Застосування кон’югатів жовчної кислоти або її солей з жирними кислотами для лікування ожиріння печінки, гіперглікемії, діабету та зниження вмісту холестерину в крові

Винахід стосується нових галузей використання певних сполучень жовчної кислоти або її солей з жирними кислотами. З ізраїльської заявки на одержання патенту №123998, за якою вже виданий патент за тим самим номером, відомі сполучення жовчної кислоти або її солей з жирними кислотами (СЖКЖК І) загальної формули І де G - жовчна кислота або радикал солі жовчної кислоти, який за бажанням сполучається у позиції 24 з придатною амінокислотою, W - один або два радикали жирної кислоти з 6-26 атомами вуглецю, а X - NHзв'язок між зазначеними жовчною кислотою або радикалом солі жовчної кислоти та жирною кислотою (кислотами). З зазначеної заявки відомі використання сполук загальної формули І та фармацевтичні композиції, що містять їх, для розчинення холестеринових жовчних каменів у жовчі, з метою профілактики появи або рецидиву таких каменів та послаблення або профілактики атеросклерозу. Відомі також способи лікування зазначених хвороб. Зараз несподівано виявилося, що СЖКЖК та фармацевтичні композиції, що містять їх, де W - один або два радикали жирної кислоти з 14-22 атомами вуглецю, а X - придатний зв'язувальний елемент або прямий С=С зв'язок між зазначеними жовчною кислотою або радикалом солі жовчної кислоти та жирною кислотою (кислотами) (сполуки загальної формули II, надалі СЖКЖК II), та фармацевтичні композиції, що містять їх, мають і інші галузі застосування, а саме: a) зниження вмісту холестерину в крові; b) лікування ожиріння печінки; c) лікування гіперглікемії та діабету. Зазначені СЖКЖК та фармацевтичні композиції, що містять їх, можуть також використовуватися для лікування зазначених хвороб. Зв'язок має бути міцним зв'язком, який є таким, щоб суттєво не піддаватися розпряженню кишковими та/або бактеріальними ферментами у процесі абсорбції. Етерний зв'язок за цих причин не є придатним, оскільки він легко розпряжується. Таким є, зокрема, NH-зв'язок, але припустимі й інші зв'язувальні елементи, наприклад, S, Р, О-етер та ін. Зв'язок може бути в альфа- або бета-конфігурації і може прив'язуватися у різних позиціях молекули жовчної кислоти, переважно у позиціях 3, 6, 7, 12 та 24. Далі пояснюються відповідні хвороби, історія їх лікування та нові застосування заявлених сполук для їх лікування. А. Зниження вмісту холестерину в крові Гіперхолестеринемія шкідлива для здоров'я. Вона спричинює такі важкі захворювання, як ішемічна хвороба серця, інфаркт міокарду, хвороби периферійних судин, можливо, інсульт і т.ін. Зниження вмісту холестерину в крові пом'якшує плин деяких з цих хвороб або навіть запобігає їх появі. Сучасна терапія гіперхолестеринемії спрямована на зниження синтезу ендогенного холестерину в печінці. Статини, що їх використовують з цією метою, інгібують фермент HMG СоАредуктазу. Втім, переважна більшість холестерину надходить до організму з їжею. Дієтичні обмеження виявляються неефективними. Для зв'язування жовчних кислот (продуктів катаболізму холестерину) і локалізації їх у кишковій порожнині, звідкіля вони виводяться з фекаліями, використовувалися також іонообмінні смоли. Ці смоли якось діють на холестерин у крові, але дають також серйозні побічні явища, що обмежує їх застосування. Зараз доведено, що СЖКЖК II зменшують спричинену їжею гіперхолестеринемію у кількох видів тварин, навіть якщо ті не припиняють споживання харчів з високим вмістом холестерину та жирів. B. Лікування ожиріння печінки Ожиріння печінки - одне з найпоширеніших захворювань печінки у наші часи. Воно спричинюється надмірним накопиченням жирів у печінці. Гістологічно це підтверджується наявністю змінних обсягів мікрота/або макропухирчатих краплин жиру в тканинах печінки. Ожиріння печінки може бути наслідком ліків, хімічних речовин, хвороб, бактерій та ін., але головною причиною є надмірне надходження жирів з харчами, що веде до (переважно тулубової) опасистості. Зростаюче поширення надлишкової ваги у розвинених країнах є причиною широкої розповсюдженості ожиріння печінки. Наслідком ожиріння може бути стеатогепатит та цироз, що призводить до захворювань з летальним кінцем. Найкраще лікування від ожиріння печінки харчового походження - то тривала втрата ваги. Проте добре відомо, що цього рідко вдається досягти. Зараз встановлено, що СЖКЖК II можуть пом'якшувати та попереджувати ожиріння печінки. Це також підтверджено невпинним споживанням надлишкового харчу кількома видами тварин. C. Лікування гіперглікемії та діабету Цукровий діабет є розладом метаболізму вуглеводів (глюкози). Схематично він поділяється на тип 1 інсулінзалежний нукровий діабет (ІЗЦД), який характеризується дефіцитом інсуліну, та тип 2 інсуліннезалежний нукровий діабет (ІНЦД), при якому чиниться опір інсуліну. ШЦД часто пов'язується з опасистістю та/або ожирінням печінки. Бувають і інші причини гіперглікемії. Лікування цукрового діабету потребує особливої дієти, ін'єкцій інсуліну та/або прийому оральних засобів від гіперглікемії. Ця терапія спрямована на нормалізацію рівня глюкози в крові. Діабет, особливо погано контрольований, дає дуже важкі ускладнення. Встановлено, що СЖКЖК II знижують та нормалізують рівні глюкози в крові у моделях ІЗЦД та ІНЦД у тварин. Далі цей винахід буде описано з посиланням на наступні приклади та креслення, що не мають обмежувального характеру. У прикладах "звичайна дієта" має такий склад: вуглеводи 50%, білки 21%, жири 4% з мінералами, волокнами та вітамінними добавками (фірми Коффолк, Петах-Тіква, Ізраїль). На кресленнях: Фіг.1А, 1В та 1С зображують концентрації глюкози в крові гризунів натощак на різних режимах дієти з додатком СЖКЖК (150мг/кг/добу) або без нього, а саме: Фіг.1А для щурів (4-тижневий дослід), Фіг. 1В - для хом'яків (3-тижневий дослід), Фіг.1С - для мишей (16-денний дослід). На Фіг.2 представлено ліпідно-білкове співвідношення у печінці мишей лінії C57J/L, що їх годували високожирним харчем з доданням СЖКЖК (150мг/кг/добу) протягом п'яти тижнів. Приклад 1 1. Самці хом'яка Використовували золотих сірійських хом'яків (Анілаб, м.Реховот, Ізраїль) у віці 4-6 тижнів вагою 90-110г. Їх годували літогенною дієтою (№1), доповнюючи звичайну дієту (за вагою) 1% холестерину, 1,2% пальмітинової кислоти, 2% модифікованої кукурудзяної олії (за Ayyad et al., Lipids, 1992:27; 883-998) протягом 10 тижнів. Половині тварин додатково примусово давали внутрішньошлунково 3β-арахідиламід-7a, 12a-дигідроксі-5βхолан-24-ову кислоту в дозі 150мг/кг/добу, суспендовану в сольовому розчині. Контрольні тварини отримували таку саму кількість сольового розчину. За 10 тижнів тварин анестезували та брали серцеву кров на аналіз. Печінку та інші органи видаляли. Рівні холестерину в сироватці визначали автоаналізатором. 2. Миші Використовували самців мишей лінії C57J/L (Джексон Лабораторіз, штат Мен, США) у віці 4-6 тижнів вагою 20-25г. На додаток до звичайної дієти вони одержували за вагою 15% жиру масла, 1% холестерину, 0,5% холевої кислоти, 2% модифікованої кукурудзяної олії [за Khanuja et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995; 92: 77297733] протягом 4-8 тижнів (літогенна дієта №2). Половина групи одержувала внутрішньошлунково 3βарахідиламід-7a, 12a-дигідроксі-5β-холан-24-ову кислоту в дозі 150мг/кг/добу, суспендовану в сольовому розчині. Контрольні тварини отримували таку саму кількість сольового розчину. За 4-8 тижнів тварин анестезували та брали серцеву кров на аналіз. Печінку та інші органи видаляли. Рівні холестерину в сироватці визначали автоаналізатором. Інша група самців мишей лінії C57J/L (Джексон Лабораторіз, штат Мен, США) у віці 4-6 тижнів вагою 20-25г одержувала літогенну дієту (№2) протягом 8 тижнів і потім ще 8 тижнів звичайну дієту. Ці 8 тижнів звичайної дієти тваринам давали 3β-арахідиламід-7a, 12a-дигідроксі-5β-холан-24-ову кислоту в дозі 150мг/кг/добу, суспендовану в сольовому розчині. За 16 тижнів тварин анестезували та брали серцеву кров на аналіз. Печінку та інші органи видаляли. Рівні холестерину в сироватці визначали таким саме чином. Третю групу тварин після 16 тижнів звичайної дієти піддали такому ж аналізу. Кількість тварин у кожній групі та результати наведені нижче у таблиці 1. Дані у таблиці 1 свідчать про те, що СЖКЖК II помітно знижує рівні холестерину в крові у багатьох груп мишей та хом'яків. Приклад 2 Гістологічні дослідження Наявність ожиріння печінки констатував патанатом, який не був знайомий з дослідами, оцінюючи наосліп закодовані слайди. Оцінки виставлялися такі: 0 - немає ожиріння печінки 1 - мінімальне ожиріння печінки вражено менше 5% поверхні печінки 2 - помірковане ожиріння печінки вражено 5-25% поверхні печінки 3 - виражене ожиріння печінки вражено 25-50% поверхні печінки 4 - гостре ожиріння печінки вражено 50% або більше поверхні печінки 1. Хом'яки Використовували золотих сірійських хом'яків (Анілаб, м.Реховот, Ізраїль) у віці 4-6 років вагою 90-110г. Їх годували літогенною дієтою (№1). Половині тварин додатково давали ще внутрішньошлунково 3βарахідиламід-7a, 12a-дигідроксі-5β-холан-24-ову кислоту в дозі 150мг/кг/добу, суспендовану в сольовому розчині. Контрольні тварини отримували таку саму кількість сольового розчину. За 10 тижнів тварин анестезували та забивали. Печінку та інші органи видаляли і вміщували до формаліну для гістологічного дослідження. 2. Миші Використовували самців мишей лінії C57J/L (Джексон Лабораторіз, штат Мен, США) у віці 4-6 тижнів вагою 20-25г. Їх годували "західною" дієтою [George et al. Circulation 2000, 102: 1822-1827] з вмістом 1,5г/кг холестерину та 42% жирів, 43% вуглеводів та 15% білків (у % від калорійності). Половині тварин додатково примусово давали внутрішньо-шлунково 3β-арахідиламід-7a, 12a-дигідроксі-5β-холан-24-ову кислоту в дозі 150мг/кг/добу, суспендовану в сольовому розчині. Контрольні тварини отримували таку саму кількість сольового розчину. За 4 тижні тварин анестезували та забивали. Печінку та інші органи видаляли і вміщували до формаліну перед гістологічним дослідженням. Кількість тварин у кожній групі та результати гістології наведені у таблиці 2. Дані таблиці 2 свідчать, що СЖКЖК знижує та/або попереджує появу ожиріння печінки. Приклад 3 Вплив СЖКЖК на вміст глюкози в крові натощак досліджувався на трьох видах тварин - хом'яках, щурах та мишах. Тварин витримували на звичайній або високожирній дієті (як зазначено). У кожній групі половина тварин отримувала примусово денну дозу СЖКЖК (150мг/кг) диспергованою у 0,5мл сольового розчину. Друга половина також примусово отримувала таку саму кількість сольового розчину. Всіх тварин утримували протягом досліду при 12-годинному циклі день/ніч і 22°С. Усі мали вільний доступ до води. 1. Хом'яки Самців золотого сірійського хом'яка у віці 4 тижнів (90-100г) годували дієтою, що сприяє ожирінню печінки, з вмістом 1мас.% холестерину, 1,2мас.% пальмітинової кислоти, 6мас. % вершкового масла, 10% мас.% сала та 2мас.% кукурудзяної олії на доповнення звичайного раціону. Після 3 тижнів досліду голодних тварин забивали й визначали рівень глюкози в крові. Група налічувала 5 піддослідних та 5 контрольних тварин. 2. Щури Самці щурів лінії Вістар у віці 4 тижнів (100-120г) одержували або звичайну жуйну дієту, або високожирну дієту, збагачену 10мас.% сала, 2,5% холестерину та 0,5мас.% холевої кислоти. Після 4 тижнів досліду голодних тварин забивали й відбирали проби крові та тканин органів. У кожній групі половина тварин одержувала 150мг/кг СЖКЖК, інші - таку саму кількість сольового розчину. У контрольній та дослідній групах по 7 щурів годували звичайною дієтою й по 6 - високожирною. У тих хом'яків та щурів, що одержували високожирну дієту, розвивалося ожиріння печінки (що підтверджує хімічне вимірювання печінкового жиру), високий рівень глюкози в крові натощак, і вони являли класичну картину ІНЦД. 3. Миші Самців мишей ICR у віці 4 тижнів (біля 20г) годували звичайною дієтою. На перший день досліду їм вводили підшкірно 200мг/кг стрептозотоцину. (Це призводило до пошкодження клітин острівця підшлункової залози та симуляції ІНЦД). В забитих після 16 діб досліду тварин відбирали проби крові на глюкозу натощак. Було 3 групи по 7 тварин кожна. Контрольна група одержувала лише звичайну дієту. Тваринам, що одержували стрептозотоцин (СТЗ), сольовий розчин та 150мг/кг/добу СЖКЖК вводили примусово. СЖКЖК, уживаний у цих дослідженнях на гіперглікемію, являв собою сполучення арахінової та холевої кислот (у позиції 3) з амідним зв'язком (С-20 фірми Арамхол). Результати трьох дослідів представлені на Фіг.1А, 1В та 1С (RD - звичайна дієта, FLD - дієта, що сприяє ожирінню печінки, Stz - стрептозотоцин). Як видно, додаток СЖКЖК помітно знижує рівень глюкози в крові натощак у всіх піддослідних тварин. Він ставав нижче у тварин з ожирінням печінки (хом'яків та щурів) з симптомами ІНЦД та у оброблених стрептозотоцином мишей з симптомами ІЗЦД. СЖКЖК не впливав на рівень глюкози у крові щурів, що отримували звичайну дієту й не мали ознак гіперглікемії або ожиріння печінки. Приклад 4 Використовували самців мишей лінії C57J/L (Джексон Лабораторіз, штат Мен, США) у віці 4-6 тижнів вагою 20-25г. Протягом 5 тижнів їх тримали на високожирній дієті з вмістом 1мас.% холестерину, 0,5% холевої кислоти, 10% мас.% сала, 6мас. % вершкового масла, 1,2мас.% пальмітинової кислоти та 2мас.% кукурудзяної олії на доповнення звичайного раціону. Крім того, тварини щодобово примусово отримували або 150мг/кг СЖКЖК, суспендованого у сольовому розчині, або таку саму кількість чистого сольового розчину. СЖКЖК являли собою сполучення холевої кислоти (у позиції 3) з пальмітиновою кислотою (С-16), або арахіновою кислотою (С-20), або бегеновою кислотою (С-22) з використанням амідного зв'язку. Контрольні тварини (n=5) одержували лише сольовий розчин, піддослідні - сполучення С-16 (n=5), сполучення С-20 (n=5) або сполучення С-22 (n=3). За 5 тижнів, протримавши ніч надголодь, тварин анестезували кетаміном, видаляли печінку й умертвляли надлишковою дозою кетаміну. Зразок печінкової тканини 0,5г гомогенізували у 5мл буферного сольового розчину. Ліпіди екстрагували з гомогенізату за Фольхом сумішшю 2 обе. хлороформу : 1 обc. метанолу. 0,5мл гомогенізату екстрагували у 5мл розчину Фольха. Після випарювання розчинника ліпіди зважували та випарювали ще кілька разів, аж доки не отримували постійну масу. Білки кількісно визначали в іншій пробі гомогенізату за Бредфордом [Bradford М.М., Annal.Biochem. 1976, 72:248]. Розрахували масові співвідношення ліпіди : білки. Результати для кожної групи наведені як середні значення (+ стандартне відхилення). Величини для груп наступні: Контрольна - 7,9±2,32, СЖКЖК С-16 - 2,25±1,20, СЖКЖК С-20 - 1,44±1,18, СЖКЖК С-22 - 3,00±1,08. Ці результати наведені на Фіг.2. Ці дані доводять, що заявлену дію справляють кілька сполучень, причому деякі з них майже такі міцні, як сполучення С-20, застосований у прикладах 1, 2 та 3.