Спосіб індикації репродуктивної активності ентеровірусів свиней у культурі клітин внк-21

Спосіб індикації репродуктивної активності ентеровірусів свиней, який відрізняється тим, що її проводять у культурі клітин ВНК-21/сlоn13, що є гетерологічною відносно ентеровірусів свиней. (19) (21) u200811494 (22) 24.09.2008 (24) 12.01.2009 (46) 12.01.2009, Бюл.№ 1, 2009 р. (72) РОМАНЕНКО ВОЛОДИ МИР ПИЛИПОВИЧ, UA, ДЕРКАЧ ІРИНА МИХАЙЛІВН А, UA 3 38364 Цитопатична дія ентеровірусів у к ультурі клітин ВНК-21/сlоn 13 оцінюється в плюсах: + (25%) - деструкція окремих клітин культури; ++ (50%) - деструкція половини клітин культури; +++ (75%) - деструкція більшості клітин культури, утворення пустот у моношарі внаслідок відривання клітин від скла; ++++ (#) (100%) - деструкція всіх клітин культури, на склі залишаються невеликі осередки змінених клітин. З метою отримання максимальної концентрації вірусу пробірки та матраці із зараженою культурою клітин виймають із термостату на кінцевих стадіях (3-4 плюси). Вірус, який розмножується у культурі клітин, нагромаджується поступово в культуральній рідині. Але частина вірусу може залишатися в незруйнованих клітинах. Для звільнення клітиннозв’язаного вірусу клітини дезінтегрують 2-3разовим заморожуванням-відтаванням. ЦПД вірусів слід відрізняти від неспецифічної дегенерації клітин, що спостерігається при старінні культури. Тому необхідно залишати по 4 пробірки із незараженою культурою, в яких змінюють старе середовище на нове (без сироватки крові ВРХ). Крім того потрібно завжди враховувати, що деге 4 нерацію може зумовлювати токсична дія дослідного матеріалу. Тому за необхідності виключення цього слід провести додатковий пасаж: інфікованою культуральною рідиною заражають нові пробірки з культурою клітин. ЦПД у другому пасажі не проявиться, якщо дегенерація клітин була зумовлена токсичним фактором. У дослідженнях використовували референтні штами ентеровірусів свиней колекції лабораторії генетики і імунології IBM УААН (ентеровіруси свиней 1-8-го серотипів англійської колекції, надісланих в 1970 році В.П. Романенку д-ром Derbyshire J. (Pirbright, Великобританія) та 14 нових, класифікованих В.П. Романенком, раніше невідомих, серотипів ентеровірусів, які захищені авторськими свідоцтвами СРСР). Культур у клітин СНЕВ використовували з колекції культур Інституту ветеринарної медицини УААН; культур у клітин BHK21/clon 13 - люб’язно передана нам з Колекції культур клітин для ветеринарної медичини та біотехнології ННЦ "ІВЛВМ", м. Харків. Приклад 1. ЦПА вивчали шля хом паралельного зараження культури клітин СНЕВ і ВНК-21 референтними штамами ентеровірусів у дозі 100 ТЦД50/см 3. Щодоби проводили облік результатів дослідження, результати якого наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Цитопатична активність референтних штамів ЕВС у культурах клітин [СНЕВ і ВНК-21 № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Штам Серотип Тальфан Т80 F34 F78 F12 F7 V-13 "Перечинсь кий-642" "Березнянсь кий 652" М2323 К9 К22 Л 90 М 116 4 73 Г 95 Б 111 Ч 184 Д229 И 249 П142 В 151 И 393 1 2 3 4 5 6 8 Походжен- Культура Термін прояву ЦПД, Культура Термін прояву ЦПД, год год клітин ня клітин 24 48 72 96 24 48 72 96 120 Pirbright СНЕВ + ++ # ВНК + ++ # Pirbright СНЕВ + +++ # ВНК + ++ # Pirbright СНЕВ + ++ # ВНК + +++ # Pirbright СНЕВ + ++ # ВНК + ++ # Pirbright СНЕВ + ++ # ВНК + ++ # Pirbright СНЕВ + ++ # ВНК + ++ # Pirbright СНЕВ + ++ +++ # ВНК + ++ # 1 Україна СНЕВ + ++ # ВНК + ++ # 1 Україна СНЕВ + ++ # ВНК + ++ +++ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна Україна СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ + + + + + + + + ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ +++ + + + + +++ # +++ ++ # +++ # # # ++ +++ + +++ ++ ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК ВНК + + + + + + + +++ + + + ++ ++ +++ +++ ++ + + + + ++ # +++ ++ +++ # # # # # ++ +++ ++ +++ +++ # # # # # # # # Примітка: „+, ++, +++, #” - результат позитивний; „-”результат негативний # # # # # # # # # 5 38364 Згідно даних таблиці 1 є деяка відмінність щодо терміну прояву ЦПД ентеровірусів у культурах клітин СНЕВ і ВНК-21, проте вона є незначною. Це можна пояснити тим, що колекційні штами ЕВС десятиліттями підтримуються у культурі клітин СНЕВ, до того ж ВНК-21 є гетерологічною відносно ЕВС культурою клітин. Приклад 2. 6 Проводили вивчення цитопатичної активності ентеровірусів свиней паралельно у к ультура х клітин СНЕВ і ВНК-21/сlоn 13 на прикладі їх польових ізолятів – проб головного мозку та ректальних змивів поросят, що відібрані від хворих та загиблих тварин з діагнозом хвороби Тешена. Результати досліду зведено до таблиці 2. Таблиця 2 Цитопатична активність польових ізолятів ЕВС у культурах клітин СНЕВ і ВНК-21 № п/п Номер проби 1 8 2 28 3 29 4 30 5 33 6 38 7 39 8 40 9 43 10 44 11 45 Культура клітин СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ СУЯВ СНЕВ СНЕВ СНЕВ 24 Термін прояву ЦПД, год 4872 96 120 + ++ # + ++ # + # + ++ # + ++ # + ++ # + ++ # + ++ + ++ # + ++ +++ # + ++ # Культура клітин ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 ВНК-21 24 Термін прояву ЦПД,год 48 72 96 120 + +++ # + ++ # + +++ # + ++ # + ++ # + ++ +++ # + +++ # + ++ # + ++ +++ # + +++ # + ++ # Примітка: „+, +++, #” - результат позитивний; „-” - результат негативний Цитопатична дія, згідно таблиці 2, була специфічною для ентеровірусів свиней. Ніякої суттєвої різниці щодо морфології клітин культур СНЕВ і ВНК-21, термінів прояву ЦПД не відмічали. Приклад 3. Паралельно у культурі клітин СНЕВ і ВНК-21 проводили кількісне визначення ЕВС в одиниці об’єму вірусовмісного матеріалу. Інфекційну активність референтних штамів та польових ізолятів ентеровірусів свиней визначали за методом Ріда і Менча (таблиця 3-4). 7 38364 8 Таблиця 3 Інфекційна активність референтних штамів ентеровірусів свиней (М±m, n = 6; Р