозування конкретної жирної кислоти знаходиться в діапазоні від 0,1 мг до 20 г (до 100 г) щодня й переважно становить від 10 мг до 1, 2, 5 або 10 г щодня. Можливі шляхи введення фармацевтичних композицій відповідно до даного винаходу включають, наприклад, ентеральний (наприклад, пероральний і ректальний) і парентеральний шлях. Наприклад, рідку композицію можна вводити, наприклад, перорально або ректально. Крім того, гомогенну суміш можна повністю диспергувати у воді, змішати за стерильних умов з фізіологічно прийнятними розріджувачами, консервантами, буферами або пропелентами з одержанням спрею або інгалятора. Шлях уведення, звичайно, буде залежати від необхідного ефекту. Наприклад, якщо зазначену композицію використовують для лікування грубої, сухої або пристарілої шкіри, для лікування ушкодженої або обпаленої шкіри або для лікування шкіри або волосся, уражених хворобою або патологічним станом, можливо, її можна застосовувати топічно. Дозування композиції для введення пацієнту може визначити середній фахівець у даній галузі, і воно буде залежати від різних факторів, таких як вага пацієнта, вік пацієнта, імунний статус пацієнта і т.д. Що стосується форми, зазначена композиція може являти собою, наприклад, розчин, дисперсію, суспензію, емульсію або стерильний порошок, який потім розчиняють. У даний опис також входить лікування різних розладів шляхом застосування фармацевтичних та/або харчових композицій, описаних у даній заявці. Зокрема, композиції відповідно до даного винаходу можна застосовувати для лікування рестенозу після ангіопластики. Більше того, симптоми запалення, ревматоїдного артриту, астми та псоріазу також можна лікувати за допомогою композицій відповідно до даного опису. Також існують доказу того, що ПНЖК можуть брати участь у метаболізмі кальцію; таким чином, композиції відповідно до даного опису, можливо, можна застосовувати для лікування або попередження остеопорозу і каменів у нирках або сечовивідних шляхах. Додатково, композиції відповідно до даного винаходу також можна застосовувати для лікування раку. Було показано, що злоякісні клітини мають змінений склад жирних кислот. Було показано, що додавання жирних кислот сповільнює їх ріст, викликає загибель клітин і підвищує їх чутливість до хіміотерапевтичних агентів. Більше того, композиції відповідно до даного винаходу також можна застосовувати для лікування кахексії, пов'язаної з раком. Композиції відповідно до даного винаходу також можна застосовувати для лікування діабету (див. патент США номер 4826877 і Horrobin і ін., Am. J. Clin. Nutr. 1993) том 57 (додаток) 732S737S). Змінений метаболізм і склад жирних кислот продемонстрували в страждаючих діабетом тварин. Більше того, композиції відповідно до даного опису, що містять ПНЖК, отримані або безпосередньо, або опосередковано шляхом застосування ферменту дельта-9-елонгази, також можна застосовувати для лікування екземи, для зниження кров'яного тиску та для поліпшення екзаменаційних оцінок по математиці. Крім того, композиції відповідно до даного винаходу можна застосовувати для інгібування агрегації тромбоцитів, розширення кровоносних судин, зниження рівнів холестерину, інгібування проліферації гладкої мускулатури стінки судини та фіброзної тканини (Brenner і ін., Adv. Exp. Med. Biol. (1976) том 83, стор. 85-101), зменшення або запобігання кровотечі в шлунково-кишковому тракті та інших побічних ефектів нестероїдних протизапальних лікарських засобів (див. патент США номер 4666701), попередження або лікування ендометріозу та предменструального синдрому (див. патент США номер 4758592) і лікування міалгічного енцефаломієліту та хронічної утоми після вірусних інфекцій (див. патент США номер 5116871). Додаткові застосування композицій відповідно до даного винаходу включають застосування для лікування СНІДу, множинного склерозу та запальних захворювань шкіри, а також для підтримки загального здоровішого стану. 21 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 Додатково, композицію відповідно до даного винаходу можна застосовувати для косметичних цілей. Її можна додавати у вже відомі косметичні композиції, таким чином, щоб одержати суміш, або можна застосовувати як самостійну композицію. Застосування у ветеринарії. Варто зазначити, що описані вище фармацевтичні й харчові композиції можна застосовувати до тварин (тобто, до домашніх або не домашніх), також, як і до людей, оскільки тварини зазнають багато з таких же потреб і знаходяться у багатьох з таких самих станів, що й люди. Наприклад, масло або кислоти відповідно до даного винаходу можна застосовувати в харчових добавках для тварин або аквакультур, харчових замінниках для тварин, вітамінах для тварин або в топічних мазях для тварин. Даний опис можна проілюструвати за допомогою наступних необмежуючих прикладів. Приклад 1: Конструювання бібліотеки кДНК із CCMP 2916 Euglena deses Ehr. і аналіз послідовності для виділення передбачуваних кандидатів дельта-9-елонгази Аналіз складу жирних кислот деяких морських водоростей виявив присутність значної кількості докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:6 n-3) (15 % загальної маси ліпідів) в CCMP 2916 Euglena deses Ehr. (див. таблицю 1). Окрім цього, у даному організмі були присутні проміжні сполуки альтернативного шляху за участю дельта-8-десатурази/дельта-9-елонгази (див. Фігуру 1), це свідчить про те, що даний шлях активний в цьому організмі. Таким чином, припустили, що в даному організмі присутня активна дельта-9-елонгаза, здатна перетворювати лінолеву кислоту (ЛК, 18:2 n-6) в омега-6-ейкозандієнову кислоту (омега-6-ЕДК, 20:2 n-6), або альфаліноленову кислоту (АЛК, 18:3, n-3) в омега-3-ейкозатриєнову кислоту (омега-3-ЕТрК, 20:3 n-3), а також активна дельта-8-десатураза, здатна перетворювати омега-6-ейкозандієнову кислоту (омега-6-ЕДК, 20:2 n-6) у дигомо-гама-ліноленову кислоту (ДГЛК, 20:3 n-6), або омега-3ейкозатриєнову кислоту (омега-3-ЕТрК, 20:3 n-3) в омега-3-ейкозатетраєнову кислоту (омега-3ЕТК, 20:4 n-3) (див. Фігуру 1). Таблиця 1 Профіль жирних кислот CCMP 2916 Euglena deses Ehr. Жирна кислота Стеаринова кислота Олеїнова кислота Лінолева кислота (ЛК) Гама-ліноленова кислота (ГЛК) Альфа-ліноленова кислота (АЛК) Стеаридонова кислота (СДК) Омега-6-ейкозандієнова кислота (ЕДК) Дигомо-гама-лінолева кислота (ДГЛК) Арахідонова кислота (АРК) Омега-3-ейкозатриєнова кислота (омега-3-ЕТрК) Омега-3-ейкозатетраєнова кислота (омега-3-ЕТК) Ейкозапентаєнова кислота (ЕПК) Адренова кислота (АДК) Омега-6-докозапентаєнова кислота (омега-6-ДПК) Омега-3-докозапентаєнова кислота (омега-3-ДПК) Докозагексаєнова кислота (ДГК) 30 35 18:0 18:1 n-9 18:2 n-6 18:3 n-6 18:3 n-3 18:4 n-3 20:2 n-6 20:3 n-6 20:4 n-6 20:3 n-3 20:4 n-3 20:5 n-3 22:4 n-6 22:5 n-6 22:5 n-3 22:6 n-3 % загального вмісту ліпідів 0,529 1,663 3,137 0,096 16,515 0,126 4,149 0,442 3,719 1,984 0,496 7,104 0,841 5,775 1,176 15,239 Метою даного дослідження було виділення повнорозмірного гену дельта-9-елонгази з CCMP 2916 Euglena deses Ehr. і опис ферментативної активності його продукту шляхом експресії в гетерологічному хазяїні, Saccharomyces cerevisiae. Для виділення повнорозмірних генів з CCMP 2916 Euglena deses Ehr., сконструювали бібліотеку мікро-кДНК, застосовуючи сумарну РНК, виділену з даного організму. Для цього одержали клітинну масу CCMP 2916 Euglena deses Ehr. з Provasoli-Guillard-National Center for Marine Phytoplankton (Ccmp-bigelow Laboratories, Вест-Бутбей, Мен) і виділили з неї сумарну РНК, застосовуючи набір Qiagen Rneasy Maxi kit (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія), дотримуючись протоколу виробника. Якщо коротко, заморожену клітинну масу подрібнювали в рідкому азоті, застосовуючи ступку й товкачик, суспендували в буфері RLT (Qiagen Rneasy Plant Mini kit) і пропускали через Qiashredder. РНК очищали за допомогою колонок Rneasy maxi, дотримуючись інструкцій виробника. 22 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Конструювання бібліотеки мікро-кДНК замовили в Agencourt Biosciences (Уолтем, Масачусетс), яку там сконструювали, застосовуючи 50 мкг РНК з CCMP 2916 Euglena deses Ehr., відповідно до запатентованої технології. В Agencourt використовують кілька унікальних і запатентованих етапів у процесі синтезу першої нитки, які, в кінцевому підсумку, дозволяють досягнути на 25 – 30 % більшій ефективності, ніж при звичайно застосовуваних методиках. Під час запатентованого процесу, РНК піддають зворотній транскрипції в олДНК, використовуючи умови, розроблені для зменшення або виключення явищ внутрішнього праймування. Комбінація даного процесу та спеціалізованої програми проведення циклів підвищує кількість повнорозмірних клонів. Після синтезу другої нитки, клони кДНК потім відбирають за розміром, щоб вони були більші, ніж 1,2 т.п.о., для зменшення переважного клонування маленьких, укорочених кДНК. Для бібліотеки з більшими розмірами вставок, розмір вставки вибирають > 4 т.п.о., щоб підвищити кількість клонів з більшими вставками. Після відбору за розміром, кінці кДНК захищали і кДНК розщеплювали за допомогою рідкоріжучого ферменту. "Рідкоріжучий" фермент рестрикції, сайт для якого вводять у клони під час етапу праймування кДНК, потім використовують для одержання клонів для спрямованого клонування у вектор pAGEN. Імовірність того, що "рідкоріжучий" фермент рестрикції розщепить самі клони кДНК, в 20 раз нижче, отже, даний фермент дозволяє одержати набагато більше повнорозмірних клонів, ніж при процесах конструювання бібліотек кДНК, у яких використовують звичайні ферменти рестрикції, які розщеплюють клон на довільних ділянках. У результаті одержують вставку з 5’тупим кінцем і 3’-виступом, який утворювався в результаті розщеплення рідкоріжучим ферментом рестрикції. Завдяки даному процесу, не потрібне додаткове лігування адаптора для забезпечення спрямованого клонування. Це в цілому поліпшує ефективність процесу клонування. Зазначений вектор спеціально сконструйований для спрямованого клонування без застосування 5’-адапторів, що додатково підвищує ефективність трансформації завдяки зменшенню кількості маніпуляцій над кДНК у процесі клонування. Після того, як закінчили складати первинну бібліотеку кДНК, у ній перевіряють кількість незалежних клонів, відсоток рекомбінантних клонів і середній розмір вставки. Клонами потім трансформували DH10B E. coli (бактеріальні клітини, стійкі до фагу T1). Титр 6 7 отриманої бібліотеки становив 3,2 × 10 КФО/мл, з кількістю незалежних колоній 3,52 × 10 та з середнім розміром вставки 1,3 т.п.о. Секвенували 4224 клони з даної бібліотеки кДНК і аналізували послідовності без вектора, застосовуючи BLAST, щоб ідентифікувати послідовності, що містять гомологію з відомими послідовностями дельта-9-елонгази. Аналіз за допомогою BLAST виявив п'ять передбачуваних збігів у бібліотеці кДНК CCMP 2916 Euglena deses Ehr. с гомологією з відомими послідовностями дельта-9-елонгази з Pavlova salina (номер доступу AAY15135; SEQ ID NO: 1; Фігура 4A), Isochrysis galbana (номер доступу AF390174; SEQ ID NO: 2; Фігура 4B), Eutreptiella sp. (див. WO 2007/061845 A2; SEQ ID NO: 3; Фігура 4C), Euglena gracialis (номер доступу CAT16687; SEQ ID NO: 4; Фігура 4D) і Euglena anabena (див. WO 2008/0194685 A1; SEQ ID NO: 5; Фігура 4E). В одного клону EST, позначеного "plate2_MO7" (SEQ ID NO: 6; Фігура 5A), отриманого в результаті секвенування клонів з бібліотеки кДНК CCMP 2916 Euglena deses Ehr., виявили високу гомологію послідовності з раніше ідентифікованими дельта-9-елонгазами. Довжина даного фрагмента ДНК становила 744 п.о., і прогнозована послідовність амінокислот (SEQ ID NO: 7; Фігура 5B) мала ідентичність (ідентичність послідовності амінокислот становила 66 %) з послідовністю дельта-9-елонгази з Euglena gracialis (SEQ ID NO: 4). Фрагмент гена plate2_MO7, схоже, містив сайт ініціації транскрипції "ATG" гена, що з'ясували виходячи з вирівнювання з іншими дельта-9-елонгазами, але не містив 3’-кінець передбачуваної дельта-9-елонгази CCMP 2916 Euglena deses Ehr. Приклад 2: Виділення 3’-кінця елонгази plate2_MO7 з CCMP 2916 Euglena deses Ehr. Послідовність клону plate2_MO7 з Прикладу 1 використовували як матрицю для одержання 3’-кінця. Першу нитку кДНК синтезували за допомогою набору для швидкої ампліфікації кінців кДНК SMART™ RACE kit (BD Biosciences), дотримуючись інструкцій виробника. Для синтезу готової до 3’-RACE кДНК, 1,5 мкг сумарної РНК з CCMP 2916 Euglena deses Ehr. і 1 мкл праймеру до 3’послідовності, що кодує (5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3", у якому N=A, C, G або T; та V=A, G або C (SEQ ID NO: 8)) (12 мкМ) змішували в сумарному об'ємі 5 мкл у безнуклеазній пробірці для ПЛР, інкубували при°70 C впродовж 2 хвилин і швидко охолоджували на льоді. Після нетривалого центрифугування в пробірки додавали 2 мкл 5X буферу для першої нитки [250 мМ Tris-НСl (pН-8,3), 375 мМ KСl і 30 мМ MgСl2], 1 мкл 0,1 M дитіотреітолу (ДТТ) і 1 мкл 10 мМ суміші дНТФ. Після інкубування при 42 °C впродовж 2 хвилин, у пробірку додавали 1 мкл зворотної траскриптази (Powerscript™ RT, BD Biosciences) та 23 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інкубували при 42 °C впродовж 90 хвилин. Першу нитку кДНК розбавляли в 100 мкл буферу трицин- етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТК) [10 мМ трицин-KOH (pН 8,5), 1,0 мМ ЕДТК] і ферменти інактивувавали прогрівом при 72 °C впродовж 7 хвилин. Для виділення 3’-кінця фрагмента гену елонгази Euglenoid sp. (тобто, послідовності клону plate2_MO7), розробили праймери, виходячи з відомостей про послідовність частини гену елонгази plate2_MO7. Первинну ПЛР-ампліфікацію здійснювали, застосовуючи готову до 3’RACE кДНК як матрицю та наступні праймери: Eug Elo MO-7 FP1 (геноспецифічний праймер) (5’-AGG CGC TGT GGA TCT TCG TCT TCC-3") (SEQ ID NO: 9), у комбінації з сумішшю праймерів для RACE Universal Primer Mix A (UPM, BD Biosciences): довгий праймер (0,4 мкМ): 5’- CTA ATA CGA CTC ACT ATA GCA AGC AGT GGT ATC AAC GCA GAG T-3" (SEQ ID NO: 10); і короткий праймер (2 мкМ): 5’- CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3" (SEQ ID NO: 11). Ампліфікацію здійснювали, використовуючи 0,25 мкл (100 мМ) геноспецифічного праймеру, 0,25 мкл (100 мМ) суміші праймерів UPM, 2,5 мкл матриці кДНК, 2,5 мкл 2,5 мМ дНТФ, 5 мкл 5X буфера для ПЛР (Advantage® GC II polymerase buffer (Clontech), 200 мМ трицин-KOH (pН 9,2), 75 мМ ацетат калію, 17,5 мМ ацетат магнію, 25 % ДМСО, 18,75 мкг/мол БСА, 0,005 % Tween 20, 0,005 % Nonidet-P40), 2,5 мкл реагенту GC Melt Reagent (Clontech), 0,5 мкл полімерази 50X Advantage® GC I polymerase (Clontech) і 11,5 мкл води Milli-Q® (Millipore), у кінцевому об'ємі реакції, рівному 25 мкл. Зразки спочатку денатурували при 94 °C впродовж 3 хвилин, а потім здійснювали 2 цикли: 94 °C впродовж 30 секунд, 64 °C впродовж 30 секунд і 68 °C впродовж 1,3 хвилини; 3 цикли: 94 °C впродовж 30 секунд, 62 °C впродовж 30 секунд і 68 °C впродовж 1,30 хвилини; 4 цикли: 94 °C впродовж 30 секунд, 60 °C впродовж 30 секунд і 68 °C впродовж 1,30 хвилини; і 26 циклів: 94 °C впродовж 30 секунд, 58 °C впродовж 30 секунд і 68 °C впродовж 1,30 хвилини. Кінцевий цикл елонгації при 68 °C впродовж 10 хвилин здійснювали перед зупинкою реакції при 4 °C. Аналіз ПЛР-продуктів виявив дуже слабкі смуги, що, імовірно, було наслідком низьких рівнів транскриптів гену елонгази в клітині. Отже, здійснювали гніздову ПЛР-реакцію, застосовуючи як матрицю 1 мкл продукту описаної вище первинної ПЛР-реакції. Праймери, використані для гніздової ПЛР, являли собою Eug Elo MO-7 FP2 (геноспецифічний праймер): 5’- TCC CCG TGC CGA AGT CGT TCA TCA CC-3" (SEQ ID NO: 12) і суміш праймерів Universal Primer Mix A (UPM) (послідовності SEQ ID NO: 10 і 11). Умови ПЛР-реакції та параметри циклів були такими ж, як і використовувані для первинної ПЛР-реакції. Амплікон розміром 548 п.о. (SEQ ID NO: 13; Фігура 6A), отриманий за допомогою гніздової ПЛР, очищали в гелі, застосовуючи набір для очищення Qiagen Gel Purification kit (Qiagen), клонували у вектор pTZ57R/T (T/A cloning vector, MBI Fermentas) і секвенували. Секвенування дозволило виявити, що даний фрагмент (SEQ ID NO: 13) містив цілий 3’-кінець фрагмента елонгази plate2_MO7, разом зі стоп-кодоном "TAG" та ділянкою, що знаходилася по ходу транскрипції від нього, яка містила поліА-хвіст. Прогнозована послідовність амінокислот даного фрагменту (послідовності SEQ ID NO: 14 і 30-32) показана на Фігурі 6B. Перша зірочка позначає стоп-сайт кодованого plate 2_MO7 білку. Приклад 3: Виділення повнорозмірного гену елонгази plate2_M07 з CCMP 2916 Euglena deses Ehr. Повнорозмірну послідовність гену елонгази plate2_MO7 одержували шляхом ПЛРампліфікації, застосовуючи бібліотеку кДНК Euglena deses Ehr. як матрицю й праймери, розроблені таким чином, щоб вони включали 5’- і 3’- кінці гену plate2_MO7, виходячи з відомостей про послідовність, отриманих в Прикладі 1 і Прикладі 2. Додатково, у праймери були включені сайти BamHI/HindIII (підкреслені) для полегшення клонування гену в сайти BamHI/HindIII дріжджового вектору експресії pYX242. Використовували наступні послідовності праймерів: Прямий праймер M07-Elo: 5’- CAC CAT GGA TCC ATG GAC GTC GCG ACT ACG CTG G-3" (SEQ ID NO: 15), і Зворотний праймер M07-Elo: 5’- ACG CGT AAG CTT CTA GTC CAC TTT CTT CTC ATC CTT C-3" (SEQ ID NO: 16). Ампліфікацію здійснювали, застосовуючи 0,5 мкл (100 мкМ) кожного праймеру, 1 мкл (~ 110 нг) пулу плазмід бібліотеки кДНК Euglena deses Ehr. як матриці, 5 мкл 2,5 мМ дНТФ, 10 мкл 5X буферу Phusion GC Buffer (Finnzymes), 5 мкл ДМСО, 0,5 мкл (1 од.) полімерази Phusion polymerase (Finnzymes) і 27,5 мкл води Milli-Q® (Millipore). Зразки спочатку денатурували при 98 °C впродовж 3 хвилин, а потім здійснювали 2 цикли: 98 °C впродовж 8 секунд, 60 °C впродовж 12 секунд і 72 °C впродовж 45 секунд; і 28 циклів: 98 °C впродовж 8 секунд, 58 °C впродовж 12 секунд і 72 °C впродовж 45 секунд. Здійснювали кінцевий цикл елонгації при 72 °C 24 UA 107468 C2 5 10 15 20 впродовж 3 хвилин перед зупинкою реакції при 4 °C. У результаті ПЛР одержали продукт розміром ~789 п.о., який клонували в сайти Bam HI/Hind III вектору pYX242 і трансформували ним E.coli DH5α (Invitrogen). Отриману в такий спосіб плазмідну ДНК секвенували з одержанням повнорозмірної послідовності гену розміром 789 п.о., позначеного "Eug-mo7-ELO#10" (SEQ ID NO: 17; Фігура 7A). SEQ ID NO: 17 депонували в Американську колекцію типових культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Манассас, Вірджинія 20110-2209 10 липня, 2009 р., відповідно до Будапештського договору, і їй був привласнений номер депозиту ATCC _____. Вважали, що даний ген кодує передбачувану дельта-9-елонгазу з CCMP 2916 Euglena deses Ehr., і має передбачену довжину 262 амінокислоти (SEQ ID NO: 18; Фігура 7B). Даний ген використовували для дослідження експресії, щоб описати ферментативну активність його продукту. Окрім клону Eug-MO7-ELO#10, у процесі секвенування були ідентифіковані додаткові варіанти клону, послідовності яких дещо відрізнялися на деяких ділянках повнорозмірного гену. Дані варіанти послідовності, ймовірно, з'явилися в процесі ПЛР-ампліфікації. Аналіз послідовності одного такого варіанту, Eug-MO7-ELO #14, виявив декілька нуклеотидних і відповідних амінокислотних замін у порівнянні з вихідним клоном Eug-MO7-ELO#10 (див. таблицю 2 і Фігури 2A і 2B). Нуклеотидна (SEQ ID NO: 19) і передбачена амінокислотна послідовність (SEQ ID NO: 20) Eug-MO7-ELO #14 показані на Фігурах 8A і 8B, відповідно. Для аналізу експресії використовували як вихідний клон Eug-MO7-ELO#10, так і варіант Eug-MO7ELO#14. Таблиця 2: Нуклеотидні та амінокислотні заміни у варіанті клону Eug-MO7-ELO#14 у порівнянні з вихідним клоном Eug-MO7-ELO#10 Нуклеотидні заміни Eug-MO7-ELO#10 (SEQ ID NO: 17)  Eug-MO7-ELO#14 (SEQ ID NO: 19) GCT24  GCC24 GC83C  GT83C G232TA  A232TA A301TG  T301TG C310TC  A310TC ACA630  ACT630 AAA750  AAG750 25 30 35 40 45 Відповідні амінокислотні заміни (SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 20) Мовчазна мутація A28  V28 V78  I78 M101  L101 L104  I104 Мовчазна мутація Мовчазна мутація Запит послідовності Eug-MO7-ELO #10 в BLAST з пошуком подібних з послідовностями, що знаходяться у базі даних BLAST "nr", виявив, що прогнозована послідовність амінокислот, кодована Eug-MO7-ELO#10 (SEQ ID NO: 18), має найбільшу ідентичність послідовності амінокислот (36 % ідентичності) з дельта-9-елонгазою Isochrysis galbana (SEQ ID NO: 2). Попарне вирівнювання SEQ ID NO: 18 з відомою дельта-9-елонгазою з Euglena gracialis (номер доступу CAT 16687; SEQ ID NO: 4) виявило набагато більшу ідентичність послідовностей амінокислот (66 % ідентичності). При цьому для попарного вирівнювання використовували параметри за замовчуванням програми Vector NTI®AlignX. Попарне вирівнювання з послідовністю дельта-9-елонгази Pavlova salina (SEQ ID NO: 1) виявило лише ~15 % ідентичності послідовностей. На відміну від десатураз, ферменти елонгази містять дуже мало висококонсервативних фрагментів. Дані ферменти являють собою високогідрофобні білки, що містять від чотирьох до п'яти гідрофобних ділянок, які ймовірно пронизують мембрану. Крім того, у них був виявлений висококонсервативний гістидиновий блок (HXXHH) (SEQ ID NO: 28), включений у четверту пронизуючу мембрану ділянку, яка необхідна для здійснення ферментативної активності (див. Leonard і ін., "Elongation of long-chain fatty acids", Prog Lipid Res. (2004) том 43, стор. 36-54). У деяких елонгазах, перший залишок гістидину у фрагменті "HXXHH" (SEQ ID NO: 28) замінений на глутамін (Q), що приводить до утворення консервативного фрагменту "QXXHH" (SEQ ID NO: 29). Даний фрагмент QXXHH (SEQ ID NO: 29) виявляють у більшості дельта-9-елонгаз, включаючи Eug-MO7-ELO#10. Крім того, елонгаза Eug-MO7-ELO#10 містить інші незмінні залишки, які присутні в більшості елонгаз, відомих на даний момент і описаних в Leonard і ін., "Elongation of long-chain fatty acids", Prog Lipid Res. (2004) том 43, стор. 36-54. На Фігурах 3A і 3B зображене вирівнювання послідовності амінокислот елонгази Eug-MO7 25 UA 107468 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ELO#10 з іншими відомими елонгазами, які мають різну субстратну специфічність. Дані елонгази включають елонгазу ELOVL4 миші (номер доступу AAG47667; SEQ ID NO: 21; Фігура 9A), елонгазу ELOVL2 людини (номер доступу NP_060240; SEQ ID NO: 22; Фігура 9B) і елонгазу C. elegans (номер доступу AF244356; SEQ ID NO: 23), додатково до дельта-9-елонгаз з Euglena gracialis (SEQ ID NO: 4) і Isochrysis galbana (SEQ ID NO: 2). Незмінні амінокислоти заштриховані у вирівняних послідовностях. Прийнято вважати, що дані незмінні залишки є суттєвими для функціонування даних елонгуючих ферментів, тому що вони висококонсервативні між різними видами. Вирівнювання здійснювали, застосовуючи програмне забезпечення Vector NTI, у якому реалізований змінений алгоритм ClustalW. Приклад 4: Визначення ферментативної активності передбачуваної дельта-9-елонгази, кодованої геном Eug-MO7-ELO#10 Eug-MO7-ELO#10 та варіант Eug-MO7-ELO#14, що кодують передбачувану дельта-9елонгазу, клонували в сайти BamHI/HindIII дріжджового вектору експресії, pYX242 (Novagen), відповідно. Даними конструкціями трансформували клітини компетентного штаму SC334 Saccharomyces cerevisiae. Трансформацію дріжджів здійснювали за допомогою набору AlkaliCation Yeast Transformation Kit (QBioGene), дотримуючись умов, рекомендованих виробником. Трансформанти відбирали за ауксотрофією по лейцину в середовищах, у яких був відсутній лейцин (DOB [-Leu]). Для визначення елонгуючої активності ферментів, кодованих Eug-MO7-ELO#10 і Eug-MO7ELO#14, трансформанти вирощували в присутності 50 мкМ специфічних жирних кислот – субстратів (перераховані нижче), і субстратну специфічність визначали за перетворенням специфічного продукту: Для дельта-9- елонгазної активності: Лінолева кислота (18:2 n-6)  Ейкозандієнова кислота (ЕДК, 20:2 n-6) Альфа-ліноленова кислота (18:3 n-3)  Ейкозатриєнова кислота (ЕТрК, 20:3 n-3) Для C18-елонгазноїактивності: Гамма-ліноленова кислота (ГЛК, 18:3 n-6)  Дигомо-гама-ліноленова кислота (ДГЛК, 20:3 n6) Стеаридонова кислота (СДК, 18:4 n-3)  Омега-3-Ейкозатетраєнова кислота (омега-3-ЕТК, 20:4 n-3) Для C20-елонгазноїактивності: Арахідонова кислота (АРК, 20:4 n-6)  Адренова кислота (омега-6-АДК, 22:4 n-6) Ейкозапентаєнова кислота (ЕПК, 20:5 n-3)  Омега-3-Докозапентаєнова кислота (омега-3ДПК, 22:5 n-3) Як негативний контроль використовували штам 334 S. Cerevisiae, у якому експресувався вектор pYX242. Трансформовані колонії, виділені з селективного середовища DOB [–Leu], вирощували впродовж ночі в 10 мл рідкого бульйону YPD при 30 °C, при інтенсивному струшуванні. 5 мл даної культури, культивованої впродовж однієї ночі, потім додавали в 45 мл селективного середовища (DOB [–Leu]), що містить 50 мкМ (кінцева концентрація) різних жирних кислотсубстратів (як описано), і інтенсивно струшували (250 об/хв) впродовж від 48 до 72 годин (як зазначено) при 24 °C. Для екстрагування всіх ліпідів, дріжджові клітини відкручували при 2000 об/хв впродовж 15 хвилин і додавали 0,5 мл води, зразки струшували, а потім додавали 10 мл метанолу при акуратному перемішуванні. Потім додавали 20 мл хлороформу, зразки струшували впродовж 1 хвилини при високій швидкості струшування і залишали на 2 години при кімнатній температурі. Потім у зразок додавали 6 мл сольового розчину, а потім центрифугували при 2200 об/хв впродовж 10 хвилин. Верхню фракцію хлороформу переносили в чисту/суху 30 мл віалу та випарювали хлороформ досуха при 40 °C у потоці азоту. Як тільки розчинники повністю випарилися, у кожну віалу додавали 2 мл хлороформу і зразки дериватизували. Для дериватизації ліпідів у метилові ефіри жирних кислот (МЕЖК), у кожну пробірку вносили 100 мкл внутрішнього стандарту (17,216 мкг/100 мкл) тригептадеканоїну. Хлороформ випарювали досуха в атмосфері азоту при 40 °C, додавали 2 мл трифториду бору в 14 % метанолі, а потім додавали 2 краплі (~50 мкл) толуолу. Через кожну віалу пропускали азот і гріли впродовж 15 хвилин при 95 °C. Після того, як віали охололи, додавали 2 мл сольового розчину і екстрагували ліпіди 4 мл гексану при інтенсивному струшуванні впродовж 1 хвилини. Потім гексановий екстракт переносили в 20 мл чисті/сухі пробірки з кришкою, що загвинчується, додавали 5 мл деіонізованої води (ді-Н2O), струшували зразок і центрифугували при 1500 об/хв впродовж 4 хвилин. Промитий гексан потім переносили в 20 мл пробірку з реагентом. Гексан випарювали досуха, і кожний зразок знову розбавляли 0,5 мл свіжого гексану. Кінцеве 26 UA 107468 C2 5 10 15 20 розведення гексаном струшували, щоб диспергувати ліпіди. Увесь зразок потім завантажували у віали для автоматичного добору проб GC auto sampler vials та інжектували 4 мкл для аналізу. GC були відкалібровані за допомогою стандарту NuChek Std. 461. Відсоток перетворення субстрату в продукт розраховували, застосовуючи формулу: [продукт] x 100 [продукт] + [субстрат] У Таблиці 3 представлена ферментативна активність білків, кодованих Eug-MO7-ELO#10 і Eug-MO7-ELO#14, виходячи з відсотку перетворення доданого субстрату. Білок, кодований EugMO7-ELO#10, перетворював 10,5 % ЛК (18:2 n-6) в ЕДК (20:2 n-6) і 23,2 % АЛК (18:3 n-3) в ЕТрК (20:3 n-3). Це свідчило про те, що ген Eug-MO7-ELO#10 кодує дельта-9-елонгазу, яка може впізнавати як n-6, так і n-3 жирні кислоти - субстрати. Білок, кодований зміненим клоном EugMO7-ELO#14, також виявляв дельта-9-елонгуючу активність, перетворюючи 7,84 % ЛК (18:2 n-6) в ЕДК (20:2 n-6) і 17,15 % АЛК (18:3 n-3) в ЕТрК (20:3 n-3). Проте, його активність була нижчою, ніж у білка, кодованого вихідною послідовністю Eug-MO7-ELO#10. Це свідчить про те, що залишки, якими відрізняються Eug-MO7-ELO#14 і Eug-MO7-ELO#10, є суттєвими для дельта-9елонгучої активності даного ферменту. Дуже низька фонова (неспецифічне перетворення субстрату) активність була виявлена для контролю, який містив тільки вектор (див. таблицю 3). Ферменти, кодовані як Eug-MO7-ELO#10, так і Eug-MO7-ELO#14, не виявили активність на будь-яких інших тестових субстратах ПНЖК (див. таблицю 4), це свідчить про те, що даний фермент специфічний до субстратів, залучених в альтернативний шлях за участю дельта-8-десатурази/ дельта-9-елонгази (див. Фігуру 1). Таблиця 3: дельта-9-елонгазна активність білків, кодованих Eug-MO7-ELO#10 і Eug-MO7-ELO#14, експресованих у штамі SC334 Saccharomyces cerevisiae % загального вмісту жирних кислот Eug-MO7-ELO#10 a ЛК (18:2 n-6) 8,84 b ЕДК (20:2n-6, дельта-11,14) 1,038 c % перетворення ЛК  ЕДК 10,5 a АЛК (18:3 n-3) 8,788 b ЕТрК (20:3 n-3, дельта-11,14,17) 2,665 c % перетворення АЛК  ЕТрК 23,2 Eug-MO7-ELO#14 Векторний контроль 12,575 10,65 1,066 0,0985 7,84 0,91 10,89 13,96 2,198 0,166 17,15 1,22 a Культури вирощували в присутності 50 мкМ субстрату при 24 °C впродовж 48 годин. Числа являють собою середні значення за 2 різними експериментами. b Кількість продукту, що утворювався c % перетворення = ([продукт] / { [продукт] + [субстрат]}) x 100 Таблиця 4: Специфічність елонгуючої активності білків, кодованих Eug-MO7-ELO#10 і Eug-MO7-ELO#14, експресованих у штамі SC334 Saccharomyces cerevisiae. % загального вмісту жирних кислот Eug-MO7-ELO#10 a ГЛК (18:3 n-6) b ДГЛК (20:3n-6) c % перетворення ГЛК  ДГЛК a АРК (20:4 n-6) b Адренова кислота (22:4 n-6) c % перетворення АРК  адренова кислота a СДК (18:4 n-3) b омега-3-ЕТК (20:4n-3) 12,90 0,171 1,31 27,645 0,0 0 6,899 0,077 25 27 Eug-MO7ELO#14 14,23 0,194 1,34 25,044 0,0 0 8,335 0,047 Векторний контроль 14,49 0,164 1,12 22,711 0,019 0,08 8,642 0,198 UA 107468 C2 Таблиця 4: Специфічність елонгуючої активності білків, кодованих Eug-MO7-ELO#10 і Eug-MO7-ELO#14, експресованих у штамі SC334 Saccharomyces cerevisiae. c % перетворення СДК омега-3-ЕТК a ЕПК (20:5 n-3) b омега-3-ДПК (22:5 n-3) c % перетворення ЕПК  омега-3-ДПК 1,10 18,84 0,131 0,69 0,56 13,351 0,093 0,69 2,24 12,016 0,083 0,69 a Культури вирощували в присутності 50 мкМ субстрату при 24 °C впродовж 48 годин. Числа являють собою середні значення за 2 різними експериментами. b Кількість продукту, що утворювався c % перетворення = ([продукт] / { [продукт] + [субстрат]}) x 100 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 5: Експресія дельта-9-елонгази "Eug-MO7-ELO#10" у насінні рослини Кодуючу послідовність елонгази Eug-MO7-ELO#10 ампліфікували за допомогою ПЛР плазміди, що містить відповідний ген, з наступними значеннєвим і антизначеннєвим олігонуклеотидними праймерами (введені сайти для ферментів рестрикції підкреслені): 5’- TATAGAATTCAAATGGACGTCGCGACTACGCTG-3" (SEQ ID NO: 24), та 5’- TATTCTCGAGTTCTAGTCCACTTTCTTCTCATCCTTC-3" (SEQ ID NO: 25). ПЛР-реакцію здійснювали з використанням високоточної полімерази Phusion polymerase (New England Biolabs). Ампліфікований за допомогою ПЛР ген розщеплювали ферментами рестрикції EcoRI та XhoI, і отриманий у результаті цього продукт з'єднували по 5’-кінцю зі специфічним для насіння промотором гліциніну-1 з сої, а по 3’-кінцю з 3’-нетрансльованою областю гліциніну-1 у бінарному векторі p0308-DsRed з одержанням плазміди "pEugELO". Регуляторні елементи гліциніну-1 були раніше описані в Nielsen і ін., "Characterization of the glycinin gene family in soybean" Plant Cell (1989) том 1, стор. 313-328. Даний вектор також містить трансген Ds-Red під контролем промотору вірусу мозаїки маніоку для селекції трансформованого насіння за допомогою флуоресценції й маркера стійкості до канаміцину для селекції бактерій. Як контроль для даних експериментів, ген дельта-9-елонгази Isochrysis galbana (SEQ ID NO: 2) також клонували у вигляді фрагмента EcoRI/XhoI під контроль промотору гліциніну-1 в p0308-Ds-Red з одержанням плазміди "pIsoD9". pEugELO та pIsoD9 вводили в штам C58 MP90 Agrobacterium tumefaciens шляхом електропорації. Стійкі до канаміцину агробактерії потім використовували для трансформування екотипу Col-0 Arabidopsis thaliana за допомогою способу занурення квіткових бруньок ("floral dip") (Clough і ін., "Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana", Plant J (1998) том 16, стор. 735-743). Після занурення квіткових бруньок в агробактерії, рослини залишали при 22 °C з довжиною дня 16 годин до досягнення зрілості, а потім висушували. Для даних експериментів використовували мутант fad3/fae1 Arabidopsis, який містить низькі рівні альфа-ліноленової кислоти й жирні кислоти з дуже довгим ланцюгом (≥C20), але при цьому в олії з його насіння присутні підвищені рівні лінолевої кислоти (Cahoon і ін., "Conjugated fatty acids accumulate to high levels in phospholipids of metabolically engineered soybean and Arabidopsis seeds" Phytochemistry (2006) том 67, стор. 1166-1176). Дане генетичне оточення забезпечує профіль жирних кислот, що приблизно відповідає їх профілю в оліях з насіння таких культур, як сафлор і соя з низьким вмістом ліноленової кислоти. Трансгенне насіння, отримане з рослин Arabidopsis після занурення в агробактерії, ідентифікували за флуоресценцією маркерного білку DsRed, застосовуючи методику, описану в Pidkowich і ін., "Modulating seed beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase II level converts the composition of a temperate seed oil to that of a palm-like tropical oil", Proc Natl Acad Sci U S A (2007) том 104, стор. 4742-4747. Ліпіди, включаючи триацилгліцерини, що входять до складу трансгенного за одним геном і нетрансгенного контрольного насіння, піддавали безпосередній переетерифікації шляхом застосування реагенту гідроксиду триметилсульфонію (TMSH), як описано в Cahoon і Shanklin "Substrate-dependent mutant complementation to select fatty acid desaturase variants for metabolic engineering of plant seed oils", Proc Natl Acad Sci U S A (2000) том 97, стор. 1235012355. Метилові ефіри жирних кислот, отримані з окремого насіння, аналізували за допомогою газової хроматографії з полум'яно-іонізаційним детектуванням, застосовуючи газовий хроматограф Agilent 6890, обладнаний колонкою INNOWax (довжина 30 м x внутрішній діаметр 0,25 мм) і з можливістю програмно змінювати температуру печі від 185 °C (витримування 1 28