Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів pichia stipitis з поліпшеною алкогольною ферментацією ксилози

Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів PICHIA 3 48112 У запропонованому способі використовуються методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia coli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. coli методом електропорації, описані в [4]. Трансформацію P. stipitis проводять, як описано в [5]. Виділення сумарної ДНК з трансформантів P. stipitis проводиться як для S. cerevisiae [6]. Спосіб одержання етанолу за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів Pichia stipitis з поліпшеною алкогольною ферментацією ксилози ілюструється графічними матеріалами: На Фіг.1 зображено амінокислотні послідовності ХYL1генів дріжджів, які утилізують ксилозу, де Pst - Pichia stipitis, Ctn - Candida tenuis, Hp – Hansenula polymorpha. Стрілками показані сайти консервативного домену ксилозоредуктази, які було вибрано для сайт-специфічного мутагенезу. На Фіг.2. зображено лінійну схему плазміди p19L2+prGAPDH+XYL1modPs, де фрагмент, що містить модифікований ген XYL1 P. stipitis, позначено чорною стрілкою з зірочками; фрагмент, що містить промотор GAPDH P. stipitis, позначено білою смугою; фрагмент, що містить ген LEU2 Saccharomyces cerevisiae, позначено сірою смугою; тонкою чорною лінією позначено бактерійну частину вектора. Сайти рестрикції позначено: Н, HindIII; Sp, Sphl; К, Kpnl; RI, ЕсоRI SI, Sall; В, ВatHI; Sm, Smal; Sc, Sacl. На Фіг.3. зображено послідовності нуклеотидів гену XYL1 P. stipitis: XYL1nat - послідовність нативного гену, XYL1mod - послідовність модифікова 4 ного за допомогою сайт-специфічного мутагенезу гену. Замінені нуклеотиди виділено. На Фіг.4. зображено синтез етанолу штамами P. stipitis протягом ферментації в середовищі YNB з 9% ксилозою, де штам PLU20 - контроль; XYL1m2, XYL1m5, XYL1m9, XYL1m10 - трансформанти PLU20, які містять модифікований ген XYL1 P. stipitis під контролем промотора GAPDH. Ферментацію проводили протягом 7 днів при температурі 28 С в умовах обмеженої аерації (105об/хв.). Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів P. stipitis з поліпшеною алкогольною ферментацією ксилози здійснюють кількома етапами: Етап 1. Сайт-специфічний мутагенез гену XYL1 P. stipitis Порівнявши амінокислотні послідовності генів XYL1 дріжджів, які утилізують ксилозу (Фіг.1), вибирають 2 амінокислотні залишки, які відповідають за спорідненість до кофакторів у XYL1 P. stipitis (Lys-271 і Asn-273). Заміна відповідних амінокислотних залишків (Lys на Arg; Asn на Asp) у вибраному білковому домені (Фіг.1) у С. tenuis збільшує специфічність ксилозоредуктази до NADH [7]. Відповідну стратегію застосовують для модифікації гену XYL1 P. stipitis. З цією метою було синтезують праймери для одержання двох фрагментів XYL1 P. stipitis, які містять дві нуклеотидні заміни (IS311, IS312) (Табл.) і праймери для об'єднання промотора GAPDH P. stipitis з модифікованим геном XYL1 (IS62, IS313) (Табл.). Таблиця Перелік праймерів, які використовують на 1 та 2 етапах способу Назва праймера IS62 IS310 IS311 IS312 IS313 IS314 Послідовність нуклеотидів 5'-TATGGATCCGCAACTGGATGAGGTGCTATC-3' 5'- CAACTTAATAGAAGGCATGATGAATTGTTTATAGGGAAG -3' 5'- CAACAATCTTGGGACAGTGTCGGACCTTGGAATGATGGCAATGC -3' 5'- GCATTGCCАТСАТТССAAGGTCCGACACTGTCCCAAGATTGTTG-3' 5'- TACGGATCCTCTCATTTGATTCCTTGGCAGACATG -3' 5'- ATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGGTTACGACATGCC -3' На першій стадії геномну ДНК Р. stipitis CBS6054 використовують як матрицю для ампліфікації фрагментів за допомогою ПЛР: промотор GAPDH (праймери IS62/IS310), фрагментах/ (праймери IS311/IS314), фрагментXYL1 (праймери IS312/IS313). На другій стадії об'єднують три фрагменти ДНК, отримані на першій стадії. У цьому випадку для ПЛР використовують праймери IS62 і IS313, як матрицю використовують фрагменти: промотор GAPDH (праймери IS62/IS310), фрагмент XYL1 (праймери IS311/IS314), фрагмент XYL1 (праймери IS312/IS313). Етап 2. Конструювання плазміди, що містить модифікований ген XYL1 Р. stipitis під промотором GAPDH Отриманий на першому етапі фрагмент, який містить модифікований ген XYL1 під промотором GAPDH обробляють рестриктазою ВаmHI і клону ють на плазмідний вектор p19L2 [8]. Сконструйовану плазміду позначено p19L2+prGAPDH+XYL1modPs (Фіг.2). За допомогою секвенування на фірмі "Eurofins MWG Operon " (Німеччина) було підтверджено коректну заміну нуклеотидів гену XYL1 на плазмідному векторі p19L2+prGAPDH+XYL1modPs (Фіг.3). Для секвенування використовували праймери до renyXYL1: IS314 і IS313 (див.табл.). Етап 3. Конструювання рекомбінантних штамів P. stipitis Плазмідою p19L2+prGAPDH+XYL1modPs, попередньо лінеаризованою рестриктазою Sad, трансформують реципієнтний штам P. stipitis PLU20 (leu2, ura3). Трансформацію проводять хімічним методом [8], селекцію Leu+-трансформантів проводять на мінімальному середовищі YNB з 2% глюкозою та урацилом. Серед низки трансформа 5 48112 + нтів відбирають стабільні Leu -інтегранти. Стабільність перевіряють шляхом інкубації трансформантів на неселективному середовищі YPD (ріст протягом 60 генерацій) з наступним перенесенням на селективне середовище YNB з 2% глюкозою та урацилом. Трансформанти, які залишаються прототрофами за лейциновим маркером є стабільними. Наявність в геномі трансформантів рекомбінантної конструкції промотор GAPDH-XYL1 Р. stipitis перевіряють за допомогою ПЛР з використанням відповідної пари праймерів (IS62 та IS313) (див. табл.1). Інтегранти, що містять цю рекомбінантну конструкцію, відбирають для перевірки алкогольної ферментації ксилози. Трансформанти вирощують протягом 7 діб у середовищі YNB з 9% ксилозою в умовах обмеженої аерації (105об/хв., 28 С). Частина відібраних рекомбінантних штамів (XYL1m2, XYL1m5, XYL1m9, XYL1m10) мають підвищений рівень синтезу етанолу у порівнянні з вихідним штамом P. stipitis PLU20 (Фіг.4). Отримані рекомбінантні штами синтезують від 1,1 до 1,4 6 рази більше етанолу з ксилози на 4 день ферментації . Джерела інформації 1. Farrell A.E. et al. // Science. - 2006. - Vol. 311(5760). - P. 506-508. 2. Toivola A. et al., // Appl. Environ. Microbiol.1984. - Vol.47, N6. -P.1221-1223. 3. Nigam J.N. // J. Biotechnol. - 2001. - Vol.87, N1. - P. 17-27. 4. Sambrook J., Fritsh E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 5. Passoth V., Hahn-Hagerdal B. // Enzyme and Microbial Technologies. -2000.-Vol.26.-P.781-784. 6. Wach A., Pick H., Philipsen P. In: Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach (Johnston, J.R., Ed.), IRL Press, Oxford. - 1994. - P. 1-16. 7. Petschacher, B. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol.71, N10. -P. 6390-6393. 8. Voronovsky A. et al. // FEMS Yeast Res. 2002. - Vol.2, N3. - P.381-388. 7 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 48112 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601