Спосіб культивування вищих базидіальних грибів роду coriolus

Реферат: Винахід належить до біотехнології та мікології, зокрема до способів культивування вищих базидіальних грибів, в тому числі грибів роду Coriolus. Спосіб полягає в тому, що базидіальні 3 гриби роду Coriolus культивують на поживному середовищі оптимізованого складу, г/дм : глюкоза 20,0-25,0; пептон 3,0-5,0; К2НРО4 1,0; КН2РО4 1,0; MgSO4 0,15-0,25; дріжджовий 3 3 3 3 екстракт 3,0; пивне сусло 20 см /дм ; відвар дубової кори 5 см /дм , рН 4,0-6,0 при температурі 28-30 °C, а посівний матеріал базидіальних грибів пересівають на 72-96 годин (3-4 добу), в період максимальної антиокислювальної активності та ферментативної активності, що зумовлює фізіологічну активність посівного міцелію і відповідно підвищує подальшу продуктивність посівного матеріалу. UA 101751 C2 (12) UA 101751 C2 UA 101751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Винахід належить до біотехнології та мікології, зокрема до способів культивування вищих базидіальних грибів, в тому числі грибів роду Coriolus. Біотехнологічне застосування вищих базидіальних грибів роду Coriolus поєднує в собі поряд з традиційним використанням плодових тіл для отримання харчових добавок з лікувальнопрофілактичними властивостями і широко впроваджуване культивування міцелію та використання культурального фільтрату. Біологічно активні речовини отримують екстракцією з вегетативного міцелію або ж осадженням з культурального фільтрату. Так, наприклад, культуральна рідина та міцеліальна біомаса є хорошими джерелами внутрішньо- та позаклітинних ферментів, а також фізіологічно активних екзо- та ендополісахаридів. Дереворуйнівні гриби роду Coriolus не вимогливі до складу поживних середовищ і характеризуються високою швидкістю росту, зокрема в глибинній культурі, що робить їх перспективними як штами-продуценти в промисловій біотехнології, а також дозволяє використовувати як поживні середовища відходи промисловості та сільського господарства, такі, наприклад, як мелясу (нехарчовий відхід переробки буряку), молочну сироватку (відхід молочної промисловості), екстракт з виноградних вичавок (вторинний матеріальний ресурс виноробної галузі). В цьому плані велике значення мають дослідження, спрямовані на оптимізацію умов культивування, в тому числі якісного та кількісного складу поживного середовища. Оптимізація окремих факторів культивування та компонентів поживних середовищ може значно покращити показники росту та біохімічного складу міцелію. В ході попередніх досліджень для визначення особливостей росту та біосинтетичної активності вищих базидіоміцетів роду Coriolus були використані різні поживні середовища: природні, комплексні, синтетичні. Результати дослідів показали, що при вирощуванні на глюкозо-пептонному середовищі ймовірність зараження сторонньою мікрофлорою значно нижча, ніж на інших досліджуваних середовищах. Завдяки своєму постійному складу дане середовище є більш економічно вигідним та є сприятливим для росту відібраних штамів. Приймаючи це до уваги, необхідно було підібрати оптимальний склад комплексного глюкозопептонного середовища, який дійсно б забезпечував максимальний приріст біомаси відібраних культур. Відомі способи культивування базидіоміцетів UA 31887 А, 15.12.2000, який передбачає внесення в рідке або тверде вуглеводне середовище поживних речовин, посівного матеріалу та стимулятора біосинтезу. Як стимулятор біосинтезу використовують головну фракцію етилового спирту, котру задають одночасно з посівним матеріалом в кількості 0,04-0,05 % від водної фази середовища. Недоліком цього способу є те, що внесення фракції етилового спирту під час автоклавування призводить до втрати її індуктивних властивостей, а внесення одночасно з посівним матеріалом може призводити до контамінації поживного середовища. Найбільш близьким аналогом до запропонованого технічного рішення є спосіб (SU 1090261, 30.04.1984) отримання біомаси базидіоміцетів шляхом культивування міцелію у поживному середовищі у присутності джерела вуглецю при аеробних глибинних умовах, підвищення виходу відбувається за рахунок попередньої гомогенізації міцелію. Недоліком цього способу є недостатньо високий вихід біомаси та затрати ресурсів та часу на попередню гомогенізацію. Задачею винаходу є створення способу культивування вищих базидіальних грибів роду Coriolus для підвищення рівня виходу біомаси під час глибинного культивування міцелію на оптимізованих поживних середовищах. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб культивування вищих базидіальних грибів роду Coriolus передбачає приготування рідкого поживного середовища, яке містить джерело вуглецю та дріжджовий екстракт, і внесення до поживного середовища посівного матеріалу. Новим є те, що поживне середовище додатково містить пептон, мінеральні солі, пивне сусло та 3 відвар дубової кори при наступному співвідношенні компонентів (г/дм ): глюкоза 20,0-25,0 пептон 3,0-5,0 К2НРО4 1,0 КН2РО4 1,0 MgSO4 0,15-0,25 дріжджовий екстракт 3,0 пивне сусло, 8° за Баллінгом, 3 3 см /дм 20 3 3 відвар дубової кори, см /дм 5 1 UA 101751 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 а посівний матеріал базидіальних грибів пересівають на 72-96 годин (3-4 добу), в період максимальної антиокислювальної активності, що зумовлює фізіологічну активність посівного міцелію і відповідно підвищує подальшу продуктивність посівного матеріалу. За винаходом можна використовувати гриби роду Coriolus видів C.versicolor, C.zonatus, C.hirsutus, C.villosus. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Внесення до поживного середовища таких речовин як пептон, К2НРО4, КН2РО4, MgSO4, пивне сусло, відвар дубової кори призводить до створення збалансованого поживного середовища для культивування грибів роду Coriolus. Оптимізація середовища призводить до збільшення виходу біомаси базидіальних грибів з одиниці об'єму поживного середовища. Підвищення росту міцелію на середовищі з додаванням відвару дубової кори можна пояснити наступним чином. Оскільки відвар дубової кори містить стимулятори екстрацелюлярних фенолоксидаз (наприклад, галову кислоту), то за допомогою цих ферментів базидіальні гриби можуть засвоювати, окрім основного джерела вуглецю, ще й речовини фенольної природи, що присутні у відварі дубової кори. Поєднання у складі поживного середовища двох фосфорних солей К 2НРО4 і КН2РО4 є більш вдалим, дозволяє створювати певну буферність і дещо збільшити масову частку калію, який потрібен базидіальним грибам видів C.versicolor, C.zonatus, C.hirsutus, C.villosus. З метою скорочення тривалості біотехнологічного процесу отримання біомаси зменшується тривалість лаг-фази (фаза адаптації грибної культури до компонентів середовища) завдяки використанню одного і того ж джерела вуглецю (глюкози) в поживному середовищі для одержання посівного матеріалу і основного культивування, та отриманні посівного матеріалу в результаті послідовних пасажів тривалістю 5 діб, 3 доби, 4 доби, що допомагає грибним культурам пристосуватись до компонентів даного середовища. Експериментально доведено, що оптимізація виходу біомаси базидіальних грибів в даному способі досягається за рахунок внесення до поживного середовища додаткових джерел вуглецевого та мінерального живлення та застосування посівного матеріалу, отриманого в результаті послідовних пересівів тривалістю 5 діб, 3 доби, 4 доби, що допомагає грибним культурам пристосуватись до компонентів даного середовища. До того ж, застосування принципу пересівів посівного матеріалу на 72-96 годин (3-4 добу), в період максимальної активності гідролітичних ферментів (карбоксиметилцелюлази і ендо-1,4-β-глюканази), підвищує здатність культури розщеплювати основні джерела живленню, Використання запропонованого способу дає змогу підвищити майже у 1,4 разу кількість біомаси базидіальних грибів роду Coriolus. Спосіб здійснюється наступним чином. Посівний матеріал отримують у глибинних умовах на оптимізованих середовищах у колбах 3 Ерленмейєра місткістю 250 см у 3-х повторах. Базидіальні гриби видів C.versicolor, C.zonatus, 3 C.hirsutus, C.villosus вирощують на середовищі такого складу (г/дм ): дріжджовий екстракт - 3,0, пептон - 3,0-5,0 (в залежності від виду гриба), К2НРО4 - 1,0, КН2РО4 - 1,0, MgSO4 - 0,15-0,25 (в 3 3 залежності від виду гриба). У середовище додатково вносять 20 см /дм пивного сусла і 5 3 3 см /дм відвару дубової кори. Як джерело вуглецю та енергії використовують глюкозу 20-25 3 3 см /дм . Отримання посівного складається з трьох послідовних етапів. Культивування під час цих етапів здійснюють на качалці (120 об/хв.) при 28-30 °С (в залежності від виду гриба). рН вихідного середовища встановлюється за допомогою 0,1 N НСl на рівні 4,0-6,0 в залежності від 3 виду гриба. Всі три етапи отримання посівного матеріалу здійснюють в колбах об'ємом 250 см з 3 50 см середовища упродовж 5, 3 та 4 діб відповідно. Кількість грибної культури, що вноситься для засіву середовища, на кожному етапі складає 5-10 % від об'єму середовища. Посівний матеріал базидіальних грибів видів C.versicolor, C.zonatus, C.hirsutus, C.villosus в період 3-4 доби (72-96 година) характеризується високою целюлазною активністю (карбоксиметилцелюлази і ендо-1,4-β-глюканази, таблиця 1) та високою антиокислювальною активністю (таблиця 2), що підвищує здатність культури розщеплювати основні джерела живлення. Вищі базидіальні гриби роду Coriolus продукують численну кількість біологічно активних сполук серед яких ферменти целюлозного комплексу: карбоксиметилцелюлаза, ендо-1,4-βглюканаза. 2 UA 101751 C2 Таблиця 1 Ферментативна активність базидіальних грибів в динаміці на оптимізованому середовищі Види 24 C.versicolor C.zonatus C.hirsutus С.villosus С.versicolor C.zonatus C.hirsutus С.villosus 5 10 15 2,0 1,1 7,0 0 зо, 43, 34, 0 Час культивування, години 48 60 72 84 96 108 120 132 3 карбоксиметилцелюлазна активність (мкмоль/см ×хв) 5,4 7,7 5,1 6,0 10,8 8,8 3,2 2,2 0 4,3 7,6 8,5 11,8 7,2 6,5 1,2 0 0 2,0 0 15,3 18,0 14,7 8,5 2,0 0 0 0 6,3 9,8 16,5 12,8 4,0 0,8 1,0 0 -2 3 ендо-1,4-β-глюканазна активність (А×10 мкмоль/см ×хв) 72,0 58,0 56,0 81,8 100 69,3 40,7 10,0 0 32,0 34,1 67,0 92,9 108 76,0 52,0 41,0 16,0 61,0 40,7 71,5 114 80,2 47,3 50,7 48,6 31,6 3,3 14,6 14,6 64,3 92,0 84,0 20,6 0 0 36 144 2,3 0 0 0 0 0 48,0 3,0 Ксилотрофні гриби білої гнилі, до яких належать вищі базидіальні гриби роду Coriolus, можуть бути джерелом речовин-біоантиокисників, оскільки ці гриби мають підвищений антиоксидантний статус внаслідок біохімічної адаптації до окислювального стресу в процесі деструкції лігніну. Антиокислювальну активність (АОА) мають зокрема низькомолекулярні речовини фенольної природи. Ці речовини можуть міститись як в грибному міцелії, так і в культуральній рідині, таким чином, і міцелій, і культуральна рідина можуть проявляти АОА. Стосовно досліджуваних нами грибів роду Coriolus у фаховій літературі зустрічається фрагментарна інформація щодо дослідження АОА спиртових екстрактів міцелію, зокрема базидіального гриба C.hirsutus, а культуральна рідина майже не досліджувалась. Культивування базидіальних грибів видів C.versicolor, C.zonatus, C.hirsutus, C.villosus 3 здійснюють в глибинних умовах в ферментері об'ємом 2 дм при швидкості перемішування 1203 3 180 об/хв., аерації 0,5-1,0 дм /дм /хв. при температурі 28-30 °С (в залежності від виду гриба) упродовж 150 годин. Значення рН підтримують підтитровкою культуральної рідини 10 % розчином КОН або 0,1 N розчином HCl. Кількість посівного становить 10 % від об'єму середовища в ферментері. Таблиця 2 Антиокислювальна активність біомаси та культуральної рідини базидіальних грибів на 96 годину культивування (4 доба) на оптимізованому середовищі Вид біомаса культуральна рідина 20 25 30 C.versicolor C.zonatus C.hirsutus -3 3 3 Антиокислювальна активність А×10 дм /(см ×хв.) 4 доби (96 годин) 4,1±0,2 2,8±0,2 2,4±0,2 4,8±0,3 3,7±0,3 1,4±0,1 C.villosus 2,7±0,2 4,3±0,3 Приклад 1. Базидіальні гриби виду C.versicolor вирощують на середовищі такого складу 3 (г/дм ): глюкоза - 20, дріжджовий екстракт 3,0, пептон - 3,0, К2НРО4 - 1,0, КН2РО4 - 1,0, MgSO4 3 3 3 3 0,25, пивне сусло - 20 см /дм , відвар дубової кори 5 см /дм , рН 5,0. Культивування здійснюють 3 3 3 в ферментері об'ємом 2 дм при швидкості перемішування 180 об/хв., аерації 1,0 дм /дм /хв при температурі 30 °С упродовж 150 годин. Значення рН підтримують на рівні 5,0 підтитровкою культуральної рідини 10 % розчином КОН. Посівний матеріал отримують на середовищі наведеного вище складу в результаті трьох послідовних пересівів. Приклад 2. Базидіальні гриби виду C.zonatus вирощують на середовищі такого складу 3 (г/дм ): глюкоза - 25, дріжджовий екстракт 3,0, пептон - 3,0, К2НРО4 - 1,0, КН2РО4 - 1,0, MgSO4 3 3 3 3 0,15, пивне сусло - 20 см /дм , відвар дубової кори - 5 см /дм , рН 6,0. Культивування 3 здійснюють в ферментері об'ємом 2 дм при швидкості перемішування 120 об/хв., аерації 0,5 3 3 дм /дм /хв, при температурі 30 °С упродовж 150 годин. Значення рН підтримують на рівні 6,0 3 UA 101751 C2 5 10 15 підтитровкою культуральної рідини 10 % розчином КОН. Посівний матеріал отримують на середовищі такого ж складу в результаті трьох послідовних пересівів. Приклад 3. Базидіальні гриби виду C.hirsutus вирощують на середовищі такого складу 3 (г/дм ): глюкоза - 25, дріжджовий екстракт 3,0, пептон - 5,0, K2HPO4 - 1,0, КН2РО4 - 1,0, MgSO4 3 3 3 3 0,25, пивне сусло - 20 см /дм , відвар дубової кори - 5 см /дм , рН 4,0. Культивування 3 здійснюють в ферментері об'ємом 2 дм при швидкості перемішування 180 об/хв., аерації 1,0 3 3 дм /дм /хв при температурі 30 °С упродовж 150 годин. Значення рН підтримують на рівні 4,0 підтитровкою культуральної рідини 10 % розчином КОН. Посівний матеріал отримують на середовищі такого ж складу в результаті трьох послідовних пересівів. Приклад 4. Базидіальні гриби виду C.villosus вирощують на середовищі такого складу 3 (г/дм ): глюкоза - 20, дріжджовий екстракт 3,0, пептон - 3,0, К2НРО4 - 1,0, КН2РО4 - 1,0, MgSO4 3 3 3 3 0,25, пивне сусло - 20 см /дм , відвар дубової кори - 5 см /дм , рН 5,5. Культивування 3 здійснюють в ферментері об'ємом 2 дм при швидкості перемішування 120 об/хв., аерації 0,5 3 3 дм /дм /хв. при температурі 28 °С упродовж 150 годин. Значення рН підтримують на рівні 5,5 підтитровкою культуральної рідини 10 % розчином КОН. Посівний матеріал отримують на середовищі такого ж складу в результаті трьох послідовних пересівів. У таблиці 3 наведено порівняльні дані по виходу біомаси при застосуванні оптимізованого та неоптимізованого поживного середовища. Таблиця 3 Порівняльні дані по виходу біомаси при застосуванні оптимізованого та неоптимізованого поживного середовища 3 Види базидіальних грибів Coriolus versicolor Coriolus zonatus Coriolus hirsutus Coriolus villosus Вихід міцелію після 150 годин культивування, г/дм культурального середовища Запропонований спосіб Найближчий аналог 19,0 12,3-12,8 16,3 15,5 12,8 14,0 20 Таким чином, використання нового способу дає змогу підвищити майже у 1,4 разу вихід біомаси базидіальних грибів роду Coriolus та прискорити процес його нарощування, що відповідно сприяє виходу біологічно активних препаратів на основі міцелію даних грибів. 25 30 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб культивування вищих базидіальних грибів роду Coriolus, який передбачає приготування рідкого поживного середовища, яке містить джерело вуглецю та дріжджовий екстракт, і внесення до поживного середовища посівного матеріалу, який відрізняється тим, що в поживне середовище як джерело вуглецю вводять глюкозу та додатково вводять пептон, мінеральні солі, пивне сусло та відвар дубової кори при наступному співвідношенні компонентів 3 (г/дм ): глюкоза 20,0-25,0 пептон 3,0-5,0 К2НРО4 1,0 КН2РО4 1,0 MgSO4 0,15-0,25 дріжджовий екстракт 3,0 пивне сусло, 8° за Баллінгом, 20 3 3 см /дм 3 3 відвар дубової кори, см /дм 5, а посівний матеріал базидіальних грибів пересівають на 72-96 годин (3-4 добу). 2. Спосіб культивування за пп. 1, який відрізняється тим, що отримання посівного матеріалу передбачає виконання послідовних пересівів. 4 UA 101751 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5