Fgf21 мутанти і їх застосування

Реферат: Винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, що кодує FGF21 мутантні поліпептиди, FGF21 мутантні поліпептиди, фармацевтичні композиції, що включають FGF21 мутантні поліпептиди, і способи лікування метаболічних розладів з використанням таких нуклеїнових кислот, поліпептидів або фармацевтичних композицій. UA 105016 C2 (12) UA 105016 C2 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Перехресне посилання на родинну заявку Дана заявка повідомляє про пріоритет попередньої заявки США під номером 61/195761 від 19 жовтня 2008 року. Рівень техніки 1.Галузь техніки Даний винахід стосується молекул нуклеїнової кислоти, що кодують FGF21 мутантні поліпептиди, FGF21 мутантних поліпептидів, фармацевтичних композицій, що включають FGF21 мутантні поліпептиди, і способів лікування метаболічних розладів з використанням таких нуклеїнових кислот, поліпептидів або фармацевтичних композицій. 2.Рівень техніки FGF21 є секретованим поліпептидом, що належить до підродини факторів росту фібробластів (FGFs), що включає FGF19, FGF21, і FGF23 (Itoh et al., 2004, Trend Genet. 20: 56369). FGF21 є атиповим FGF у тому, що він є гепариннезалежним і діє як гормон у регуляції глюкозного, ліпідного й енергетичного метаболізму. FGF21 був виділений з печінкової кДНК бібліотеки як печіночний секретований фактор. Він сильно експресований у печінці й підшлунковій залозі і є єдиним членом FGF сімейства, експресованим, головним чином, у печінці. Трансгені миші, гіперекспресуючі FGF21, виявляють метаболічні фенотипи вповільненого росту, низьких рівнів глюкози й тригліцеридів у плазмі й відсутність вікового діабету типу 2, острівкової гіперплазії й ожиріння. Фармакологічне застосування рекомбінантного FGF21 протеїну в моделях дрифтерів гризунів дало нормалізовані рівні глюкози в плазмі, знижені рівні триглицеридів і холестерину, і поліпшені толерантність до глюкози й чутливість до інсуліну. Крім того, FGF21 знижує вагу тіла й ожиріння шляхом збільшення витрати енергії, фізичної активності й інтенсивності обміну речовин. Експериментальні дослідження підтверджують фармакологічне застосування FGF21 для лікування діабету типу 2, ожиріння, дисліпідемії й інших метаболічних станів або розладів у людей. Людський FGF21 має короткий період напіврозпаду in vivo. У мишей і мавп cynomolgus ефективний період напіврозпаду людського FGF21 становить від 1 до 2 годин. При розробці FGF21 протеїну для використання як терапевтичного препарату при лікуванні діабету типу 2 було б бажаним збільшення періоду напіврозпаду. FGF21 протеїни зі збільшеним періодом напіврозпаду могли б забезпечити пацієнтам, яким призначений даний протеїн, менш часте дозування. Сутність винаходу В одному варіанті даний винахід пропонує ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид SEQ ID NO: 4, що має, щонайменше, одну амінокислотну субституцію, що являє собою: (a) лізиновий залишок в одному або декількох положеннях 36, 72, 77, 126 і 175; (б) цистеїновий залишок в одному або декількох положеннях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, і 179; (в) аргініновий залишок в одному або декількох положеннях 56, 59, 69, і 122; (г) гліциновий залишок у положенні 170; (д) гліциновий залишок у положенні 171; і комбінації (а) - (д). В іншому варіанті даний винахід пропонує ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, що має, щонайменше, одну амінокислотну субституцію, що являє собою: (a) лізиновий залишок в одному або декількох положеннях 36, 72, 77, 126 і 175; (б) цистеїновий залишок в одному або декількох положеннях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, і 179; (в) аргініновий залишок в одному або декількох положеннях 56, 59, 69, і 122; (г) гліциновий залишок у положенні 170; (д) гліциновий залишок у положенні 171; і комбінації (a) - (д), і що включає добавки, делеції або додаткові субституції, які роблять даний поліпептид, щонайменше, на 85 % ідентичним SEQ ID NO:4, за умови, що, щонайменше, одна амінокислотна субституція пункту 1(a) - (д) не є додатково модифікованою. Даний винахід пропонує також вектори й клітини-хазяї, що включають молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу. У ще одному варіанті даний винахід пропонує ізольований поліпептид, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, що має, щонайменше, одну амінокислотну субституцію, що являє собою: (а) лізиновий залишок в одному або декількох положеннях 36, 72, 77, 126 і 175; (б) цистеїновий залишок в одному або декількох положеннях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, і 179; (в) аргініновий залишок в одному або декількох положеннях 56, 59, 69, і 122; (г) гліциновий залишок у положенні 170; (д) гліциновий залишок у положенні 171; і комбінації (a) - (д). 1 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У ще одному варіанті даний винахід пропонує ізольовану нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, що має, щонайменше, одну амінокислотну субституцію, що являє собою: (a) лізиновий залишок в одному або декількох положеннях 36, 72, 77, 126 і 175; (б) цистеїновий залишок в одному або декількох положеннях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, і 179; (в) аргініновий залишок в одному або декількох положеннях 56, 59, 69, і 122; (г) гліциновий залишок у положенні 170; (д) гліциновий залишок у положенні 171; і комбінації (a) - (д), і включающую добавки, делеции або додаткові субституції, які роблять даний поліпептид, щонайменше, на 85 % ідентичним SEQ ID NO:4, за умови, що, щонайменше, одна амінокислотна субституція пункту 1(a) - (д) не є додатково модифікованою. У ще одному варіанті даний винахід пропонує ізольований поліпептид, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, що має, щонайменше, одну амінокислотну субституцію, що являє собою: (а) лізиновий залишок в одному або декількох положеннях 36, 72, 77, 126 і 175; (б) цистеїновий залишок в одному або декількох положеннях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, і 179; (в) аргініновий залишок в одному або декількох положеннях 56, 59, 69, і 122; (г) гліциновий залишок у положенні 170; (д) гліциновий залишок у положенні 171; і комбінації (a) - (д), і включающий добавки, делеції або додаткові субституції, які роблять даний поліпептид, щонайменше, на 85 % ідентичним SEQ ID NO:4, за умови, що, щонайменше, одна амінокислотна субституція пункту 1(a) - (д) не є додатково модифікованою. Крім того, цей винахід пропонує композицію, що включає перший поліпептид, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, що має, за необхідності, щонайменше, одну амінокислотну субституцію, що являє собою: (a) лізиновий залишок в одному або декількох положеннях 36, 72, 77, 126 і 175; (б) цистеїновий залишок в одному або декількох положеннях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, і 179; (в) аргініновий залишок в одному або декількох положеннях 56, 59, 69, і 122; (г) гліциновий залишок у положенні 170; (д) гліциновий залишок у положенні 171; і комбінації (a) - (д), з'єднаний лінкером із другим поліпептидом, що включає поліпептид, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, що має, за необхідності, щонайменше, одну амінокислотну субституцію, що представляє собою: (a) лізиновий залишок в одному або декількох положеннях 36, 72, 77, 126 і 175; (б) цистеїновий залишок в одному або декількох положеннях 37, 38, 46, 91, 69, 77, 79, 87, 91, 112, 113, 120, 121, 125, 126, 175, 170, і 179; (в) аргініновий залишок в одному або декількох положеннях 56, 59, 69, і 122; (г) гліциновий залишок у положенні 170; (д) гліциновий залишок у положенні 171; і комбінації (a) - (д). Даний винахід також пропонує хімічно модифіковані форми поліпептидів даного винаходу. Хімічно модифіковані форми даних поліпептидів включають полімер, приєднаний до N-Кінця, і/або сайту приєднання природного або неприродного полімеру. Даний винахід також пропонує фармацевтичні композиції й способи лікування метаболічних розладів, таких як ожиріння й діабет, що включають призначення фармацевтичних композицій цього винаходу пацієнтові, якому це необхідно. Специфічні варіанти цього винаходу стануть очевидними з наступного більш детального опису деяких варіантів і пунктів формули винаходу. Короткий опис фігур Фігура 1 являє собою малюнок, що зображує молекулу FGF21 із двома полімерами (наприклад, молекули поліетиленгліколя (ПЕГ)), приєднаними до даної послідовності. Фігура 2 включає чотири SDS-PAGE (додецилсульфат натрій-поліакриламідних) геля, що показують ступінь ПЕГілювання дев'яти FGF21 мутантів з єдиним створеним способами генної інженерії сайтом приєднання полімеру, хімічно модифікованим ПЕГ, а саме, E37C, R77C і H125C (угорі ліворуч), D38C, D46C і D79C (угорі праворуч), H87C, E91C, G113C (унизу ліворуч) і G120C, R126C, N121C (унизу праворуч). Фігура 3 включає SDS-PAGE гель, що показує ступінь ПЕГілювання трьох FGF21 мутантів, що мають єдиний створений способами генної інженерії сайт приєднання полімеру, хімічно модифікований молекулою 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти, а саме, K69C, R175C і Y179C. Фігура 4 включає два графіка, що представляють результати ELK-Люциферазної проби, проведеної на FGF21 мутантних поліпептидах з єдиними створеними способами генної інженерії сайтами приєднання полімеру, хімічно модифікованими шляхом приєднання молекули 20 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти, а саме, E37C, R77C, E91C, FGF21 дикого типу й ПЕГільованого за N-кінцем FGF21 (верхній графік) і G113C, N121C, D46C, FGF21 дикого типу й ПЕГільованого за N-кінцем FGF21 (нижній графік). 2 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фігура 5 включає два графіка, що представляють результати ELK-Люциферазної проби, проведеної на FGF21 мутантних поліпептидах з єдиними створеними способами генної інженерії сайтами приєднання полімеру, хімічно модифікованими шляхом приєднання молекули 20 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти, а саме, H125C, G120C, R126C, FGF21 дикого типу й ПЕГільованого за N-кінцем FGF21 (верхній графік) і D79C, D38C, FGF21 дикого типу й ПЕГільованого за N-кінцем FGF21 (нижній графік). Фігура 6 включає два графікав, що представляють результати ELK-Люциферазної проби, проведеної на поліпептидах FGF21 дикого типу й FGF21 мутантних поліпептидах з єдиним створеним способами генної інженерії сайтом приєднання полімеру, хімічно модифікованим шляхом приєднання молекули 20 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти, а саме, K69C, D79C, FGF21 дикого типу й ПЕГилированного за N-кінцем FGF21 (верхній графік), і R175C, Y179C, FGF21 дикого типу й ПЕГільованого по N-Кінці FGF21 (нижній графік). Фігура 7 являє собою малюнок, що зображує "Зв'язану молекулу" цього винаходу. Фігура 8 являє собою графіка, що зображує процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей у часі (від 0 часу) після одиничної ін'єкції наповнювача (фізіологічного розчину з фосфатним буфером), FGF21 дикого типу або N-термінально ПЕГільоованого FGF21 дикого типу. Фігура 9 являє собою графіка, що зображує процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (фізіологічного розчину з фосфатним буфером), або FGF21 дикого типу, що був N-термінально ПЕГільований молекулами 20, 30 або 40 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти. Фігура 10 включає дві графіки, що зображують процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей протягом дев'ятидобового періоду від 0 часу після одиничної ін'єкції фізіологічного розчину з фосфатним буфером або N-термінально ПЕГільованих FGF21 мутантних поліпептидів, що включають мутації R77C або R126K, які були додатково ПЕГільовані по цих введених сайтах приєднання полімеру молекулами 20 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти, і злиття, що включає Fc молекулу й G170E FGF21 мутантний поліпептид (верхній графік); або Nтермінально ПЕГільований FGF21 мутантний поліпептид, що включає мутації R77C, додатково ПЕГільовані по цьому введеному сайті приєднання полімеру молекулою 20 кДа метоксіПЕГ іміда малеїнової кислоти, і P171G (нижній графік). Фігура 11 являє собою графік, що зображує процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм фосфату калію, 5 % сорбіту, pH 8) або FGF21 мутантних поліпептидів, які були двічі ПЕГільовані молекулами 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E91C/H125C, E91C/R175C, E37C/G120C, E37C/H125C, і E37C/R175C; було досліджено також злиття, що включає Fc молекулу й P171G FGF21 мутантний поліпептид. Фігура 12 являє собою графік, що зображує процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм фосфату калію, 5 % сорбіту, pH 8) або FGF21 мутантних поліпептидів, які були двічі ПЕГільовані молекулами 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E91C/H121C, G120C/H125C, або E37C/R77C; досліджене також злиття, що включає Fc молекулу й G170E FGF21 мутантний поліпептид. Фігура 13 являє собою графік, що зображує процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм фосфату калію, 5 % сорбіту, pH 8) або FGF21 мутантними поліпептидами, які були двічі ПЕГільовані молекулами 20 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E37C/R77C, E91C/R175C, E37C/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G і E37C/R125C/P171G. Фігура 14 являє собою графік, що зображує процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей від 0 часу після введення одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм фосфату калію, 5 % сорбіту, pH 8), FGF21 мутантних поліпептидів, які були двічі ПЕГільовані молекулами 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E37C/R77C/P171G і E91C/R125C/P171G, або "Зв'язаними молекулами", що включають два ідентичних FGF21 мутантних поліпептиди, що мають однакові введені мутації, а саме, R77C/P171G (2x) і R78C/P172G (2x), які були з'єднані через молекули 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти. Фігура 15 являє собою графіка, що зображує процентну зміну рівнів глюкози в крові в мишей залежно від дози від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм Tris HCl, 150 мм NaCl, pH 8,5), або FGF21 мутантного поліпептиду, що був двічі ПЕГільований молекулами 20 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти, а саме, E37C/R77C/P171G, і застосовувалися при дозах 0,01 мг/кг, 0,03 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,3 мг/кг або 1 мг/кг. 3 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фігура 16 являє собою графіка, що зображує зміну ваги тіла в мишей від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм фосфату калію, 5 % сорбіту, pH 8) або FGF21 мутантних поліпептидів, які були двічі ПЕГільовані молекулами 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E37C/R77C, E91C/R175C, E37/H125C, E37C/R77C/P171G, E91C/R77C/P171G і E37C/R125C/P171G. Фігура 17 являє собою графіка, що зображує зміну ваги тіла в мишей від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм фосфату калію, 5 % сорбіту, pH 8), FGF21 мутантних поліпептидів, які були двічі ПЕГільовані молекулами 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E37C/R77C/P171G і E91C/R125C/P171G, або "Зв'язаними молекулами", що включають два FGF21 мутантних поліпептиди, що мають однакові введені мутації, а саме, R37C/P171G (2x) і R77C/P171G (2x), які були з'єднані через молекулу 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти. Фігура 18 являє собою графік, що зображує зміну ваги тіла в мишей залежно від дози від 0 часу після одиничної ін'єкції наповнювача (10 мм Tris HCl, 150 мм NaCl, pH 8.5), або FGF21 мутантного поліпептиду, котрий був двічі ПЕГільований молекулами 20 кДа метоксі ПЕГ іміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E37C/R77C/P171G, і застосовувався при п'яти різних дозах. Фігури 19A-19F являють собою серію із шести графіків, що зображують зміну ваги тіла в мишей протягом восьмитижневих досліджень брунькових вакуолів при дозуванні раз у тиждень наповнювача (квадрати), 5 мг/кг (трикутники) і 25 мг/кг (не заштриховані кружечки) ПЕГільованих FGF21 молекул. Миші, яким уводили дози двічі- цистеїн ПЕГільованих FGF21 молекул, виявляли безперервну втрату ваги, тоді як миші, яким вводили "Зв'язані молекули", виявляли, головним чином, тимчасову втрату ваги. Фігура 20 включає дві гістограми, що зображують результати восьмитижневого дослідження брунькових вакуолею в мишей, яким уводили ін'єкції наповнювача або FGF21 мутантного поліпептиду, що був двічі ПЕГьований молекулами 20 кДа метоксіПЕГіміда малеїнової кислоти по введених сайтах приєднання полімеру, а саме, E37C/R77C/P171G; E37/H125C/P171G; E91C/H125C/P171G; E37C/P171G; R77C/P171G; і R77C/ P171G; випробовували дві різні дози. Докладний опис винаходу Людський FGF21 протеїн з поліпшеними властивостями, такими як збільшений період напіврозпаду, може бути отриманий з використанням способів, розкритих у даній заявці, і стандартних способів молекулярної біології. Відомо, що шляхом зв'язування одного або декількох водорозчинних полімерів, таких як молекули ПЕГ, із протеїном період напіврозпаду даного протеїну може бути розширений. Так, у різних варіантах період напіврозпаду природного FGF21 може бути розширений шляхом введення амінокислотних субституцій у даний протеїн з утворенням крапок, у яких полімер може бути приєднаний до даного FGF21 протеїну. На такі модифіковані протеїни тут посилаються як на FGF21 мутанти, і вони становлять варіанти цього винаходу. Полімери можуть бути також введені в N-Кінець FGF21 молекули в сполученні із введенням сайту приєднання неприродного полімеру. Використані тут способи рекомбінантних нуклеїнових кислот, включаючи Приклади, у цілому, відповідають тим, що представлено в роботах Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) або Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), на які в даній заявці зроблені посилання. 1.Загальні визначення Як тут використовується, термін "a" означає один або більше, якщо спеціально не обумовлено інше. Термін "ізольована молекула нуклеїнової кислоти" ставиться до молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу, що (1) була відділена від, щонайменше, приблизно 50 відсотків протеїнів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими вона перебуває в природі, коли повна нуклеїнова кислота виділяється із клітин-джерел, (2) не зв'язана з усім полінуклеотидом або його частиною, з яким "ізольована молекула нуклеїнової кислоти" зв'язана в природі, (3) зв'язана діючим чином з полінуклеотидом, з яким вона не зв'язана в природі, або (4) не зустрічається в природі як частина більшої полінуклеотидної послідовності. Краще, коли ізольована молекула нуклеїнової кислоти цього винаходу значною мірою вільна від молекул будь-яких інших забруднюючих нуклеїнових кислот або інших контамінантів, які перебувають у її природному навколишнім середовищі, які можуть перешкодити її використанню у виробництві поліпептидів або в її терапевтичному, діагностичному, профілактичному або дослідницькому застосуванні. 4 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "ізольований поліпептид" стосується поліпептиду цього винаходу, що (1) відділений від, щонайменше, приблизно 50 відсотків полінуклеотидів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він перебуває в природі, коли виділяється із клітини-джерела, (2) не зв'язаний (шляхом ковалентної або нековалентної взаємодії) з усім поліпептидом або його частиною, з яким "ізольований поліпептид" зв'язаний у природі, (3) зв'язаний діючим чином (шляхом ковалентної або нековалентної взаємодії) з поліпептидом, з яким він не зв'язаний у природі, або (4) не зустрічається в природі. Краще, коли ізольований поліпептид цього винаходу значною мірою вільний від будь-яких інших забруднюючих поліпептидів або інших контамінантів, які перебувають у його природному навколишнім середовищі, які можуть перешкодити його терапевтичному, діагностичному, профілактичному або дослідницькому застосуванню. Термін "вектор", що використовується тут, стосується будь-якої молекули (наприклад, нуклеїнової кислоти, плазміди або вірусу) використовуваної для переносу інформації, що кодує, у клітину-хазяїна. Термін "експресуючий вектор" стосується вектора, що підходить для трансформації клітинихазяїна й містить нуклеїновокислотні послідовності, що спрямовують, і/або контролють експресію впроваджених гетерологічних нуклеїновокислотних послідовностей. Експресія включає, однак, не обмежуючись цим, процеси, такі як транскрипція, трансляція й РНК сплайсінг, якщо присутні інтрони. Термін “ клітина-хазяїн" використовується відносно клітини, що трансформована або здатна трансформуватися нуклеїновокислотною послідовністю й потім експрессувати обраний ген, що представляє інтерес. Даний термін включає потомство батьківської клітини, незалежно від того, чи є дане потомство ідентичним за морфологією або генетичною конструкцією з оригінальним батьком, за умови присутності даного обраного гена. Термін "природний", при використанні у зв'язку з біологічними матеріалами, такими як молекули нуклеїнової кислоти, поліпептиди, клітини-хазяї й так подібне, стосується матеріалів, які перебувають у природі й не піддавалися яким-небудь маніпуляціям, здійснюваним людиною. Подібно цьому, термін "неприродний", що використовується тут, стосується матеріалу, що відсутній у природі або був структурно модифікований або синтезований людиною. При використанні у зв'язку з нуклеотидами, термін "природний" стосується основ - аденін (A), цитозин (C), гуанін (G), тимін (T), і урацил (U). При використанні у зв'язку з амінокислотами термін "природний" стосується 20 амінокислот - аланін (A), цистеїн (C), аспарагінова кислота (D), глутамінова кислота (E), фенілаланін (F), гліцин (G), гістидин (H), ізолейцин (I), лізин (K), лейцин (L), метіонін (M), аспарагін (N), пролін (P), глутамін (Q), аргінін (R), серин (S), треонін (T), валін (V), триптофан (W), і тирозин (Y). Термін "FGF21 поліпептид" стосується будь-якого природного поліпептиду дикого типу, експресованого в людях. Для цілей цієї заявки термін "FGF21 поліпептид" може використовуватися взаємозамінно й стосуватися FGF21 поліпептиду повної довжини, що складається з 209 амінокислотних залишків (SEQ ID NO: 2) і який кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 1; і зрілої форми даного поліпептиду, що складається з 181 амінокислотного залишку (SEQ ID NO: 4), що кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 3, і в якій 28 амінокислотних залишків в амінотермінальном кінці FGF21 поліпептиду повної довжини (тобто які становлять сигнальний пептид) були вилучені. FGF21 поліпептид може бути експресований з або без N-кінцевого метіонинового залишку; як тут відзначалось, N-кінцевий метіоніновий залишок може бути доданий шляхом конструювання або як функція бактеріальної системи експресії. Термін "біологічно активний" стосовно до FGF21 поліпептиду, включаючи описані тут FGF21 мутантні поліпептиди, стосується природної активності FGF21 поліпептиду дикого типу, такої як здатність знижувати глюкозу в крові, інсулін, тригліцерид або холестерин; знижувати вагу тіла; і поліпшувати толерантність до глюкози, витрату енергії або чутливість до інсуліну. Що стосується FGF21 мутантного поліпептиду, даний термін не залежить від типу або числа модифікацій, введених в FGF21 мутантний поліпептид. Наприклад, деякі FGF21 мутантні поліпептиди мають трохи знижений рівень FGF21 активності стосовно поліпептиду FGF21 дикого типу, але, проте, розглядаються як біологічно активні FGF21 мутантні поліпептиди. Розходження в активності конкретного мутантного поліпептиду FGF21 можуть спостерігатися між in vivo і in vitro пробами; будь-які такі розходження пов'язані з конкретними використаними пробами. Таке спостереження, однак, не впливає на значення терміна "біологічно активний" і FGF21 мутантні поліпептиди, які виявляють природну активність поліпептиду FGF21 дикого типу, таку як здатність знижувати глюкозу в крові, інсулін, тригліцерид або холестерин; 5 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 знижувати вагу тіла; і поліпшувати толерантність до глюкози, витрату енергії або чутливість до інсуліну, у будь-якій in vivo або in vitro пробі є "біологічно активними.” Терміни "ефективна кількість" і "терапевтично ефективна кількість" використовуються взаємозамінно й стосуються кількості FGF21 мутантного поліпептиду, використовуваного для підтримки спостережуваного рівня однієї або декількох біологічних активностей поліпептиду FGF21 дикого типу, такий як здатність знижувати глюкозу в крові, інсулін, тригліцерид або рівні холестерину; знижувати вагу тіла; або поліпшувати толерантність до глюкози, витрату енергії або чутливість до інсуліну. Термін "фармацевтично прийнятний носій" або "фізіологічно прийнятний носій", що використовується тут, стосується одного або декількох матеріалів композиції, придатних для реалізації або посилення доставки FGF21 мутантного поліпептиду. Приклади таких матеріалів можна знайти в роботі Remington, supra, на яку в даній заявці зроблене посилання. Термін "Зв'язана молекула" стосується конструкта, що включає дві або більше FGF21 молекули, зв'язаних молекулою лінкера. "Зв'язана молекула" включає, щонайменше, два FGF21 поліпептиди, щонайменше один із яких є FGF21 мутантним поліпептидом, описаним тут, але може включати три, чотири або більше FGF21 або FGF21 мутантних поліпептиди, з'єднаних за допомогою лінкеров. Таким чином, термін "Зв'язана молекула" не обмежується молекулою, що включає комбінації тільки одного або двох FGF21 або FGF21 мутантних поліпептидів. Термін "сайт приєднання полімеру" стосується галузі головної амінокислотної послідовності поліпептиду (наприклад, FGF21 поліпептиду), що може бути хімічно адаптованою до ковалентної асоціації з полімером (наприклад, молекулою ПЕГ всіх молекулярних ваг, полімерної манозою, гліканами й т.д.). Сайт приєднання полімеру може означати окрему амінокислоту (наприклад, цистеїн, лізин, аргінін або принадну неприродну амінокислоту), або даний термін може ставитися до двох або більшої кількості амінокислот, які перебувають по сусідству одна з інший або в послідовності або в просторі. Термін "хімічно модифікований", використовуваний у відношенні FGF21 дикого типу або FGF21 мутантного поліпептиду, описаного тут, стосується FGF21 поліпептиду, що був модифікований зі свого природного стану шляхом ковалентного приєднання однієї або декількох гетерологічних молекул. Приклади гетерологічних молекул включають поліетиленгліколь (ПЕГ), монометоксі-поліетиленгліколь, декстран, целюлозу, полі- (N-вінил пірролідон) поліетиленгліколь, пропіленгліколеві гомополімери, поліпропілен оксид/етилен оксид сополімери, поліоксіетильовані поліоли, гідроксилетил крохмаль (ГЕК), і полівініловий спирт. Приклади хімічно модифікованих FGF21 поліпептидів включають ПЕГільовані FGF21 поліпептиди дикого типу й FGF21 мутантні поліпептиди. 2.FGF21 мутантні поліпептиди У різних аспектах даний винахід розкриває ряд способів для сайт-спрямованого ПЕГілювання FGF21 і FGF21 мутантних поліпептидів, що може підсилити фармакокінетичні властивості FGF21 молекули при мінімізації впливу на in vitro активність. Посилений фармакокінетичний профіль цих ПЕГільованих FGF21 молекул впливає на in vivo ефективність даної молекули шляхом збільшення експозиції стосовно даного терапевтичного агента. Крім того, описані тут стратегії сумісні зі створенням множинних сайтів ПЕГілювання, які можуть додатково підсилити фармакокінетичні властивості даної молекули й знизити їх вакуолеформуючий потенціал. Для реалізації цього були застосовані дві головні стратегії, описані тут. В одному аспекті, цей винахід стосується FGF21 послідовностей, у які були введені одна або кілька модифікацій. Таким чином, терміни "FGF21 мутантний поліпептид" і "FGF21 мутант" які можуть використовуватися взаємозамінно, стосуються FGF21 поліпептиду, у якому амінокислотна послідовність FGF21 дикого типу (наприклад, SEQ ID номери 2 або 4) була модифікована. Такі модифікації включають, однак, не обмежуючись цим, одну або кілька амінокислотних субституцій, включаючи субституції неприродними амінокислотними аналогами, інсерції й процессинг. Так, FGF21 поліпептидні мутанти включають, однак, не обмежуючись цим, сайт-спрямовані FGF21 мутанти, такі, що вводять сайт приєднання неприродного полімеру, або які впливають на ступінь опору протеолізу, як тут описано. Для ідентифікації специфічних амінокислотних субституцій FGF21 мутантів цього винаходу нумерація усічених або мутованих залишків відповідає нумерації зрілого 181-залишкового FGF21 поліпептиду (тобто N-кінець даної послідовності починається HPIPD, і ці залишки позначені як залишки 1, 2, 3, 4 і 5, відповідно). N-кінцевий метіоніновий залишок може бути присутнім, але в цьому немає потреби; цей N-кінцевий метіоніновий залишок не включений у схему нумерації даного протеїну. Як вказувалися, FGF21 мутанти, включаючи усічені форми FGF21, що включають одну або кілька субституцій або інсерцій, які містять неприродні амінокислоти, становлять варіант даного 6 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу. Такі інсерції або субституції можуть впливати на різні властивості, включаючи їхню дію як сайтів для приєднання полімеру. У таких випадках неприродні амінокислоти можуть бути введені в FGF21 послідовність на додаток до описаних тут різних мутацій. Відповідно, FGF21 мутант може включати одну або кілька мутацій, описаних тут, і може додатково включати одну або кілька неприродних амінокислот. Неповний список прикладів неприродних амінокислот, які можуть бути впроваджені в FGF21 послідовність або можуть заміщати залишок дикого типу в FGF21 послідовності, включають β-амінокислоти, гомоамінокислоти, циклічні амінокислоти й амінокислоти з дериватизованими бічними ланцюгами. Приклади включають (в L-Формі або Dформі; скорочення як у дужках): пари-ацетил-фенілаланін, пари-азидо-фенілаланін, парибромо-фенілаланін, пари-йодо-фенілаланін іпари-фенілаланін, цитруллін (Cit), гомоцитруллін (hCit), Nα-метилцитруллін (NMeCit), Nα-метилгомоцитруллін (Nα-MeHoCit), орнітин (Orn), Nαметилорнітин (Nα-MeOrn або NMeOrn), саркозин (Sar), гомолізин (hLys або hK), гомоаргінін (hArg або hR), гомоглутамін (hQ), Nα-метиларгінін (NMeR), Nα-метиллейцин (Nα-MeL або NMeL), N-метилгомолізин (NMeHoK), Nα-метилглутамін (NMeQ), норлейцин (Nle), норвалін (Nva), 1,2,3, 4-тетрагідроізохінолін (Tic), октагідроіндол-2-карбонова кислота (Oic), 3- (1-нафтил)аланін (1Nal), 3- (2-нафтил)аланін (2- Nal), 1,2,3, 4-тетрагідроізохінолін (Tic), 2-інданілгліцин (IgI), парийодофенілаланін (pI- Phe), пари-амінофенілаланін (4AmP або 4-Amino-Phe), 4-гуанідино фенілаланін (Guf), гліциллізин (скорочено "K(Nε-glycyl)” або "K(glycyl)” або "K(gly)”), нітрофенілаланін (нитроф), амінофенілаланін (аміноф або Amino-Phe), бензилфенілаланін (бензилфе), γ-карбоксіглутамінова кислота (γ-карбоксиглу), гідроксіпролін (гідроксіпро), pкарбоксил-фенілаланін (Cpa), α-аміноадипиновая кислота (Aad), Nα-метил валін (NMeVal), N-αметил лейцин (NMeLeu), Nα-метилнорлейцин (NMeNle), циклопентилгліцин (Cpg), циклогексилгліцин (Chg), ацетиларгінін (ацетиларг), α, β-діамінопропіонова кислота (Dpr), α, γдиаміномасляная кислота (Dab), діамінопропіонова кислота (Dap), циклогексилаланін (Cha), метил-фенілаланін (MePhe), β, β- дифеніл-аланін (BiPhA), аміномасляна кислота (Abu), фенілфенілаланін (або біфенілаланін; 4Bip), α-аміно-ізомасляна кислота (Aib), бета-аланін, бетаамінопропіонова кислота, піперідинова кислота, амінокапронова кислота, аміногептанова кислота, амінопімелінова кислота, десмозин, діамінопімелінова кислота, N-етилгліцин, Nетиласпаргін, гідроксілізин, алло-гідроксілізин, изодесмозин, алло-ізолейцин, N- метилгліцин, Nметилізолейцин, N-Метилвалін, 4-гідроксіпролін (Hyp), γ-карбоксіглутамат, ε-N, N, NТриметиллізин, ε- N-Ацетиллізин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметіонін, 3метилгістидин, 5-гідроксілізин, ?-метиларгінін, O-фталева кислота (4APA), і інші подібні амінокислоти, і дериватизовані форми всіх конкретно перерахованих сполук. В інших варіантах цього винаходу FGF21 мутантний поліпептид включає амінокислотну послідовність, що, щонайменше, на приблизно 85 відсотків ідентична амінокислотній послідовності FGF21 дикого типу (наприклад, SEQ ID NOs: 2 або 4), але де специфічні залишки, що вводять сайти приєднання неприродного полімеру в FGF21 мутантному поліпептиді, не були додатково модифіковані. Інакше кажучи, за винятком залишків в FGF21 мутантної послідовності, які були модифіковані для введення сайту приєднання неприродного полімеру, або мутації для підвищення резистентності до протеолізу, близько 15 відсотків всіх інших амінокислотних залишків в FGF21 мутантної послідовності можуть бути модифіковані. Наприклад, в FGF21 мутантному поліпептиді G170C, до 15 відсотків всіх амінокислотних залишків, відмінних від гліцинового залишку в положенні 170, можуть бути модифіковані. У ще інших варіантах, FGF21 поліпептидний мутант включає амінокислотну послідовність, що, щонайменше, на приблизно 90 відсотків, або приблизно 95, 96, 97, 98, або 99 відсотків ідентична амінокислотній послідовності FGF21 дикого типу (наприклад, SEQ ID NO: 2, 4, 6 або 8), але де специфічні залишки, які були модифіковані для введення сайту приєднання неприродного полімеру або посилення резистентності до протеолізу, додатково не модифікувалися. Такі FGF21 мутантні поліпептиди володіють, щонайменше, однією активністю поліпептиду FGF21 дикого типу. FGF21 мутантні поліпептиди можуть бути генеровані шляхом введення амінокислотних субституцій, консервативних або неконсервативних по своїй природі, і з використанням природних або неприродних амінокислот, в особливих положеннях FGF21 поліпептиду. Такі субституції можуть бути зроблені на додаток до субституцій, сконструйованих (або спостережуваних) для додання бажаної властивості FGF21 поліпептиду. Як приклад, FGF21 мутантний поліпептид може включати субституцію, сконструйовану для одержання бажаної властивості, такого як введення сайту приєднання неприродного полімеру або посилення резистентності до протеолізу, і може додатково включати одну або кілька консервативних або неконсервативних субституцій, які можуть, але це не обов'язково, підтримувати біологічну активність поліпептиду FGF21 дикого типу. 7 UA 105016 C2 5 10 15 20 FGF21 мутації можуть бути консервативними або неконсервативними. "Консервативна амінокислотна субституція" може включати субституцію залишку природної амінокислоти (тобто залишку, що перебуває в даному положенні поліпептидної послідовності FGF21 дикого типу) з неприродним залишком (тобто залишком, що не перебуває в даному положенні поліпептидної послідовності FGF21 дикого типу), таким чином, що це впливає або взагалі не робить впливу на полярність або заряд амінокислотного залишку в цьому положенні. Консервативні амінокислотні субституції також охоплюють залишки неприродних амінокислот, які звичайно вводяться шляхом хімічного пептидного синтезу, а не синтезом у біологічних системах. Вони включають пептидомиметики й інші зворотні або інвертовані форми амінокислотних складових. Природні залишки можуть бути розділені на класи, ґрунтуючись на загальних властивостях бічних ланцюгів: (1)гідрофобні: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2)нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr; (3)кислотні: Asp, Glu; (4)основні: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5)залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; і (6)ароматичні: Trp, Tyr, Phe. Консервативні субституції можуть включати обмін члену одного із цих класів на інший член з того ж класу. Неконсервативні субституції можуть включати обмін члену одного із цих класів на член з іншого класу. Бажані амінокислотні субституції (консервативні або неконсервативні) можуть бути визначені за необхідності фахівцями в даній галузі. Ілюстративний (але не обмежуючий) список амінокислотних субституцій наведений у Таблиці 1. Таблиця 1 Амінокислотні субституції Оригінальний залишок Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Ілюстративні субституції Val, Leu, Ile Lys, Gln, Asn Gln Glu Ser, Ala Asn Asp Pro, Ala Asn, Gln, Lys, Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe Ile, Val, Met, Ala, Phe Arg, Gln, Asn Leu, Phe, Ile Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Ala Thr, Ala, Cys Ser Tyr, Phe Trp, Phe, Thr, Ser Ile, Met, Leu, Phe, Ala 25 30 2.A.FGF21 мутантні поліпептиди, що включають протеолізрезистентну мутацію Було встановлено, що зріла форма FGF21 (тобто форма з 181 залишком) перетерплює in vivo деградацію, що, як було визначено, обумовлено протеолітичним впливом. Було винайдено, що in vivo деградація зрілого FGF21 приводить до більш короткого періоду ефективного напіврозпаду, що може негативним чином впливати на терапевтичний потенціал даної молекули. Відповідно, було проведено спрямоване дослідження для ідентифікації FGF21 мутантів, які проявляють резистентність до протеолізу. У результаті цього дослідження сайти в зрілому FGF21 поліпептиді, які, як було знайдено, особливо схильні до протеолізу, включають пептидний зв'язок між амінокислотними залишками в положеннях 4-5, 20-21, 151-152, і 171-172. 8 UA 105016 C2 5 Необмежуючий перелік ілюстративних субституцій, які усувають протеолітичний ефект, що спостерігався в зрілому FGF21, і не роблять значного впливу на біологічну активність даного протеїну, які можуть бути використані в цьому винаході, наведений у Таблиці 2. Таблиця 2 носить лише ілюстративний характер, і в цьому винаході можуть бути ідентифіковані й застосовані інші протеоліз-резистентні субституції. Ці протеоліз-резистентні субституції можуть бути зроблені на додаток до субституцій, які вводять один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів, генеруючи тим самим FGF21 мутантний поліпептид, що проявляє необхідні властивості, які вносяться кожним типом мутації. Таблиця 2 Репрезентативні субституції, які забезпечують резистентність до протеолізу Амінокислотне положення 19 20 21 22 150 151 152 170 Природний залишок Arg Tyr Leu Tyr Pro Gly Ile Gly 171 Pro 172 173 Ser Gln Мутації Gln, Ile, Lys His, Leu, Phe Ile, Phe, Tyr, Val Ile, Phe, Val Ala, Arg Ala, Val His, Leu, Phe, Val Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Pro, Ser Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr Leu, Thr Arg, Glu 10 15 20 25 30 35 40 Переважно, але необов'язково, коли FGF21 мутантні поліпептиди, що включають протеолізрезистентну мутацію, мають біологічну активність, істотно таку ж, або більше високу, чим активність FGF21 дикого типу. Тому інший варіант цього винаходу спрямований на FGF21 мутантні поліпептиди, які включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів і резистентні до протеолізу, і усе ще зберігають біологічну активність, що відповідає біологічній активності або більше, ніж така в FGF21 дикого типу. Хоча це менш бажано в деяких випадках, FGF21 мутанти, які включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів і резистентні до протеолізу, але проявляють трохи знижену біологічну активність, становлять ще один варіант цього винаходу. У деяких випадках може бути бажаним зберігати деякий ступінь протеолізу, і як наслідок, FGF21 мутанти, що включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів, і які резистентні до протеолізу, але все-таки дозволяють здійснювати деякий ступінь протеолізу, також становлять ще один варіант цього винаходу. Як і всі FGF21 мутантні поліпептиди цього винаходу, протеоліз-резистентні FGF21 мутантні поліпептиди, що включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів, можуть бути отримані як тут описано. Звичайні фахівці в даній галузі, наприклад, знайомі зі стандартними способами молекулярної біології, можуть застосувати ці знання, разом із цією заявкою, для одержання й використання протеоліз-резистентних FGF21 мутантів, що включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів цього винаходу. Стандартні способи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, олігонуклеотидного синтезу, культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Див., наприклад, роботу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на яку в даній заявці зроблене посилання. Ферментативні реакції й способи очищення можуть бути реалізовані у відповідності зі специфікаціями виробника, як звичайно робиться в даній галузі, або як описано в даній заявці. Якщо не зроблені спеціальні застереження, номенклатура, використана у зв'язку з лабораторними процедурами й способами аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, і медичної й фармацевтичної хімії, описаними тут, добре відома й звичайно застосовується в даній галузі. Стандартні способи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичних препаратів і їхнього складання, і доставки; і лікування пацієнтів. Протеоліз-Резистентні FGF21 мутанти, що включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів, які резистентні до протеолізу, можуть бути хімічно модифіковані з використанням способів, відомих у даній галузі й описаних тут. Хімічне модифікування (наприклад, ПЕГілювання) протеоліз-резистентного FGF21 мутантного поліпептиду, що включає 9 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один або кілька сайтів приєднання неприродного полімеру, може згенерувати молекули, які проявляють як резистентність до протеолізу так і необхідні фармакокінетичні й фармакодинамічні властивості. 2.B.FGF21 мутантні поліпептиди, що включають сайт приєднання неприродного полімеру У різних аспектах цього винаходу розкриті FGF21 мутантні поліпептиди. В іншому аспекті, FGF21 мутантні поліпептиди цього винаходу включають FGF21 поліпептиди, у які введений сайт(и) приєднання неприродного полімеру (наприклад, ПЕГілювання). У ще одному аспекті цього винаходу розкриті усічені форми FGF21 мутантних поліпептидів, у які введено сайт(и) приєднання неприродного полімеру (наприклад, ПЕГ). FGF21 мутантні поліпептиди, що включають сайт приєднання неприродного полімеру й одну або кілька консервативних або неконсервативних субституцій, які необов'язково можуть підтримувати біологічну активність FGF21 дикого типу, становлять ще один аспект даного винаходу. Різні FGF21 поліпептидні мутанти цього винаходу можуть бути приготовлені як описане тут і як описано в роботах, на яких у цій заявці зроблені посилання. В одному варіанті FGF21 поліпептидні мутанти цього винаходу модифіковані шляхом введення сайту приєднання неприродного полімеру. Дійсно, в одному аспекті це є метою FGF21 мутантів цього винаходу, а саме, введення одного або декількох сайтів приєднання неприродних полімерів, таке, що полімери з розширеним періодом напіврозпаду можуть бути приєднані до FGF21 поліпептидного мутанта в необхідних положеннях. Обраний полімер є, звичайно, але не обов'язково, водорозчинним, так що протеїн, до якого він приєднаний, не осаджується у водному середовищі, такий як фізіологічне середовище. В обсяг принадних полімерів включена суміш полімерів. Краще, коли для терапевтичного використання кінцевого препарату даний полімер є фармацевтично прийнятним, таким як ПЕГ прийнятної молекулярної ваги. Полімери, які не є водорозчинними, такі як блоксополімери ПЕГ і жирної кислоти, також можуть бути конъюговані з FGF21 поліпептидними мутантами цього винаходу й становлять окремий аспект даного винаходу. Активність FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу може бути проаналізована різноманітними способами, наприклад, з використанням in vitro ELK-Люциферазного аналізу, як описано в Прикладі 10. Активність FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу може також бути оцінена in vivo пробі, такій як на ob/ob мишах, як показано в Прикладі 12. Загалом, оцінити in vivo активність одного або декількох із цих поліпептидів можна, увівши інтраперитонеально даний поліпептид тестовій тварині. Через деякий бажаний період часу або кілька таких періодів може бути взята проба крові, і можуть бути обмірювані рівні глюкози в крові. Як і для всіх FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу, ці поліпептиди можуть, при необхідності, включати аміно-кінцевий метіоніновий залишок, що може бути введений шляхом спрямованої мутації або як результат бактеріального експресованого процесу. FGF21 мутантні поліпептиди цього винаходу можуть бути отримані, як описано в Прикладі 7. Звичайні фахівці в даній галузі, наприклад, знайомі зі стандартними способами молекулярної біології, можуть застосувати ці знання, разом зі цією заявкою, для одержання й використання FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу. Стандартні способи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, олігонуклеотидного синтезу, культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорация, ліпофекція). Див., наприклад, роботу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на яку в даній заявці зроблене посилання. Ферментативні реакції й способи очищення можуть бути реалізовані у відповідності зі специфікаціями виробника, як звичайно здійснюється в даній галузі, або як описано в даній заявці. Якщо не зроблені спеціальні застереження, номенклатура, використана у зв'язку з лабораторними процедурами й способами аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, і медичної й фармацевтичної хімії, описаними тут, добре відома й звичайно застосовується в даній галузі. Стандартні способи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичних препаратів і їхнього складання, і доставки; і лікування пацієнтів. Після одержання FGF21 мутантного поліпептиду він може бути хімічно модифікований шляхом приєднання полімеру, як описано в Прикладі 9 даної заявки. 3.Усічені FGF21 мутантні поліпептиди, що включають сайт приєднання неприродного полімеру Один варіант цього винаходу спрямований на усічені форми мутантного FGF21 поліпептиду, що включає один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів. Такі усічені мутантні поліпептиди можуть, але не обов'язково, бути хімічно модифікованими. Використовуваний тут термін "усічений FGF21 мутантний поліпептид" стосується FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду, у якому 10 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один або кілька амінокислотних залишків вилучені з аміно-(кінцевого) термінального (або Nтермінального) кінця даного FGF21 поліпептиду, один або кілька амінокислотних залишків вилучені з карбоксил-термінального (або C-термінального) кінця даного FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 поліпептиду, або один або кілька амінокислотних залишків вилучені з як N-термінального так і C-термінального кінців FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 поліпептиду. Активність N-термінально усіченого мутанта FGF21, C-термінально усіченого мутанта FGF21 і молекул мутанта FGF21, усіченого як по N- так і по C-термінальних кінцях даної молекули, також як і хімічно модифікованих форм цих мутантів, може бути проаналізована різноманітними способами, наприклад, з використанням in vitro ELK-Люциферазної проби, описаної тут у Прикладі 10. Активність усічених мутантних FGF21 поліпептидів і хімічно модифікованих усічених мутантних FGF21 поліпептидів цього винаходу може бути також оцінена за допомогою in vivo проби, такою як на ob/ob мишах, як показано в Прикладі 12. Загалом, оцінити in vivo активність одного або декількох із цих поліпептидів можна, увівши інтраперитонеально даний поліпептид тестовій тварині. Через деякий бажаний період часу або кілька таких періодів може бути взята проба крові, і можуть бути обмірювані рівні глюкози в крові. Як і для всіх FGF21 мутантів цього винаходу, усічені мутантні FGF21 і хімічно модифікровані усічені мутантні FGF21 поліпептиди можуть, за необхідності, включати аміно-кінцевий метіоніновий залишок, що може бути введений шляхом спрямованої мутації або як результат бактеріального експресійного процесу. Усічені мутантні FGF21 поліпептиди цього винаходу можуть бути отримані, як описано в Прикладі 7. Звичайні фахівці в даній галузі, наприклад, знайомі зі стандартними способами молекулярної біології, можуть застосувати ці знання, разом зі цією заявкою, для одержання й використання усічених мутантних FGF21 поліпептидів цього винаходу. Стандартні способи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, олігонуклеотидного синтезу, культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Див., наприклад, роботу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на яку в даній заявці зроблене посилання. Ферментативні реакції й способи очищення можуть бути реалізовані у відповідності зі специфікаціями виробника, як звичайно здійснюється в даній галузі, або як описано в даній заявці. Якщо не зроблені спеціальні застереження, номенклатура, використана у зв'язку з лабораторними процедурами й способами аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, і медичної й фармацевтичної хімії, описаними тут, добре відома й звичайно застосовується в даній галузі. Стандартні способи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичних препаратів і їхнього складання, і доставки; і лікування пацієнтів. Після одержання усіченого мутантного FGF21 поліпептиду він може бути хімічно модифікований шляхом приєднання полімеру, як описано в Прикладі 9 даної заявки. 4.Кепійовані й C-кінцеві FGF21 мутантні поліпептиди В іншому варіанті, цей винахід спрямований на мутантні FGF21 поліпептиди, що включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів, які були кепійовані шляхом додавання іншого одного або декількох залишків до C-кінця даного поліпептиду, розширюючи дану амінокислотну послідовність за межі протеїну дикого типу. У ще одному варіанті, цей винахід спрямований на FGF21 мутантні поліпептиди, що включають один або кілька сайтів приєднання неприродних полімерів, які додатково включають одну або більше C-кінцевих мутацій. Такі кепійовані й C-термінально мутовані FGF21 мутантні поліпептиди можуть необов'язково бути хімічно модифіковані. Використовуваний тут термін "кепійований FGF21 мутантний поліпептид" стосується FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду, у якому один або кілька амінокислотних залишків були додані до C-Кінця FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду. Будь-яка природна або неприродна амінокислота може бути використана для кепіювання FGF21 мутантного поліпептиду, включаючи один або декілька пролінових залишків і один або декілька гліцинових залишків. Хоча послідовність FGF21 дикого типу має довжину лише в 181 залишок, кепійований FGF21 мутантний поліпептид збільшує довжину даного поліпептиду на один залишок для кожного доданого залишку, що кепіюється; у відповідності зі схемою нумерації цієї заявки залишки, що копіюються, нумеруються, починаючи з 182. Так, один проліновий залишок, що копіюються, позначається як P182. Можливі більш довгі "шапочки" і вони нумеруються відповідно (наприклад, X182, Y183, Z184, де X, Y і Z відповідають будь-якій природній або неприродній амінокислоті). Залишки, що копіюються, можуть бути додані до мутантного FGF21 поліпептиду з використанням будь-якого зручного способу, такого як хімічний, у якому ковалентне приєднання 11 UA 105016 C2 5 10 15 амінокислоти до C-кінця даного поліпептиду здійснюється за допомогою хімічної реакції. Як альтернатива, кодон, що кодує залишок, що копіюються, може бути доданий до послідовності, що кодує, FGF21 мутантного поліпептиду з використанням стандартних способів молекулярної біології. Кожний з описаних тут мутантних FGF21 поліпептидів може бути, за необхідності, кепійований одним або декількома залишками. C-кінцеві мутації становлять ще один аспект цього винаходу. Використовуваний тут термін “ C-кінцева мутація" стосується однієї або декількох альтерацій в області залишків 91-181 (або далі, якщо даний поліпептид кепійований) мутантного FGF21 поліпептиду. C-кінцева мутація, введена в FGF21 мутантну поліпептидну послідовність, буде служити доповненням до однієї або декількох мутацій, які вводять сайт приєднання неприродного полімеру. Хоча C-кінцеві мутації можуть бути введені в будь-яку крапку в області 91-181 FGF21 мутантної поліпептидної послідовності, ілюстративні положення для C-Кінцевих мутацій включають положення 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180 і 181. C-кінцеві мутації можуть бути введені з використанням стандартних способів молекулярної біології, таких як описані в даній заявці. Кожний з описаних тут мутантних FGF21 поліпептидів може включати C-кінцеву мутацію. Приклади положень і ідентичностей для кепійованих і/або C-кінцевих мутацій наведені в Таблиці 3: Таблиця 3 Приклади положень для кепіювання й/або C-кінцевих мутацій E37C, R77C, P171G, P182 P171G, S181P, P182 P171G, S181P P171G, S181T P171G, S181G P171G, S181A P171G, S181L P171G, A180P P171G, A180G P171G, A180S P171G, Y179P P171G, Y179G P171G, Y179S P171G, Y179A P171G, L182 P171G, G182 P171G, P182 P171G, G182, G183 P171G, G182, G183, G184, G185, G186 20 25 30 35 Активність кепійованих і/або C-термінально мутованих FGF21 мутантних поліпептидів, також як і хімічно модифікованих форм цих мутантів може бути проаналізована різноманітними способами, наприклад, з використанням in vitro ELK-Люциферазної проби, як описано в Прикладі 10 даної заявки. Активність кепійованих і/або C-термінально мутованих FGF21 мутантних поліпептидів, і хімічно модифікованих кепійованих і/або C-термінально мутованих FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу може бути також оцінена in vivo пробі, такій як на ob/ob мишах, як показано в Прикладі 12. Загалом, оцінити in vivo активність одного або декількох із цих поліпептидів можна, увівши інтраперитонеально даний поліпептид тестовій тварині. Через деякий бажаний період часу або кілька таких періодів може бути взята проба крові, і можуть бути обмірювані рівні глюкози в крові. Як і для всіх FGF21 мутантів цього винаходу, кепійовані й/або С-термінально мутовані FGF21 мутантні поліпептиди, і хімічно модифіковані кепійовані й/або С-термінально мутовані FGF21 мутантні поліпептиди можуть, за необхідності, включати аміно-кінцевий метіоніновий залишок, що може бути введений шляхом спрямованої мутації або як результат бактеріального експресійного процесу. Кепійовані й/або C-термінально мутовані FGF21 мутантні поліпептиди цього винаходу можуть бути отримані, як описано в Прикладі 7. Звичайні фахівці в даній галузі, наприклад, 12 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 знайомі зі стандартними способами молекулярної біології, можуть застосувати ці знання, разом із цією заявкою, для одержання й використання кепійованих і/або С-термінально мутованих FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу. Стандартні способи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, олігонуклеотидного синтезу, культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Див., наприклад, роботу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на яку в даній заявці зроблене посилання. Ферментативні реакції й способи очищення можуть бути реалізовані у відповідності зі специфікаціями виробника, як звичайно здійснюється в даній галузі, або як описано в даній заявці. Якщо не зроблені спеціальні застереження, номенклатура, використана у зв'язку з лабораторними процедурами й способами аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, і медичної й фармацевтичної хімії, описаними тут, добре відома й звичайно застосовується в даній галузі. Стандартні способи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичних препаратів і їхнього складання, і доставки; і лікування пацієнтів. Після одержання кепійованого й/або С-термінально мутованого FGF21 мутантного поліпептиду він може бути хімічно модифікований шляхом приєднання полімеру, як це описано в даній заявці в Прикладі 9. 5.FGF21 мутантні поліпептиди, що містять неприродні цистеїнові залишки У ще одному аспекті цього винаходу можуть бути отримані FGF21 мутантні поліпептиди, у яких обоє цистеїнових залишка в поліпептидній послідовності FGF21 дикого типу замінені залишками, які не утворюють дісульфидних зв'язків і не служать сайтами приєднання полімеру, такими як аланін або серин. Потім можуть бути зроблені субституції в FGF21 мутантної поліпептидної послідовності, які вводять сайти приєднання неприродних полімерів, у формі тіолвтримуючих залишків (наприклад, цистеїнових залишків або неприродних амінокислот, що мають тіолові групи) або вільних аміногруп (наприклад, лізинових або аргінінових залишків, або неприродних аміногруп, що мають вільні аміногрупи). Полімери, у яких для приєднання використовуються тіолові групи або вільні аміногрупи, такі як ПЕГ, потім можуть бути націлені на цистеїновий, лізиновий або аргініновий залишки, які були введені в FGF21 мутантну поліпептидну послідовність у відомих положеннях. Ця стратегія може полегшити більш ефективне й контрольоване розміщення полімеру. В одному підході два природних цистеїнових залишка в поліпептиді FGF21 дикого типу, які розташовані в положеннях 75 і 93, можуть бути заміщені залишками, що не містять тіол. Потім цистеїновий залишок може бути введений у відоме місце розташування. FGF21 мутантний поліпептид може також включати інші мутації, які можуть вводити ще більше сайтів приєднання полімерів (наприклад, цистеїнові залишки) або можуть бути сконструйовані для одержання деякої іншої необхідної властивості. Приклади таких FGF21 мутантних поліпептидів включають C75A/E91C/C93A/H125C/P171G і C75S/E91C/C93S/H125C/P171G. У цих прикладах природні цистеїни в положеннях 75 і 93 були мутовані в аланіновий або сериновий залишки, сайти приєднання полімеру були введені в положення 91 і 125 (у цьому випадку для тіол-реакційного полімеру, такого як ПЕГ), і додаткова мутація була зроблена в положенні 171, тобто субституція проліна 171 гліциновим залишком. Подібно всім FGF21 мутантним поліпептидам, які тут розкриті, активність FGF21 мутантних поліпептидів, які не містять цистеїнів, що перебувають у поліпептидній послідовності FGF21 дикого типу, але замість цього включають сайт приєднання полімеру й, за необхідності, одну або кілька додаткових мутацій, також як хімічно модифіковані форми цих мутантів, може бути проаналізована різноманітними способами, наприклад, з використанням in vitro ELKЛюциферазної проби, як описано в Прикладі 10. In vivo активність цих поліпептидів може бути оцінена in vivo пробі, такій як на ob/ob мишах, як показано в Прикладі 12 і описаній тут. Як і для всіх FGF21 мутантів цього винаходу, активність FGF21 мутантних поліпептидів, які не містять цистеїнів, що перебувають у поліпептидній послідовності FGF21 дикого типу, але замість цього включають сайт приєднання полімеру й, за необхідності, одну або кілька додаткових мутацій, також як хімічно модифіковані форми цих FGF21 мутантних поліпептидів, може, за необхідності, включати аміно-кінцевий метіоніновий залишок, що може бути введений шляхом спрямованої мутації або як результат бактеріального експресованого процесу. FGF21 мутантні поліпептиди, які не містять цистеїнів, що перебувають у поліпептидній послідовності FGF21 дикого типу, але замість цього включають введений сайт приєднання полімеру й, за необхідності, одну або кілька додаткових мутацій, можуть бути отримані як описано тут, наприклад, у Прикладі 7. Звичайні фахівці в даній галузі, наприклад, знайомі зі стандартними способами молекулярної біології, можуть застосувати ці знання, разом з цією заявкою, для одержання й використання цих FGF21 мутантних поліпептидів. Стандартні способи можуть бути використані для рекомбінантної ДНК, олігонуклеотидного синтезу, 13 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Див., наприклад, роботу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на яку в даній заявці зроблене посилання. Ферментативні реакції й способи очищення можуть бути реалізовані у відповідності зі специфікаціями виробника, як звичайно здійснюється в даній галузі, або як описано в даній заявці. Якщо не зроблені спеціальні застереження, номенклатура, використана у зв'язку з лабораторними процедурами й способами аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, і медичної й фармацевтичної хімії, описаними тут, добре відома й звичайно застосовується в даній галузі. Стандартні способи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичних препаратів і їхнього складання, і доставки; і лікування пацієнтів. Після одержання FGF21 мутантних поліпептидів, які не містять цистеїнів, що перебувають у поліпептидній послідовності FGF21 дикого типу, але замість цього включають введений сайт приєднання полімеру й, при необхідності, одну або кілька додаткових мутацій, вони можуть бути хімічно модифіковані шляхом приєднання полімеру, як описано в Прикладі 9 даної заявки. 6."Зв'язані молекули" У ще одному аспекті цього винаходу "Зв'язана молекула" може бути отримана, як тут описано. "Зв'язана молекула" являє собою молекулу, що включає два FGF21 поліпептиди, зв'язаних лінкерною молекулою. Шляхом з'єднання двох FGF21 поліпептидів ефективний період напіврозпаду й активність "Зв'язаної молекули" можуть бути розширені за рамки періоду напіврозпаду й активності окремого FGF21 поліпептиду. "Зв'язана молекула" цього винаходу включає лінкер і два FGF21 поліпептиди, які можуть являти собою два природних FGF21 поліпептиди, у які мутації не вводилися, два FGF21 мутантних поліпептиди, що мають сайт приєднання лінкера, введений в FGF21 поліпептиди, або комбінація одного природного FGF21 поліпептиду й одного FGF21 мутантного поліпептиду. Передбачені також "Зв'язані молекули" що включають, щонайменше, один FGF21 поліпептид, що має сайт приєднання неприродного лінкера й одну або кілька додаткових мутацій, що становить ще один аспект даного винаходу. Таким чином, такі "Зв'язані молекули" можуть включати мутацію, що утворює сайт для приєднання молекули лінкера, також як і ще одну мутацію для додання ще однієї бажаної властивості зазначеній "Зв'язаній молекулі". Використовуваний тут термін "сайт приєднання лінкера" означає природну або неприродну амінокислоту, що має функціональну групу, з якою може бути асоційований лінкер. В одному прикладі сайт приєднання лінкера являє собою залишок, що містить тіолову групу, що може бути асоційована з молекулою ПЕГ. 6.A.FGF21 поліпептиди в "Зв'язаній молекулі” Коли "Зв'язана молекула" включає два FGF21 мутантних поліпептиди, дані FGF21 мутантні поліпептиди можуть включати один або декілька мутантів, введених у цю послідовність, але немає необхідності в тому, щоб ці мутації перебували в тому же самому амінокислотному положенні в кожному з FGF21 мутантних поліпептидів. Наприклад, якщо "Зв'язана молекула" включає два FGF21 мутантних поліпептиди, один FGF21 мутантний поліпептид може містити H125C мутацію, що може утворювати крапку приєднання для молекули лінкера. Навпроти, інший FGF21 мутантний поліпептид може містити мутацію в положенні, відмінному від H125, що може служити крапкою приєднання для лінкера, що зв'язує разом дані два FGF21 мутантних поліпептиди. Навіть якщо використовуються один або два FGF21 мутантних поліпептиди, лінкер може бути приєднаний до N-термінального кінця FGF21 мутантного поліпептиду; необов'язково, щоб використовувалися введені крапки приєднання. Коли "Зв'язана молекула" включає один або два природних FGF21 поліпептиди, лінкер може бути приєднаний у крапці FGF21 поліпептиду, що відповідає хімії приєднання. Наприклад, природні дисульфидні зв'язки можуть бути відновлені, і цистеїнові залишки можуть служити крапками приєднання для лінкера, такого як ПЕГ. В іншому варіанті, лінкер може бути приєднаний до FGF21 поліпептиду в N-Кінці або на лізинових бічних ланцюгах. Один або обоє FGF21 мутантних поліпептиду "Зв'язаної молекули" можуть включати усічений FGF21 мутантний поліпептид. Як описано тут, усічений FGF21 мутантний поліпептид може бути отриманий шляхом видалення будь-якої кількості залишків як на N-Кінці, C-кінці, так і на обох N- і C-Кінцях. "Зв'язані молекули" можуть також включати один або обоє FGF21 поліпептиду, які містять мутацію в поліпептидній послідовності, що може й не бути кращої як сайт приєднання лінкера, але замість цього може надавати деяка інша бажана властивість даній "Зв'язаній молекулі". Таким чином, "Зв'язані молекули", що включають один або трохи FGF21 мутантних поліпептидів з мутацією, що надає необхідну властивість "Зв'язаній молекулі", становлять ще один аспект цього винаходу. 14 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Активність "Зв'язаних молекул" може бути проаналізована різними способами, наприклад, з використанням in vitro ELK-Люциферазної проби, як описано тут у Прикладі 10. Активність "Зв'язаних молекул" цього винаходу може бути також оцінена in vivo пробі, такій як на ob/ob мишах, як показано в Прикладі 12. Загалом, оцінити in vivo активність одного або декількох із цих поліпептидів можна, увівши інтраперитонеально даний поліпептид тестовій тварині. Через деякий бажаний період часу або кілька таких періодів може бути взята проба крові, і можуть бути обмірювані рівні глюкози в крові. Як і для всіх FGF21 мутантів цього винаходу, FGF21 поліпептиди, що включають "Зв'язану молекулу", які можуть бути FGF21 мутантними поліпептидами, FGF21 поліпептидами дикого типу або комбінацією того й іншого, можуть, за необхідності, включати аміно-кінцевий метіоніновий залишок, що може бути введений шляхом спрямованої мутації або як результат бактеріального експресійного процесу. Звичайні фахівці в даній галузі, наприклад, знайомі зі стандартними способами молекулярної біології, можуть застосувати ці знання, разом з цією заявкою, для одержання й використання "Зв'язаних молекул" цього винаходу. Стандартні способи можуть бути використані для рекомбінантноїй ДНК, олігонуклеотидного синтезу, культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція). Див., наприклад, роботу Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, на яку в даній заявці зроблене посилання. Ферментативні реакції й способи очищення можуть бути реалізовані у відповідності зі специфікаціями виробника, як звичайно здійснюється в даній галузі, або як описано в даній заявці. Процеси для зв'язування лінкерів з FGF21 поліпептидами будуть залежати від природи даного лінкера, але вони відомі фахівцям у даній галузі. Приклади хімії приєднання лінкерів описані в даній заявці. Інструкція щодо одержання "Зв'язаної молекули" цього винаходу наведено в даній заявці, наприклад, у Прикладі 9. Якщо не зроблені спеціальні застереження, номенклатура, використана у зв'язку з лабораторними процедурами й способами аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, і медичної й фармацевтичної хімії, описаними тут, добре відома й звичайно застосовується в даній галузі. Стандартні способи можуть бути використані для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичних препаратів і їхнього складання, і доставки; і лікування пацієнтів. 6.B.Лінкери в "Зв'язаних молекулах” Будь-який лінкер може бути використаний в "Зв'язаній молекулі" для зв'язування разом двох FGF21 мутантних поліпептидів. Молекули лінкера можуть бути розгалуженими або нерозгалуженими й можуть бути приєднані до FGF21 мутантного поліпептиду з використанням різних відомих хімічних способів, таких як описані тут. Хімічна структура лінкера не є критичною, оскільки він служить, головним чином, спейсером. Даний лінкер може бути, незалежно, таким же самим або відмінним від будь-якого іншого лінкера або лінкерів, які можуть бути присутніми в "Зв'язаній молекулі" (наприклад, "Зв'язана молекула", що включає три або більше FGF21 мутанти поліпептидів дикого типу). В одному варіанті лінкер може складатися з амінокислот, зчеплених між собою пептидними зв'язками. Деякі із цих амінокислот можуть бути гликозильованими, як це добре відомо фахівцям у даній галузі. Наприклад, корисною лінкерною послідовністю, що становить сайт сиалірування, є X 1 × 2NX4 × 5G (SEQ ID NO: 5), де X1, X2, X4 і X5 являють собою, незалежно, будь-який амінокислотний залишок. В іншому варіанті молекула лінкера може бути молекулою ПЕГ будь-якого розміру, такого як 20 кДа, 30 кДа або 40 кДа. У варіантах, у яких є присутнім пептиділовий лінкер (тобто утворений з амінокислот, зв'язаних пептидними зв'язками), його довжина становить, переважно, від 1 до приблизно 40 амінокислотних залишків, краще, від 1 до приблизно 20 амінокислотних залишків, і найкраще, від 1 до приблизно 10 амінокислотних осадів. В одному варіанті амінокислотні залишки в лінкері вибираються з кожної із двадцяти канонічних амінокислот. В іншому варіанті амінокислотні залишки в лінкері вибираються із цистеїну, гліцину, аланіну, проліну, аспарагіну, глутаміну, і/або серину. У ще одному варіанті пептиділовий лінкер сформований з більшості амінокислот, які є стерично необмеженими, таких як гліцин, серин і аланін, зчеплені пептидним зв'язком. Часто буває необхідним, щоб пептидиловий лінкер, якщо він присутній, вибирався б таким чином, щоб уникнути швидкого протеолітичного оберту при циркуляції in vivo. Так, кращі пептиділові лінкери включають полігліцини, зокрема, (Gly)4 (SEQ ID NO: 6); (Gly)5 (SEQ ID NO: 7); полі(Gly-Ala); і поліаланіни. Інші кращі пептиділові лінкери включають GGGGS (SEQ ID NO: 8); GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 10) і будь-які лінкери, використані в представлені тут Прикладах. Однак, описані тут лінкери є ілюстративними; лінкери, які входять в обсяг даного винаходу можуть бути набагато довші й можуть включати інші залишки. 15 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У варіантах "Зв'язаної молекули", що включають пептидну лінкерну складову, кислотні залишки, наприклад, глутаміновий або аспартатовий залишки, поміщені в амінокислотну послідовність лінкерної складової. Приклади включають наступні пептидні лінкерні послідовності: GGEGGG (SEQ ID NO: 11); GGEEEGGG (SEQ ID NO: 12); GEEEG (SEQ ID NO: 13); GEEE (SEQ ID NO: 14); GGDGGG (SEQ ID NO: 15); GGDDDGG (SEQ ID NO: 16); GDDDG (SEQ ID NO: 17); GDDD (SEQ ID NO: 18); GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS (SEQ ID NO: 19); WEWEW (SEQ ID NO: 20); FEFEF (SEQ ID NO: 21); EEEWWW (SEQ ID NO: 22); EEEFFF (SEQ ID NO: 23); WWEEEWW (SEQ ID NO: 24); або FFEEEFF (SEQ ID NO: 25). В інших варіантах пептидний лінкер утворює сайт фосфорилювання, наприклад, X1X2YX3X4G (SEQ ID NO: 26), де X1, X2,X3 і X4 являють собою, кожний, незалежно, будь-який амінокислотний залишок; X1X2SX3X4G (SEQ ID NO: 27), де X1, X2,X3 і X4 являють собою, кожний, незалежно, будь-який амінокислотний залишок; або X1 × 2TX3 × 4G (SEQ ID NO: 28), де X1, X2,X3 і X4 являють собою, кожний, незалежно, будь-який амінокислотний залишок. В "Зв'язаній молекулі" можуть також використовуватися непептидні лінкери. Наприклад, алкільні лінкери, такі як -NH-(CH2)s-C(O)-, де може використовуватися s=2 - 20. Ці алкильні лінкери можуть бути додатково заміщені будь-якою просторово необмежуючою групою, такою як нижчий алкіл (наприклад, C1-C6), нижчий ацил, галоген (наприклад, Cl, Br), CN, NH2, феніл, і т.д. Будь-який прийнятний лінкер може бути застосований у цьому винаході для формування "Зв'язаних молекул". В одному прикладі лінкер, використаний для формування "Зв'язаних молекул", описаних тут, представляє гомобіфункціональні біс-малеїнімідні ПЕГ молекули загальної структури: X-(CH2CH2O)nCH2CH2-X де X являє собою групу іміду малеїнової кислоти. В інших варіантах X може являти собою ортопіридил-дисульфід, йодоацетамід, вінілсульфон або будь-яку іншу реакційну складову, що, як відомо в даній галузі, специфічна для тіолових груп. У ще одному варіанті X може являти собою аміноспеціфичну реакційну складову, використовувану для зв'язування двох мутантних поліпептидів через N-кінець або створену способами генної інженерії лізильну групу. (Див., наприклад, Pasut and Veronese, 2006, "PEGylation of Proteinsas Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates, ” Adv. Polym. Sci. 192:95-134). У ще одному варіанті, лінкер може мати загальну структуру: X-(CH2CH2O)nCH2CH2-Y де X і Y являють собою різні реакційні складові, обрані з вищевказаних груп. Такий лінкер забезпечить кон'югацію різних мутантних поліпептидів з генерацією зв'язаних гетеро-димерів або гетеро-олігомерів. У ще одному варіанті, лінкер може являти собою ПЕГ молекулу, що може мати молекулярну вагу від 1 до 100 кДа, переважно, від 10 до 50 кДа (наприклад, 10, 20, 30 або 40 кДа) і ще більш переважно, 20 кДа. Пептидні лінкери можуть бути змінені з утворенням похідних тим же способом, що описано вище. Інші приклади корисних лінкерів включають аміноетилоксіетилоксі-ацетильні лінкери, як описано в міжнародній публікації № WO 2006/042151, на яку в даній заявці зроблене повне посилання. При формуванні "Зв'язаної молекули" цього винаходу можуть бути застосовані стандартні хімічні способи для зв'язування лінкера з FGF21 молекулою дикого типу або мутантною молекулою. Конкретний спосіб зв'язування буде залежати від сайту приєднання (наприклад, амінокислотних бічних ланцюгів) і природи даного лінкера. Коли лінкер є ПЕГ молекулою, приєднання може бути досягнуте шляхом застосування стандартних хімічних способів і вільної сульфгідрильної або аміногрупи, такої як знайдені на цистеїнових залишках (які можуть бути введені в FGF21 поліпептидну послідовність за допомогою мутації або можуть бути 16 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природними) або на лізиновій групі (яка може бути введена в FGF21 поліпептидну послідовність за допомогою мутації або може бути природною), або N-кінцевій аміногрупі. 7.Хімічна модифікація FGF21 мутантів В одному з аспектів цього винаходу FGF21 мутантні поліпептиди є хімічно модифікованими. Термін "хімічно модифікований" стосується поліпептиду (наприклад, FGF21 мутантний поліпептид), що був модифікований шляхом додавання полімеру в один або кілька сайтів на цьому поліпептиді. Приклади хімічно модифікованих форм FGF21 мутантного поліпептиду включають ПЕГільовані й глікозильовані форми FGF21 мутантного поліпептиду. Хімічно модифіковані FGF21 мутантні поліпептиди цього винаходу можуть містити будь-який тип полімеру, включаючи водорозчинні полімери, такі як ПЕГ. Кожний з ілюстративних полімерів може бути полімером будь-якої молекулярної ваги й може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кожний тип полімеру має звичайно середню молекулярну вагу приблизно від 2 кДа до 100 кДа (термін "приблизно" указує, що в препаратах водорозчинного полімеру деякі молекули мають більша вага й деякі менша вага, чим зазначена молекулярна вага). Середня молекулярна вага кожного полімеру лежить, переважно, в області приблизно від 5 кДа до 50 кДа, більш переважно, приблизно від 10 кДа до 40 кДа, і найбільше переважно, приблизно від 10 кДа до приблизно 20 кДа. Прийнятні водорозчинні полімери або їхні суміші включають, однак не обмежуючись цим, вуглеводи, поліетиленгліколь (ПЕГ) (включаючи форми ПЕГ, які були використані для дериватизації протеїнів, включаючи моно-(C1-C10), алкоксі-, або аоілоксі-поліетиленгліколь), монометоксі-поліетиленгліколь, декстран (такий як декстран низької молекулярної ваги, наприклад, близько 6 кДа), целюлозу, або інші полімери на основі вуглеводів, полі-(N-вініл піролідон) поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколя, сополімери пропілен оксид/етилен оксиду, поліоксіетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), і полівініловий спирт. Також охоплені цим винаходом біфункціональні структуровані молекули, які можуть використовуватися для одержання ковалентно приєднаних FGF21 поліпептидних мутантних мультимерів. Також охоплені цим винаходом FGF21 мутанти, ковалентно приєднані до полісіалової кислоти. У деяких варіантах цього винаходу FGF21 мутантний поліпептид ковалентно модифікований і містить один або кілька водорозчинних полімерів, включаючи, але не обмежуючись цим, поліетиленгліколь (ПЕГ), поліоксіетиленгліколь, або поліпропіленгліколь. Див., наприклад, патенти США №№ 4640835; 496689; 4301144; 4670417; 4791192; і 4179337. У деяких варіантах цього винаходу FGF21 мутант містить один або кілька полімерів, включаючи, але не обмежуючись цим, монометоксі-поліетиленгліколь, декстран, целюлозу, інший полімер на основі вуглеводу, полі-(N-вініл піролідон)-поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколя, сополімер поліпропілен оксид/етилен оксиду, поліоксіетильовані поліоли наприклад, гліцерин), полівініловий спирт, або суміші таких полімерів. У ще одних варіантах цього винаходу пептид або протеїн можуть бути кон'юговані з FGF21 сайт-спрямованим способом, через вищезгадані залишки, отримані способами генної інженерії, з метою додати прийнятні властивості FGF21 (наприклад, активність, стійкість, селективність). Таким чином, цей винахід охоплює FGF21 мутантні поліпептиди, кон'юговані з гетеропротеїном або гетеропептидом на введеному сайті приєднання полімеру. Приклади прийнятних протеїнів включають ЛСА (людський сироватковий альбумін) і антитіла, які не зв'язуються з FGF21. 7.A.ПЕГільовані FGF21 мутантні поліпептиди У деяких варіантах цього винаходу FGF21 мутантний поліпептид ковалентно-модифікований ПЕГ субодиницями. У деяких варіантах один або кілька водорозчинних полімерів приєднані в одному або декількох специфічних положеннях (наприклад, в N-Кінці) FGF21 мутанта. У деяких варіантах один або кілька водорозчинних полімерів приєднані до одного або декількох бічних ланцюгів FGF21 мутанта; ці бічні ланцюги можуть бути природними або можуть утворювати компонент сайту приєднання полімеру, сформованого способами генної інженерії. У деяких варіантах ПЕГ використаний для поліпшення терапевтичної активності FGF21 мутантного поліпептиду. Деякі такі способи обговорені, наприклад, у патенті США № 6133426, на який у даній заявці зроблене посилання. У варіантах цього винаходу, де даний полімер є ПЕГ, ПЕГ група може мати будь-яку зручну молекулярну вагу й може бути лінійною або розгалуженою. Середня молекулярна вага даної ПЕГ групи варіюється, переважно, приблизно від 2 кДа до 100 кДа, і більш переважно, приблизно від 5 кДа до 50 кДа, наприклад, 10, 20, 30, 40, або 50 кДа. ПЕГ групи звичайно приєднані до FGF21 мутанта за допомогою ацилювання або відбудовного алкілювання через реакційну групу на ПЕГ складової (наприклад, альдегід, NHS, або імід малеїнової кислоти, вінілсульфон, алкілгалогенід) до реакційної групи на FGF21 мутанті (наприклад, аміно або тіоловій групі). 17 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Коли полімер(и), приєднані до FGF21 мутантного поліпептиду, являють собою ПЕГ, ПЕГілювання FGF21 мутантного поліпептиду цього винаходу може бути проведено з використанням кожної з реакцій ПЕГілювання, відомих у даній галузі. Такі реакції описані, наприклад, у наступних роботах: Zalipsky, 1995, Functionalized Poly(ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates, Bioconjugate Chemistry 6:150-165; Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; Європейські патенти №№. 0 154 316 і 0 401 384; і у патенті США №. 4179337. Наприклад, коли залишок-мішень є лізиновим залишком (тобто залишком з реакційної аміногрупою), ПЕГілювання може бути проведено за допомогою реакції ацилювання або реакції алкілювання з аміно-реакційною молекулою поліетиленгліколя (або аналогічним реакційним водорозчинним полімером), як описано тут. Для реакцій ацилювання обраний полімер може мати одну реакційну ефірну групу. Для відновленого алкілювання обраний полімер може мати окрему реакційну альдегідну групу. Реакційним альдегідом є, наприклад, поліетиленгліколь пропіональдегід, що стійкий у воді, або його моно C 1-C10 алкоксі або арилоксі похідні (див. патент США №. 5252714). Різні реакційні ПЕГ полімери, активовані різнимиими аміно-специфічними складовими, також відомі звичайним фахівцям у даній галузі й можуть також бути застосовані як це диктують обставини. В іншому прикладі, коли залишком-мішенню є цистеїновий залишок (тобто залишок з реакційною сульфгідрильною групою), ПЕГілювання може бути здійснено за допомогою стандартної хімії іміда малеїнової кислоти. Для цієї реакції обраний полімер може містити одну або декілька реакційних малеїнімідних груп або іншу тіол-реакційну складову, таку як вінілсульфон, ортопіридил-дісульфід або йодоацетамід. Див., наприклад, роботи Pasut & Veronese, 2006, "PEGylation of Proteins as Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates, ” Adv. Polym. Sci. 192:95-134; Zalipsky, 1995, "Functionalized Poly(ethylene glycol) for Preparation of Biologically Relevant Conjugates, ” Bioconjugate Chemistry 6:150-165, і Hermanson, Bioconjugate nd Techniques, 2 Ed., Academic Press, 2008, на кожну з яких у даній заявці зроблене посилання. У деяких варіантах цього винаходу застосовна стратегія для приєднання ПЕГ групи до FGF21 мутанта включає об'єднання за допомогою утворення кон'югатного зв'язку в розчині FGF21 мутанта й ПЕГ складовій, кожний несе спеціальну функціональну групу, що реакційна стосовно іншої. FGF21 мутант є "попередньо активованим" відповідною функціональною групою на специфічному сайті. Попередники піддаються очищенню й повністю характеризуються перед реагуванням з ПЕГ складовою. Зшивання FGF21 мутанта й ПЕГ звичайно має місце у водній фазі й може легко контролюватися способом SDS-PAGE (див. вище) або аналітичною високоефективною рідинною хроматографією зі зворотною фазою. Докладний аналіз може бути проведений способом пептидного картування на основі рідинної хроматографії-масспектроскопії. 7.B.Полісахаридні FGF21 мутантні поліпептиди Полісахаридні полімери являють собою інший тип водорозчинного полімеру, що може бути використаний для модифікації протеїну. Таким чином, FGF21 мутантні поліпептиди цього винаходу можуть бути приєднані до полісахаридного полімеру, і це становить варіанти даного винаходу. Так, створений способами генної інженерії сайт приєднання неприродного полімеру в FGF21 мутантному поліпептиді може включати залишок, до якого приєднаний полісахарид. Декстрани являють собою полісахаридні полімери, що складаються з окремих субодиниць глюкози, які зв'язані, переважно, альфа 1-6 зв'язками. Сам декстран має різні молекулярні ваги в широкій області й легко доступний у вигляді речовини з молекулярною вагою приблизно від 1 кДа до 70 кДа. Декстран є Прийнятним водорозчинним полімером для використання як наповнювач як самого по собі або в комбінації з іншим наповнювачем (наприклад, Fc). Див., наприклад, міжнародну публікацію №. WO 96/11953. Повідомляється про використання декстрана, конъюгированного з терапевтичними або діагностичними імуноглобулінами. Див., наприклад, європейську патентну публікацію №. 0 315 456, на яку тут зроблене посилання. Даний винахід також охоплює використання декстрана з молекулярними вагами в області від приблизно 1 кДа до приблизно 20 кДа. 7.C.Способи хімічного модифікування FGF21 мутантного поліпептиду Загалом, хімічна модифікація (наприклад, ПЕГілювання або глікозилювання) може бути здійснена при будь-якій прийнятній умові, що використовується при реакції протеїну з активованою полімерною молекулою. Способи одержання хімічно модифікованих FGF21 мутантних поліпептидів звичайно включають стадії: (a) реакції даного поліпептиду з активованою полімерною молекулою (такий як реакційний ефір, імід малеїнової кислоти або альдегідна похідна даної полімерної молекули) при умовах, при яких FGF21 мутантний поліпептид стає приєднаним до однієї або декількох молекулам полімеру, і (б) одержання продуктів реакції. Оптимальні умови реакції будуть визначатися, виходячи з відомих параметрів 18 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і необхідного результату. Наприклад, чим більше відношення молекул полімеру до протеїну, тим більше відсоток приєднаних молекул полімеру. В одному варіанті цього винаходу хімічно модифіковані FGF21 мутантні поліпептиди можуть мати єдину полімерну молекулу в аміно-кінці, тоді як в інших варіантах FGF21 мутантний поліпептид може мати два або кілька полімерів, асоційованих з головною послідовністю, наприклад, один полімер в N-кінці даного поліпептиду й другий в іншому залишку поліпептиду. Як альтернатива, FGF21 мутант може мати два або більше полімери, асоційованих у двох різних залишках у головній послідовності, але не в Nкінці. Загалом, умови, які можуть бути зм'якшені або модульовані шляхом застосування хімічно модифікованих FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу, включають описані тут для природного FGF21 поліпептиду. Однак, хімічно модифіковані FGF21 мутантні поліпептиди, розкриті тут, можуть мати додаткові активності, такі як збільшений період напіврозпаду, у порівнянні з FGF21 дикого типу й FGF21 мутантами. 8.Терапевтичні композиції FGF21 мутантів їхнє використання Терапевтичні композиції,що включають FGF21 мутантні поліпептиди, підпадають під рамки цього винаходу й спеціально передбачені у світлі ідентифікації "Зв'язаних молекул", FGF21 мутантних поліпептидів і хімічно модифікованих FGF21 мутантних поліпептидів, які проявляють поліпшені властивості. Такі терапевтичні композиції з "Зв'язаних молекул", FGF21 мутантних поліпептидів і хімічно модифікованих FGF21 мутантних поліпептидів можуть включати терапевтично ефективна кількість "Зв'язаних молекул", FGF21 мутантних поліпептидів або хімічно модифікованих FGF21 мутантних поліпептидів, які можуть бути хімічно модифіковані, у суміші з фармацевтично або фізіологічно прийнятним композиційним агентом, обраним для відповідності зі способом використання. Прийнятні композиційні матеріали є, переважно, нетоксичними для реципієнтів при використовуваних дозах і концентраціях. Дана фармацевтична композиція може містити композиційні матеріали для модифікування, підтримки або збереження, наприклад, , pH, осмотичного тиску, в'язкості, прозорості, цвіту, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, швидкості розчинення або виділення, абсорбції або проникнення даної композиції. Прийнятні композиційні матеріали включають, але не обмежуючись цим, амінокислоти (такі як гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин), противомікробні речовини, антиоксиданти (такі як аскорбінова кислота, сульфіт натрію або бісульфіт натрію), буфери (такі як борат, бікарбонат, Tris-HCl, цитрати, фосфати або інші органічні кислоти), наповнювачі (такі як маніт або гліцин), хелатоутворювальні агенти (такі як етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТК), комплексоутворювачі (такі як кофеїн, полівінілпірродідон, бета-циклодекстрин або гідроксіпропіл-бета-циклодекстрин, моносахариди, дісахариди й інші вуглеводи (такі як глюкоза, манноза або декстрини), протеїни (такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни), барвники, ароматизатори й розріджувачі, емульсифікатори, гідрофільні полімери (такі як полівінілпіролідин), поліпептиди низької молекулярної ваги, солеутворювальні противоіони (такі як натрій), консерванти (такі як бензалконій хлорид, бензойна кислота, саліцилова кислота, тимеросал, фенетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидін, сорбіновая кислота або перекис водню), розчинники (такі як гліцерин, пропіленгліколь або поліетиленгліколь), цукрові спирти (такі як маніт або сорбіт), суспендирующие агенти, поверхнево-активні речовини або змочувальні агенти (такі як плюроники; ПЕГ; сорбітанові ефіри; полісорбати, такі як полісорбат 20 або полісорбат 80; тритон; трометамін; лецитин; холестерин або тілоксапал), агенти, що підсилюють стабільність (такі як сахароза або сорбіт), агенти-підсилювачі тонусу (такі як галогеніди лужних металів – переважно натрій або калій хлорид – або маніт сорбіт), носії, розріджувачі, наповнювачі й/або фармацевтичні ад'юванти (див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), і наступні видання цієї книги, на які в даній заявці зроблене посилання). Оптимальна фармацевтична композиція буде визначатися досвідченим фахівцем залежно від, наприклад, передбачуваної схеми використання, формату доставки й необхідної дози (див., наприклад, роботу Remington's Pharmaceutical Science). Такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість in vivo виділення й швидкість in vivo кліренсу "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду (який може бути усіченим, кепійованим або Cтермінально мутованим) або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду. Основний носій у фармацевтичній композиції може бути водним або неводним по своїй природі. Наприклад, носієм, що підходить для ін'єкції, може бути вода, фізіологічний сольовий розчин або штучна цереброспинальна рідина, доповнена, можливо, іншими матеріалами, звичайними в композиціях для парентерального використання. Нейтральний буферний 19 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сольовий розчин або сольовий розчин, змішаний із сироватковим альбуміном, служать додатковими ілюстративними носіями. Інші ілюстративні фармацевтичні композиції включають Tris буфер з pH приблизно 7,0-8,5, або ацетатний буфер з величиною рН близько 4,0-5,5, що додатково може містити сорбіт або прийнятний заступник. В одному варіанті цього винаходу композиції із застосуванням "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду й хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду можуть бути приготовлені для зберігання шляхом змішання обраної композиції, що має необхідний ступінь чистоти, з додатковими композиційними агентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) у формі ліофілізованого коржа або водяного розчину. Крім того, "Зв'язана молекула", FGF21 мутантний поліпептид і хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептидний продукт можуть бути складені у вигляді ліофілізата з використанням відповідних наповнювачів, таких як сахароза. Фармацевтичні композиції цього винаходу можуть бути обрані для парентеральної доставки. Як альтернатива, дані композиції можуть бути обрані для інгаляції або для доставки через травний тракт, наприклад, перорально. Готування таких фармацевтично прийнятних композицій знаходиться в межах навичок фахівців у даній галузі. Компоненти композицій присутні в концентраціях, які прийнятні для локального використання. Наприклад, буфери використовуються для підтримки даної композиції при фізіологічному рівні рн або при трохи більш низькому рн, звичайно, в області рн приблизно від 5 до 8. Коли передбачено парентеральное використання, дані терапевтичні композиції для застосування в цьому винаході можуть бути у формі апірогенного, парентерально прийнятного, водяного розчину, що включає необхідні "Зв'язану молекулу", FGF21 мутантний поліпептид або хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептид у фармацевтически прийнятному носії. Особливо прийнятним носієм для парентеральной ін'єкції є стерильна дистильована вода, у якій "Зв'язана молекула", FGF21 мутантний поліпептид або хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептид утворюють стерильний, ізотоничний розчин, що зберігається відповідним чином. Ще один препарат може включати композицію необхідної молекули з агентом, таким як мікросфери у вигляді ін'єкцій, піддані біодеградації частки, полімерні сполуки (такі як полімолочна кислота або полігліколева кислота), бусинки або ліпосоми, які вводяться для контрольованого й пролонгованого виділення даного продукту, що може бути потім доставлений за допомогою депо ін'єкції. Гіалуронова кислота також може бути використана, і це може мати ефект промотовання вповільненого виділення в кровоток. Інші прийнятні засоби для введення необхідної молекули включають пристроїю для доставки ліків, що імплантуються. В одному варіанті фармацевтична композиція може бути складена для інгаляції. Наприклад, "Зв'язана молекула", FGF21 мутантний поліпептид або хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептид можуть бути складені у вигляді сухого порошку для інгаляції. Інгаляційні розчини можуть бути складені із пропеллантом для аерозольної доставки препарату. У ще одному варіанті розчини можуть бути піддані розпиленню. Пульмонарне використання описано більш докладно в міжнародній публікації №. WO 94/20069, що описує пульмонарну доставку хімічно модифікованих протеїнів. Також передбачено, що деякі композиції можуть використовуватися перорально. В одному варіанті цього винаходу "Зв'язана молекула", FGF21 мутантний поліпептид (який може бути усіченим, кепованим або С-термінально мутованим) або хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептид, які використовуються за зазначеною схемою, можуть бути складені з або без тих носіїв, які звичайно використовуються в компаундуванні твердих лікарських форм, таких як таблетки й капсули. Наприклад, може бути сконструйована капсула для виділення активної частини даної композиції в даній крапці шлунково-кишкового тракту, коли біодоступність максималізована а передсистемна деградація мінімізована. Додаткові агенти можуть бути включені для полегшення абсорбції "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду (який може бути усіченим, кепованим або С-термінально мутованим) або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду. Можуть також застосовуватися розріджувачі, ароматизатори, воски з низькою температурою плавлення, рослинні масла, мастильні речовини, суспендуючі агенти, таблеткові дезінтегратори й зв'язувальні речовини. Ще одна фармацевтична композиція може включати терапевтично ефективну кількість "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду (який може бути усіченим, кепованим або С-термінально мутованим) або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду в суміші з нетоксичними наповнювачами, які підходять для виробництва таблеток. Шляхом розчинення таблеток у стерильній воді або іншому прийнятному носії можуть бути приготовлені розчини в однодозовій формі. Придатні наповнювачі включають, однак, не обмежуючись цим, інертні розріджувачі, такі як карбонат кальцію, карбонат натрію або бікарбонат натрію, лактоза або 20 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фосфат кальцію; або єднальні агенти, такі як крохмаль, желатин або гуміарабік; або мастильні агенти, такі як стеарат магнію, стеаринова кислота або тальк. Додаткові фармацевтичні композиції з використанням "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду будуть очевидні фахівцям у даній галузі, включаючи композиції, що містять "Зв'язану молекулу", FGF21 мутантний поліпептид або хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептид, у препаратах з уповільненою або контрольованою доставкою. Способи для створення різних інших засобів з уповільненою або контрольованою доставкою, таких як ліпосомні носії, мікрочастинки, біодеградуються, або пористі бусинки й депо ін'єкції, також відомі фахівцям у даній галузі (див., наприклад, міжнародну публікацію №. WO 93/15722, що описує контрольоване виділення пористих полімерних мікрочастинок для доставки фармацевтичних композицій). Додаткові приклади препаратів із пролонгованим виділенням включають напівпроникні полімерні матриці у формі фасонних виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. Матриці із пролонгованим виділенням можуть включати поліефіри, гідрогелі, полілактиди (патент США №. 3773919 і європейський патент №. 0 058 481), сополімери L-Глутамінової кислоти й гама етил-Lглутамата (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), полі (гідроксіетил-метакрилат) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 and Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), етиленвініл ацетат (Langer et al., supra) або полі-D(-)- 3-оксимасляна кислота (європейський патент №. 0 133 988). Композиції пролонгованого виділення можуть також включати ліпосоми, які можуть бути отримані з використанням кожного з декількох відомих у даній галузі способів. Див., наприклад, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92; і європейські патенти №№. 0 036 676, 0 088 046, і 0 143 949. Фармацевтична композиція із застосуванням "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду, що передбачається використовувати для in vivo застосування, звичайно повинна бути стерильною. Це може бути досягнуте шляхом фільтрації через стерильні фільтруючі мембрани. У тому випадку, де дана композиція ліофілізована, стерилізація з використанням цього способу може проводитися або до або після ліофілізації й відтворення. Композиція для парентерального використання може зберігатися в ліофіліованій формі або в розчині. Крім того, парентеральні композиції, загалом, поміщаються в контейнер, оснащений стерильним портом доступу, наприклад, контейнер для внутрішньовенного розчину або флакон, що мають пробку, що проколюється голкою для підшкірних ін'єкцій. Коли дана фармацевтична композиція складена, вона може зберігатися в стерильних флаконах у вигляді розчину, суспензії, гелю, емульсії, твердої речовини або як збезводнений або ліофілізований порошок. Такі композиції можуть зберігатися або в готовій до застосування формі або у формі (наприклад, ліофілізованній), що вимагає відтворення перед використанням. У специфічному варіанті даний винахід спрямований на набори для готування однодозової одиниці використання. Кожний з таких наборів може містити як перший контейнер, що має сухий протеїн, так і другий контейнер, що має водний препарат. Крім того, в обсяг даного винаходу входять набори, що містять одноразові й багатокамерні попередньо наповнені шприци (наприклад, рідинні шприци й ліошприці). Терапевтично ефективна кількість фармацевтичної композиції з використанням "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду (який може бути усіченим, кепійованим або Стермінально мутованим) або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду, що передбачається використовувати в терапевтичних цілях, буде залежати, наприклад, від терапевтичного контексту й цілей. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що відповідні рівні дозування для лікування будуть варіювати частково залежно від показань молекули, , що доставляється, по яких використовується "Зв'язана молекула", FGF21 мутантний поліпептид або хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептид, схеми використання й розмірів (ваги тіла, поверхні тіла або розміру органа), і стану (вік і загальний стан здоров'я) пацієнта. Відповідно, клініцист може змінити дозування й модифікувати схему використання для одержання оптимального терапевтичного ефекту. Типове дозування може варіювати приблизно від 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше, залежно від згаданих вище факторів. В інших варіантах дозування може варіювати від 0,01 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, наприклад, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,9 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг або 10 мг/кг. Частота дозування буде залежати від фармакокінетичних параметрів "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду у використовуваній композиції. Звичайно клініцист призначає дану композицію доти, поки не досягається доза, що дає бажаний ефект. Тому дана композиція може призначатися у вигляді 21 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 одиничної дози, у вигляді двох або більше доз (які можуть або можуть не містити однакову кількість необхідної молекули) протягом певного періоду часу, або як безперервна інфузія через імплантований пристрій або катетер. Додаткове уточнення відповідного дозування робиться звичайно рядовими фахівцями в даній галузі й входить у коло їхніх обов'язків. Прийнятні дози можуть бути встановлені на підставі відповідних даних щодо реакції пацієнта на використані дози. Схема використання даної фармацевтичної композиції узгоджується з відомими способами, наприклад, перорально; шляхом ін'єкції за внутрішньовенною, інтраперитонеальною, інтрацеребральною (інтрапаренхімальною), інтрацеребровентрикулярною, внутрім'язовою, внутріочною, внутріартеріальною, інтрапортальною або інтралезіональною схемами; за допомогою систем пролонгованого виділення; або за допомогою імплантованих пристроїв. При необхідності, дані композиції можуть використовуватися із застосуванням болюсної ін'єкції або безперервної інфузії, або імплантованого пристрою. Як альтернатива або доповнення, дана композиція може застосовуватися локально шляхом імплантації мембрани, губки або іншого прийнятного матеріалу, на якому необхідна молекула була абсорбована або інкапсульована. Коли застосовується імплантований пристрій, воно може бути імплантоване в будь-яку прийнятну тканину або орган, і доставка необхідної молекули може здійснюватися шляхом дифузії, болюсом із заданим часом виділення або шляхом безперервного введення. 10.Терапевтичні застосування FGF21 поліпептидних мутантів "Зв'язані молекули", FGF21 мутантні поліпептиди (які можуть бути усіченими, кепованими або С-термінально мутованими) і хімічно модифіковані FGF21 мутантні поліпептиди цього винаходу можуть бути використані для лікування, діагностування, ослаблення або попередження ряду хвороб, розладів або станів, включаючи, але не обмежуючись цим, метаболічні розлади. В одному варіанті метаболічний розлад, що передбачається лікувати, являє собою діабет. В іншому варіанті даний метаболічний розлад є ожирінням. Інші варіанти включають метаболічні стани або розлади, такі як дисліпідемія; гіпертензія; гепатостеатоз, такий як неалкогольний стеатогепатит (НАСГ); серцево-судинне захворювання, таке як атеросклероз; і старіння. Що стосується застосування, розлад або стан, таке як діабет або ожиріння, можуть лікуватися шляхом призначення "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду, описаних тут, пацієнтові, що цього потребує, у кількості ефективної терапевтичної дози. Використання може здійснюватися, як описано тут, наприклад, за допомогою внутрішньовенної ін'єкції, або перорально, у формі таблетки або рідкого препарату. У більшості ситуацій необхідна доза може бути визначена клініцистом, як описано тут, і може представляти терапевтично ефективну дозу "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду. Фахівцям у даній галузі очевидно, що терапевтично ефективна доза "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду буде залежати, inter alia, від схеми використання, одиничної дози призначеного антигену, того, чи використовувалася молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду в комбінації з іншими терапевтичними агентами, імунологічного статусу й здоров'я реципієнта. Термін "терапевтично ефективна доза" використовуваний тут, означає ту кількість "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду, що викликає дану біологічну або медичну реакцію в тканинній системі, тварині або людині, що очікує дослідник, медичний доктор або інший клініцист, що включає ослаблення симптомів хвороби або розлади, які піддаються лікуванню. 11.Антитіла Антитіла й фрагменти антитіл, які специфічним чином зв'язуються з "Зв'язаною молекулою", FGF21 мутантним поліпептидом або хімічно модифікованими FGF21 мутантними поліпептидами цього винаходу, але не зв'язуються специфічно з поліпептидами FGF21 дикого типу, передбачені в цьому винаході. Антитіла можуть бути поліклональними, включаючи моноспецифічні поліклональні; моноклональними (МАТ); рекомбінантними; химерними; гуманізованими, такими як щеплені з гіперваріабельною ділянкою ((CDR)-grafted); людськими; одноланцюговими; і/або біспецифічними; також як і фрагменти; варіанти; або їх хімічно модифіковані молекули. Фрагменти антитіл включають ті ділянки даного антитіла, які специфічно пов'язані з епітопом на FGF21 мутантному поліпептиді. Приклади таких фрагментів включають Fab і F(ab') фрагменти, сгенеровані шляхом ферментативного розщеплення антитіл повної довжини. Інші єднальні фрагменти включають ті, що сгенеровані способами 22 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рекомбінантної ДНК, такими як експресія рекомбінантних плазмід, які містять нуклеїновокислотні послідовності, що кодують варіабельні ділянки антитіла. Поліклональні антитіла, спрямовані на "Зв'язану молекулу", FGF21 мутантний поліпептид або хімічно модифікований FGF21 мутантний поліпептид, виробляються, загалом, у тварин (наприклад, кроликах або мишах) за допомогою множинних підшкірних або інтраперитонеальних ін'єкцій FGF21 мутантного поліпептиду й ад'юванта. Може бути корисним кон'югувати FGF21 мутантний поліпептид із протеїном-носієм, імуногенним у видах, які мають бути імунізовані, таким як гемоціанін кільцевої структури у вигляді замкової щілини, сироватка, альбумін, бичачий тироглобулін або соєвий трипсиновий інгібітор. Крім того, використовуються агрегуючі агенти, такі як квасци, для посилення імунної реакції. Після імунізації тваринам роблять кровопускання, і сироватка аналізується на титр антитіла проти "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду. Моноклональні антитіла, спрямовані на "Зв'язану молекулу", FGF21 мутантні поліпептиди або хімічно модифіковані FGF21 мутантні поліпептиди, можуть бути отримані з використанням будь-якого способу, що передбачає вироблення молекул антитіла за допомогою безперервних клітинних ліній у культурі. Приклади прийнятних способів для готування моноклональних антитіл включають гвбридомні способи Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-97 і спосіб B-Клітинної гібридоми людини (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). Також даний винахід пропонує лінії клітинної гібридоми, які виробляють моноклональні антитіла, реактивні з "Зв'язаною молекулою", FGF21 мутантними поліпептидами або хімічно модифікованими FGF21 мутантними поліпептидами. Анти-FGF21 мутантні антитіла даного винаходу можуть використовуватися в будь-якому відомому способі аналізу, такому як конкурентно-єднальні аналізи, прямий і непрямий сендвічеві аналізи й імунопреципітаціоні аналізи (див., наприклад, роботу Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), на яку в даній заявці зроблене повне посилання) для виявлення й кількісного визначення FGF21 мутантних поліпептидів. Дані антитіла будуть зв'язувати FGF21 мутантні поліпептиди зі спорідненістю, що підходить для застосування даного способу аналізу. Для діагностичних додатків, у деяких варіантах, антитіла проти "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду можуть бути мічені складовою, що спостерігається. Складова, що спостерігається, може бути будь-яка складова, що здатна давати сигнал, що прямо або побічно спостерігається. Наприклад, 3 14 32 35 125 99 111 складова, що спостерігається, може бути радіоізотопом, таким як H, C, P, S, I, Tc, In, 67 або Ga; флуоресцентною або хемілюмінесцентною сполукою, такою як флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін або люцифераза; або ферментом, таким як лужна фосфатаза, βгалактозидаза або пероксидаза хріну звичайного (Bayer et al., 1990, Meth. Enz. 184: 138-63). Конкурентно-єднальні аналізи засновані на здатності міченого еталона (наприклад, FGF21 мутантного поліпептиду або його імунологічно реакційної частини) конкурувати з випробовуваною пробою аналізованої речовини (наприклад, "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду) на зв'язування з обмеженою кількістю антитіла проти "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду, залежно від аналізованої речовини. Кількість "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду у випробовуваній пробі зворотно пропорційно кількості еталона, що стає пов'язаним з даними антитілами. Для полегшення визначення кількості еталона, що стає зв'язаним, дані антитіла звичайно інсолюбуються перед або після конкурентної боротьби, так що еталон і аналізована речовина, які пов'язані з антитілами, можуть легко бути відділені від еталона й аналізованої речовини, які залишилися незв'язаними. Сендвічеві аналізи звичайно включають використання двох антитіл, кожне здатне зв'язуватися з окремою імуногенною частиною або епітопом протеїну, що передбачається виявити й/або піддати кількісному аналізу. У сендвічевому аналізі випробовувана проба аналізованої речовини звичайно зв'язується першим антитілом, що іммобілізовано на твердій підложці, і після цього друге антитіло зв'язується з аналізованою речовиною, утворюючи, таким чином, нерозчинний комплекс з трьох частин. Див., наприклад, патент США №. 4376110. Друге антитіло саме може бути мічено складовою, що спостерігається, (прямій сендвічевий аналіз) або може визначатися з використанням антитіла до імуноглобуліну, міченого складовою, що спостерігається, (непрямий сендвічевий аналіз). Наприклад, одним типом сендвічевого аналізу 23 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 є імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA), у якому складовою, що спостерігається, є фермент. Антитіла проти "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду цього винаходу також корисні для in vivo візуалізації. Антитіло, мічене складовою, що спостерігається, може вводитися тварині, переважно, у кровоток, і присутність і місце розташування міченого антитіла в хазяїні аналізується. Дане антитіло може бути мічене будь-якою складовою, що спостерігається у тварині, або способом ядерного магнітного резонансу, радіологічним способом або іншими засобами виявлення, які відомі в даній галузі. Даний винахід також стосується набору, що включає "Зв'язані молекули", FGF21 мутантні поліпептиди або хімічно модифіковані FGF21 мутантні поліпептидні антитіла й інші реагенти, корисні для виявлення рівнів "Зв'язаної молекули", FGF21 мутантного поліпептиду або хімічно модифікованого FGF21 мутантного поліпептиду в біологічних пробах. Такі реагенти можуть включати мітку, що спостерігається і що блокує сироватку, позитивні й негативну контрольні проби й реактиви для виявлення. Приклади Наступні приклади ілюструють специфічні варіанти даного винаходу і їхні різноманітні застосування. Вони представлені тільки з метою пояснення й не повинні розглядатися як обмежуючі обсяг даного винаходу тією чи іншою мірою. Приклад 1 Одержання FGF21 поліпептидних експресуючих конструктів Нуклеїновокислотна послідовність, що кодує зрілий FGF21 поліпептид, була отримана способом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) ампліфікації з використанням праймерів, що мають нуклеотидні послідовності, що відповідають 5" і 3" кінцям зрілої FGF21 послідовності. У Таблиці 4 перераховані праймери, які були використані для ампліфікації зрілої FGF21 послідовності. Таблиця 4 ПЛР праймери для одержання FGF21 конструкта Праймер Зміст. Антизміст. 30 35 40 45 50 Послідовність 5'-AGGAGGAATAACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCC-3' 5'-TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3' SEQ ID NO: 33 34 Праймери, використані для готування FGF21 експресуючого конструкта, включали рестрикційні ендонуклеазні сайти для спрямованого клонування даної послідовності в прийнятний експресуючий вектор (наприклад, pET30 (Novagen/EMD Biosciences; San Diego, CA) або pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA)). Експресуючий вектор pAMG33 містить малокопійний (low-copy) R-100 реплікатор, модифікований lac промотор і канаміцин-резистентний ген. Експресуючий вектор pET30 містить отриманий з pBR322 реплікатор, ундукований T7 промотор і канаміцин-резистентний ген. Хоча експресія від pAMG33, як було знайдено, була вище, pET30, як було встановлено, є більш надійним клонючим вектором. Таким чином, більшість конструктів, описаних у даній заявці, спочатку генерувалося в pET30 і потім піддавалося скринінгу, що стосується ефективності. Обрані послідовності потім переносилися в pAMG33 для подальшої ампліфікації. FGF21 послідовність була ампліфікована в реакційній суміші, що містить 40,65 мкл dH 2O, 5 мкл PfuUltra II реакційні буфери (10x), 1,25 мкл dNTP Mix (40 м – 4 × 10 м), 0,1 мкл Template (100 нг/мол), 1 мкл Primer1 (10 мк), 1 мкл Primer2 (10 мк), і 1 мкл PfuUltra II fusion HS ДНК полімерази (Stratagene; La Jolla, CA). Реакції ампліфікації проводилися шляхом нагрівання протягом двох хвилин при 95 °C; потім десятьма циклами при 95 °C протягом 20 секунд, 60 °C протягом 20 секунд (при додатковому вирахуванні 1 °C на цикл), і 72 °C протягом 15 секунд/кілобазу (тисяча гетероциклічних основ нуклеїнової кислоти) необхідного продукту; з наступними 20 циклами при 94 °C протягом 20 секунд, 55 °C протягом 20 секунд, і 72 °C протягом 15 секунд/кілобазу необхідного продукту; потім при 72 °C протягом трьох хвилин. Продукти ампліфікації розщеплювалися рестрикційними ендонуклеазами NdeI і EcoRI; вшивалися в прийнятний вектор і потім трансформувалися в компетентні клітини. 24 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як результат використання бактеріальної експресуючої системи, експресійний зрілий FGF21 поліпептид включав N-кінцевий метіоніновий залишок або змінний метіоніновий залишок, такий як fMet або глюконілований Met. Приклад 2 Очищення FGF21 поліпептидів дикого типу від бактерій У наступних прикладах поліпептиди FGF21 дикого типу були експресовані в бактеріальній експресуючій системі. Після експресування, описаного нижче, поліпептиди FGF21 дикого типу були піддані очищенню, як описано в цьому прикладі, якщо не зазначено інше. Для очищення поліпептиду FGF21 дикого типу від бактеріальних включень двічі промиті включення (DWIBs) були солюбілізовані в солюбілізованому буфері, що містить гуанідина гідрохлорид і дітіотреїтол (DTT) в Tris буфері при pH 8,5, і потім змішувалися протягом однієї години при кімнатній температурі, і дана солюбілізаційна суміш додавалася до відновленого буфера, що містить сечовину, аргінін, цистеїн і цистамін гідрохлорид при р 9,5, і змішувалася протягом 24 годин при 5 °C (див., наприклад, роботи Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 15763; Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph et al., 1997, "Folding proteins, ” in Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press), pp 57-99; and Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6). Після солюбілізації й рефолдінга дану суміш фільтрували через 0,45 мікронний фільтр. Даний пул потім концентрували приблизно 10-кратні за допомогою касети Pall Omega із граничною молекулярною вагою 10 кДа при трансмембранному тиску (TMД) 20 фунтів/кв.дюйм, піддавали діалітичному фільтруванню 3 колонковими обсягами 20 м Tris, pH 8,0 при ТМД 20 фунтів/кв.дюйм. Освітлений зразок потім піддавався аніонообмінній хроматографії (AОХ) з використанням Q Sepharose HP смоли. Була проведена серія дослідів з використанням лінійного сольового градієнта від 0 до 250 м NaCl в 20 м Tris при pH 8,0 і 5 °C. Пікові фракції аналізувалися способом SDS-PAGE і збиралися. Потім АОХ елюатний пул піддавався гідрофобної хроматографії (ГХ) з використанням Phenyl Sepharose HP смоли. Протеїн елюювали з використанням зменшуваного лінійного градієнта від 0,7 M до 0 M сульфату амонію при pH 8,0 і кімнатній температурі. Пікові фракції аналізувалися способом SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) і збиралися. 2 ГХ пул концентрувався за допомогою 0,2 м касети Pall Omega із граничною молекулярною вагою 10 кДа до 7 мг/мол при трансмембранному тиску (TMТ) 20 фунтів/кв.дюйм. Концентрат піддавався діалітичному фільтруванню 5 обсягами 10 м KPO4, 5 % сорбіту, pH 8,0 при ТМТ 20 фунтів/кв.дюйм, і відновлений концентрат розбавлявся до 5 мг/мол. У кінці, розчин фільтрували через мембрану Pall mini-Kleenpac 0,2 мк Posidyne. Приклад 3 Ідентифікація FGF21 мутантів FGF21 дикого типу має відносно короткий період напіврозпаду, і в деяких випадках це може бути небажаним для застосування FGF21 дикого типу як терапевтичного засобу. Крім того, традиційні способи розширення періоду напіврозпаду, такі як ПЕГілювання даного поліпептиду, обмежені числом і розташуванням прийнятних сайтів ПЕГілювання в FGF21 послідовності. У поліпептидній послідовності FGF21 дикого типу є сім природних сайтів ПЕГілювання, а саме, альфа аміногрупа, чотири лізинових залишки й два цистеїнових залишки. Ці сайти не є ідеальними для ПЕГілювання, оскільки молекула ПЕГ може негативно впливати на здатність FGF21 здобувати свою природну структуру або може негативно впливати на взаємодію між FGF21 і своїм рецептором або бета-клото (klotho). Крім того, за винятком альфа аміногрупи, ці реактивні залишки не враховують сайт-специфічне ПЕГілювання в єдиному цілеспрямованому положенні. Відповідно, було почато спрямоване й спеціальне дослідження для ідентифікації залишків у поліпептиді FGF21 дикого типу, які могли б мутувати у залишок, що підходить для хімічної модифікації. Міркування в даному дослідженні стосувалися розташування залишку в FGF21 послідовності, також як і його розташування на протеїновій поверхні. У спробі ідентифікувати окремі залишки в поліпептиді FGF21 дикого типу, які підходили б для мутації в залишок, придатний для хімічної модифікації, використовувалися описані тут дві різні стратегії. Приклад 3.A Кандидатури на мутування, ідентифіковані з використанням гомологічної моделі У першій стратегії була застосована гомологічна модель у систематичному раціональному протеїновому інжиніринговому підході до ідентифікації залишків, що мають ізвисокою ймовірністю виступаючі на поверхню бічні ланцюги, які, імовірно, можуть витримати ПЕГілювання без шкоди для FGF21 активності. Оскільки опубліковані рентгенівські або ЯМР 25 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 структури FGF21, які могли б бути використані для ідентифікації таких залишків, відсутні, була використана рентгенівська кристалічна структура FGF19 (1PWA) високого дозволяння (1,3 A), отримана з банку даних по протеїнах Protein Databank (PDB), для створення тривимірної гомологічної моделі FGF21 з використанням програмного забезпечення для моделювання MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canada). FGF19 був обраний як матриця, оскільки серед протеїнів, депонованих у зазначеному банку даних по протеїнах, FGF19 є найближчим протеїном до FGF21 у рамках гомології амінокислотної послідовності. Потім FGF21 гомологічна модель була розширена до подання зв'язку FGF-21 з FGF рецептором. Ця модель була використана для ідентифікації залишків, які, імовірно, виступають на поверхню молекули FGF21 і доступні для реакції з активованої полімерної (наприклад, ПЕГ) складової, уникаючи при цьому тих залишків, які можуть перешкодити взаємодії FGF21 з рецептором. Приймалися в увагу також міркування відносно збереження залишків у даній послідовності між видами, також як і біохімічні властивості природного бічного ланцюга. Залишки, ідентифіковані як гарні кандидатури за допомогою цього скринінга, ранжирувалися відповідно до оціненої ймовірності успішного ПЕГілювання цього сайту при мінімальному порушенні активності. Залишки в групі A відображують найкращі кандидатури, і залишки в групі D відображують життєздатні, але менш кращі кандидатури. Група A включає N121, H125, H112, R77, H87, E37 і K69. Група B включає R126, G113, D79, E91, D38, D46 і G120. Група C включає S71, D89, L86, T70, G39, T40, R36, P49, S48, S123, K122, A81, A111, E110 і R96. Нарешті, група D включає Q18, R19, A26, Q28, E34, A44, A45, E50, L52, Q54, L55, K59, G61, L66, V68, R72, P78, G80, Y83, S85, F88, P90, A92, S94, L98, E101, D102, Q108, L114, H117, P119, P124, D127, P128, A129, P130, R131, і P140. Крім того, були ідентифіковані сайти ПЕГілювання усередині аміно й карбоксі-кінцевих сегментів даної молекули, виходячи з випрямлення послідовності й біохімічних властивостей бічних ланцюгів, оскільки для цих частин молекули тривимірні структурні дані відсутні. Залишки, які, як думали, найбільше підходили для мутації, були ідентифіковані й потім згруповані відповідно до того, наскільки добре вони відповідають ряду обраних критеріїв. Залишки 1-13 були оцінені у відношенні N-Кінця FGF21 поліпептидної послідовності, і D5 був визначений як найкраща кандидатура для мутації, а залишки H1, P2, I3, P4 і S6 були також визначені як життєздатні. У відношенні C-кінця FGF21 поліпептидної послідовності були оцінені залишки 141181, і залишки Y179 і R175 були визначені як найкращі кандидатури для мутації, а залишки P143, P171, S172, Q173, G174, S176, P177, S178, A180 і S181, утворили другу групу кандидатів, і залишки P144, A145, P147, E148, P149, P150, I152 A154, Q156 і G170 утворили третю групу кандидатур для мутації. Приклад 3.B FGF21 мутанти, генеровані шляхом видалення небажаних сайтів приєднання природних полімерів Друга стратегія використовувала аміноспецифічну хімію кон'югації для сполучення ПЕГ і FGF21. Сайт-Селективне подвійне ПЕГілювання потенційно вакуолегенних кон'югатов може значно знизити їх вакуолегенний потенціал (див., наприклад, патент США №. 6420339). Відповідно, в одному аспекті цього винаходу сайт-селективне подвійне ПЕГілювання здійснюється шляхом мутування даного протеїну, так що тільки дві первинних аміногрупи залишаються для ПЕГілювання. FGF21 протеїн містить чотири лізинових і десять аргінінових залишків, як виділено жирним шрифтом (R і K залишки), і підкресленням (K залишки) послідовності FGF21 дикого типу (SEQ ID NO:4). Два природних цистеїнових залишки виділені жирним шрифтом і курсивом: HPIPD SSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLE IREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLED GY NVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP SQGRSPSYASSEQIDNO:4 Чотири природних лізина були спочатку мутовані в аргініни для створення батьківської молекули, що містить тільки одну первинну аміногрупу як α-аміногрупу в N-Кінці. Вона тестувалася на in vitro активність, і, як було знайдено, була повністю активною. Потім селективні аргініни були покроково замінені лізином для створення до десяти аналогів, що містять другу первинну аміногрупу для ПЕГілювання в різних положеннях на FGF21 молекулі. Вивчення гомологічної моделі FGF21, зв'язаного зі своїм рецептором (як описано в Прикладі 3A), дозволило провести ранжирування пропонованих сайтів кон'югації залежно від їхньої близькості 26 UA 105016 C2 5 10 15 20 25 до передбачуваного інтерфейсу рецептора. Сайти, які передбачалися схованими, не розглядалися. Різні положення ранжирувалися і характеризувалися в такий спосіб: (a) сайти, доступні розчиннику й вилучені від інтерфейсу рецептора: R36, R77, K122 & R126; (б) сайти, доступні розчиннику й близькі до інтерфейсу рецептора: K56, K59, K69, R72 & R175; і (в) сайти, які сховані: R17, R19, R131 & R135. Кінцеві конструкти, кожний з яких містить єдину α-аміно й ε-аміногрупу, очищали й випробовували на активність перед і після кон'югації з ПЕГ, як описано в Прикладі 9 (кон'югація) і 10 (in vitro проба на активність). Приклад 4 Ідентифікація FGF21 мутантів, що включають одиничну мутацію Зведення FGF21 мутантів, що включають єдину мутацію, які генерувалися за допомогою раціонального протеїнового інжинірингового підходу, описаних вище в Прикладі 3.A і 3.B, наведене в Таблиці 3. Ці окремі мутанти вводять і включають сайт приєднання неприродного полімеру, особливо цистеїновий або лізиновий залишок. Бічні ланцюги цих залишків особливо підходять для хімічної модифікації шляхом приєднання полімеру, такого як молекули ПЕГ. Було визнано, що на додаток до введеного сайту приєднання неприродного полімеру, полімер може бути приєднаний, за необхідності, до N-кінця даного протеїну, якщо в цьому є потреба. Оскільки введені залишки були сконструйовані з метою підтримувати рівні біологічної активності FGF21 дикого типу, ці FGF21 мутантні поліпептиди, як очікується, підтримують FGF21 біологічну активність і усе ще вводять один або кілька сайтів приєднання неприродного полімеру. Після хімічної модифікації (наприклад, ПЕГілювання) ці мутанти, як очікується, мають більш тривалий in vivo період напіврозпаду, чим FGF21 дикого типу, зберігаючи в той же час значні in vivo рівні біологічної активності дикого типу. Номери положень, задані для мутагенезу, наведені в Таблиці 5 і відповідають положенню залишку в зрілому FGF21 протеїні, що складається з 181 амінокислотного залишку. Нуклеїновокислотні послідовності, що кодують FGF21 мутантні поліпептиди, перераховані в Таблиці 5 нижче, були приготовлені з використанням описаних нижче способів. Таблиця 5 FGF21 мутантні поліпептиди, що включають одиничну мутацію Номер залишку 36 37 38 46 56 60 91 69 69 72 77 77 79 86 91 112 113 120 121 122 125 126 126 171 Дикий. тип R E D D K K E K K R R R D H E H G G N K H R R P 30 27 Мутація K C C C R R C C R K C K C C C C C C C R C C K G R36K E37C D38C D46C K56R K60R E91C K69C K69R R72K R77C R77K D79C H86C E91C H112C G113C G120C N121C K122R H125C R126C R126K P171G UA 105016 C2 Продовження таблиці 5 175 175 170 179 5 10 15 20 25 R R G Y C K C C R175C R175K G170C Y179C Приклад 5 Ідентифікація FGF21 мутантів, що включають дві мутації Додатковий аналіз гомологічної моделі й даних, отриманих від окремих цистеїнових мутантів, був проведений з метою ідентифікувати комбінації мутантів, які могли б увести два сайти приєднання неприродного полімеру. Після хімічної модифікації ці FGF21 мутанти мають два полімери (наприклад, молекули ПЕГ), приєднаних до даного поліпептиду в необхідних положеннях. Як і для всіх FGF21 мутантних поліпептидів цього винаходу, полімер може також бути приєднаний до N-кінця даного поліпептиду, залежно від природи самого цього полімеру. Малюнок, що зображує двічі ПЕГільований GF21 мутант, представлений на Фігурі 1. Зведення FGF21 мутантів, що включають дві мутації, які були генеровані за допомогою раціонального протеїнового інжинірингового підходу, представлено в Таблиці 6. Ці подвійні мутанти включають сайт приєднання неприродного полімеру, особливо, цистеїну. Бічні ланцюги цих залишків особливо підходять для хімічної модифікації шляхом приєднання полімеру, такого як молекула ПЕГ. Було визнано, що на додаток до введеного сайту приєднання неприродного полімеру, полімер може бути, за необхідності, приєднаний до N-Кінця даного протеїну, якщо в цьому є потреба. Оскільки введені залишки були сконструйовані для підтримки біологічної активності FGF21, ці FGF21 мутанти, як передбачається, зберігають біологічну активність FGF21 і ще вводять один або кілька сайтів приєднання неприродного полімеру. Після хімічного модифікування (наприклад, ПЕГілювання) ці мутанти, як передбачається, мають більш тривалий період напіврозпаду, ніж FGF21 дикого типу, і в той же час підтримують значну in vivo активність. Номери положень, наведені в Таблиці 6, відповідають положенню залишку в зрілому FGF21 протеїні, що складається з 181 амінокислотного залишку. Нуклеїновокислотні послідовності, що кодують FGF21 мутантні поліпептиди, перераховані в Таблиці 6 нижче, були приготовлені з використанням способів, описаних нижче. Таблиця 6 FGF21 мутантні поліпептиди, що включають дві мутації Залишок 1 37 120 77 77 91 77 37 91 37 91 37 77 37 37 69 120 69 69 69 Дикий тип E G R R E R E E E E E R E E K G K K K Мутація C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Залишок 2 77 125 91 125 125 120 91 175 175 120 120 175 125 69 91 175 120 125 77 30 28 Дикий тип R H E H H G E R R G G R H K E R G H R Мутація C C C C C C C C C C C C C C C C C C C E37C, R77C G120C, H125C R77C, E91C R77C, H125C E91C, H125C R77C, G120C E37C, E91C E91C, R175C E37C, R175C E91C, G120C E37C, G120C R77C, R175C E37C, H125C E37C, K69C K69C, E91C G120C, R175C K69C, G120C K69C, H125C K69C, R77C