Спосіб культивування ентеровірусів свиней у культурі клітин hep-2

Реферат: Спосіб культивування ентеровірусів свиней у культурі клітин Нер-2 включає зараження інфікуючою дозою моношару культури клітин, визначення репродукції ентеровірусів свиней у культурі клітин за рівнем прояву цитопатичної дії, отримання на 72-96 год. (ЦПД ++++) вірусовмісної сировини шляхом триразового заморожування-відтаювання культуральної суспензії. Для отримання культуральної суспензії ентеровірусів свиней з високим інфекційним титром як перещеплювана культура клітин для репродукції та накопичення ентеровірусів свиней використовують гетерологічну перещеплювану культуру клітин Нер-2. UA 101245 U (54) СПОСІБ КУЛЬТИВУВАННЯ ЕНТЕРОВІРУСІВ СВИНЕЙ У КУЛЬТУРІ КЛІТИН HEP-2 UA 101245 U UA 101245 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області біології, генетики та ветеринарної вірусології і може бути використана для дослідження біологічних, генетичних та серологічних властивостей ентеровірусів свиней, а також знайде застосування у виробничих лабораторіях ветеринарної медицини та науково-дослідних установах, сприятиме проведенню лікувальних та профілактичних заходів щодо ентеровірусних хвороб свиней. Найближчим аналогом є вивчення репродукції ентеровірусів свиней у культурі клітин СНЕВ та ВНК-21. Культуральні властивості штамів вірусів є одним із основних параметрів при якісній оцінці їх імунобіологічних властивостей. Культури клітин являють собою зручну модель для вивчення репродуктивної здатності вірусів та накопичення необхідних об'ємів вірусної біомаси. Завдяки мономорфності клітинних культур одержують вірусну суспензію з мінімальною кількістю сторонніх домішок [1, 2]. Найбільш широковживано при культивуванні ентеровірусів свиней використовують як первинні, так і перещеплювані культури клітин та їх клоновані варіанти: нирки свині - PS, PS-EK, РК-15, IB-RS-2, СНЕВ [3-5], тестикули свиней - ST [6]. Унікальністю розробленого нами способу використання культури клітин Нер-2 для індикації репродукції ентеровірусів свиней є те, що вона чутлива до ряду вірусів: аденовірус 3, герпесвірус, поліовірус 1, респіраторний синцитіальний вірус, везикулярний стоматит, арбовірус, вірус корі, Коксакі ECHO, вірус хвороби Ньюкасла, вірус парагрипу 2 і 3 - є чутливою до ентеровірусів свиней та, що є важливим, гетерологічною відношено до них. Культура клітин Нер-2 (перещеплювана культура клітин з епідермоїдної карциноми гортані людини) має подібні з перещеплюваною культурою клітин СНЕВ культурально-морфологічні властивості. В основу корисної моделі поставлена задача дослідити культуральні властивості штамів, ізолятів та клонів ентеровірусів свиней у гетерологічній культурі клітин Нер-2 порівняно з гомологічною культурою клітин СНЕВ та розширити спектр перещеплюваних клітинних ліній для виділення та культивування ентеровірусів свиней. Поставлена задача вирішується шляхом культивування ентеровірусів свиней на гетерологічній перещеплюваній культурі клітин Нер-2. Дану культуру клітин адаптували в лабораторії імуногенетики ентеровірусів свиней IBM HAAH до живильного середовища, яке включало рівне співвідношення середовищ DMEM і 199 (90 %) та сироватку ВРХ (10 %). Суть корисної моделі полягає в тому, що ентеровіруси свиней проявляють характерну для них цитопатичну активність у культурі клітин Нер-2, тобто появу у зараженому ентеровірусами свиней моношарі дрібних фокусів круглих клітин через дві-три доби після зараження, які через 8-12 годин перетворюються у вогнища круглих клітин (50-70 % моношару), а ще через 12-24 годин повною руйнацією моношару та сповзання його зі скла. Цитопатичну дію ентеровірусів свиней в культурі клітин Нер-2 оцінювали в плюсах: - + - деструкція окремих клітин культури неспецифічної конфігурації (до 25 %) - результат вважали негативним; - ++ - деструкція більшості клітин, утворення пустот у моно шарі внаслідок відривання клітин від скла (75 %); - ++++ - повна деструкція або зміна всіх клітин культури (100 %). Позитивним результатом вважається ураження моношару культури клітин на два і більше плюсів. Для звільнення клітинно-зв'язаного вірусу, вірусовмісну суспензію дезінтегрували 3разовим заморожуванням-відтаюванням. Для контролю неспецифічної дегенерації клітин, залишали 4 пробірки (матраци) із незараженим моношаром культури клітин, в яких змінювали ростове середовище на підтримуюче (без додавання сироватки ВРХ). У дослідженнях використовували референтні штами ентеровірусів свиней колекції лабораторії імунології ентеровірусів свиней IBM HAAH, виділені в лабораторії імунології ентеровірусів свиней IBM HAAH ізоляти та клони ентеровірусів свиней. Культуру клітин Нер-2 використовували з колекції культур Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського НАМН України. Приклад 1. Здійснення способу Для здійснення способу референтні штами, ізоляти та клони ентеровірусів свиней паралельно титрували у культурах клітин СНЕВ та Нер-2. Усі операції із зараженням культур клітин здійснювали у захисному укритті - боксі (клас 2 безпеки). Після видалення середовища росту у пробірки з моношаром вносили по 0,2 мл вірусної суспензії (відповідно по 4 пробірки на кожний вірус) та 0,8 мл підтримуючого середовища. Пробірки інкубували у стаціонарному положенні під кутом 5 при +37 °C. Культури щоденно мікроскопували, враховуючи появу цитопатичної дії. 1 UA 101245 U Усі дослідні віруси культивували в кожній культурі клітин впродовж п'яти послідовних пасажів. При ураженні моношару більше ніж на 70 %, пробірки знімали з досліду і піддавали замороженню. Результати дослідів оформлені у вигляді таблиці 1. 5 Таблиця 1 Репродукція ентеровірусів свиней на різних культурах клітин Назва штаму/ізоляту/клону ентеровірусів Konratice Клон № 1 Клон № 2 Перечинський-642 Клон № 3 Березнянський-652 Клон № 4 Чернігівський-2372 Клон № 5 Ізолят 1-го серотипу Клон № 6 Т-80 Клон № 7 Ізолят 2-го серотипу Клон № 8 V13 Клон № 9 Ізолят 8-го серотипу Клон № 10 10 15 Цитопатична дія у культурі клітин Цитопатична дія у культурі клітин Нер-2, год. СНЕВ, год. 1 пас. 5 пас. 1 пас. 5 пас. 96 72 24 24 72 48 24 48 72 48 24 48 96 96 48 24 96 72 24 48 72 72 48 24 72 48 48 48 120 96 48 24 96 72 48 72 120 120 72 48 120 96 72 96 96 72 24 24 72 48 24 48 120 96 48 48 96 72 48 72 96 72 48 24 72 48 48 72 120 96 48 48 96 48 48 72 Цитопатична дія референтних ентеровірусів проявлялась на культурі клітин Нер-2 в першому пасажі через 120-72 год., ізолятів - через 120-96 год., а клонів виділених з референтних штамів через 72-96 год. і клонів виділених із ізолятів - через 96-120 год. Після адаптації до КК Нер-2, в п'ятому пасажі відмічали скорочення терміну появи цитопатичної дії вихідних штамів та ізолятів, а також виділених з них клонів на 24 год. Відповідно час проявлення ЦПД на культуру клітин СНЕВ отриманих клонів з референтних штамів ентеровірусів свиней в першому пасажі становив 24-48 год., ЦПД клонів з ізолятів - 4872 год. Час проявлення ЦПД на культуру клітин СНЕВ клонів з референтних штамів у п'ятому пасажі подовжився на 24 годин, клонів ізолятів - на 24-48 год. Приклад 2. Визначення ефективності способу Ефективність способу визначали за цитопатичною активністю при порівняльному дослідженні інфекційних титрів ентеровірусів у культурі клітин СНЕВ і культурі клітин Нер-2. Результати досліду зведені у таблицях 2 і 3. 20 Таблиця 2 Інфекційна активність ентеровірусів свиней у культурі клітин СНЕВ Назва ентеровірусів Konratice Перечинський-642 Березнянський-652 Чернігівський-2372 Ізолят 1-го серотипу Т-80 Титр до клонування lg Назва клону 3 ТЦД50/см ентеровірусів 9,08±0,23 Клон № 1 Клон № 2 8,58±0,09 Клон № 3 8,92±0,30 Клон № 4 6,67±0,23 Клон № 5 8,17±0,18 Клон № 6 8,75±0,14 Клон № 7 2 Титр після клонування, lg 3 ТЦД50/см 9,6±0,09 9,8±0,18 9,42±0,09 9,67±0,09 7,42±0,09 8,83±0,09 9,58±0,09 UA 101245 U Продовження таблиці 2 Ізолят 2-го серотипу V13 Ізолят 8-го серотипу 8,0±0,14 8,58±0,16 8,25±0,25 Клон № 8 Клон № 9 Клон № 10 8,58±0,09 9,42±0,09 9,33±0,18 Примітка: M±m, n=3, P