Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів pichia stipitis з поліпшеною алкогольною ферментацією ксилози

Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів Pichia stipitis, який відрізняється тим, що ферментацію ксилози здійснюють рекомбінантними штамами дріжджів P. stipitis, в геном яких вводять модифікований ген ксилозоредектази (XYL1), який має дві точкові мутації, що призводять до заміни амінокислотних залишків у положенях Lys-271 на Arg і Asn-273 на Asp, під контролем сильного конститутивного промотора гену GAPDH (гліцеральдегід-3фосфат дегідрогенази). UA (21) a200908355 (22) 07.08.2009 (24) 11.04.2011 (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) ІЩУК ОЛЕНА ПЕТРІВНА, ФЕДОРОВИЧ ДАРІЯ ВАСИЛІВНА, СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ (56) UA C2 48125, 15.08.2002. Passoth V., Hahn-Hagerdal B.:"Production of a heterologous endo- 1, 4-beta-xylanase in the yeast Pichia stipitis with an O2-regulated promoter" Enzyme and Microbial Thechnologies. -2000.-Vol.26.-P.781784. Hahn-Hagerdal B. et. al.: "Towards industrial pentosefermenting yeast strains" Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007.- Vol.74, N5.-P. 937-953. Farrell A.E. et al. :"Ethanol Can Contribute to Energy and Environmental Goals" Science. -2006. Vol.311 (5760). -P. 506-508. Petschacher, B. et al. :"Engineering Candida tenuis Xylose Reductase for Improved Utilization of NADH: Antagonistic Effects of Multiple Side Chain Replacements and Performance of Site-Directed C2 2 (19) 1 3 94147 На початкових етапах метаболізму ксилози у дріжджів ферменти ксилозоредуктаза (кодується геном XYL1) і ксилітолдегідрогеназа (кодується геном XYL2), - перетворюють D-ксилозу до Dксилулози. Ці ферменти мають різну специфічність до кофакторів: NAD(P)H і NAD+; клітини також нездатні забезпечити достатньої кількості NAD+ за умов обмеженої аерації, тому D-ксилоза неповністю перетворюється до D-ксилулози. Один із підходів подолання дисбалансу кофакторів, який виникає, полягає у застосуванні сайт-специфічного мутагенезу гена XYL1 для модифікації ксилозоредуктази з метою збільшення спорідненості даного ферменту до NADH або зниження спорідненості до NADPH. Найбільш близьким до запропонованого є спосіб одержання етанолу за допомогою дріжджів P. stipitis [3]. Вихід етанолу з ксилози штамами P. stipitis складає приблизно 0,35-0,44 г/г, що відповідає 80 % від максимального теоретичного виходу етанолу. Однак ця продуктивність ферментації ксилози до етилового спирту є недостатньою для налагодження промислового виробництва. У запропонованому способі використовуються методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia coli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. соlі методом електропорації, описані в [4]. Трансформацію P. stipitis проводять, як описано в [5]. Виділення сумарної ДНК з трансформантів P. stipitis проводиться як для S. cerevisiae [6]. Спосіб одержання етанолу за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів Pichia stipitis з поліпшеною алкогольною ферментацією ксилози ілюструється графічними матеріалами: На Фіг. 1 зображено амінокислотні послідовності XYL1генів дріжджів, які утилізують ксилозу, де Pst - Pichia stipitis, Ctn - Candida tenuis, Hp Hansenula polymorpha. Стрілками показані сайти консервативного домену ксилозоредуктази, які було вибрано для сайт-специфічного мутагенезу. На Фіг. 2. зображено лінійну схему плазміни pl9L2+prGAPDH+XYL1modPs, де фрагмент, що 4 містить модифікований ген XYL1 Р, stipitis, позначено чорною стрілкою з зірочками; фрагмент, що містить промотор GAPDH P. stipitis, позначено білою смугою; фрагмент, що містить ген LEU2 Saccharomyces cerevisiae, позначено сірою смугою; тонкою чорною лінією позначено бактерійну частину вектора. Сайти рестрикції позначено: Н, НindIII; Sp, SphI К, КрnI RI, ЕсоRI; Sl, SalI; В, ВаmHI; Sm, SmaI; Sc, SacI. На Фіг. 3. зображено послідовності нуклеотидів гена XYL1 P. stipitis: XYL1nat - послідовність нативного гена, XYL1mod - послідовність модифікованого за допомогою сайт-специфічного мутагенезу гена. Замінені нуклеотиди виділено. На Фіг. 4. зображено синтез етанолу штамами P. stipitis протягом ферментації в середовищі YNB з 9 % ксилозою, де штам PLU20 - контроль; XYL1m2, XYL1m5, XYL1m9, XYL1m10 - трансформанти PLU20, які містять модифікований ген XYL1 P. stipitis під контролем промотору GAPDH. Ферментацію проводили протягом 7 днів при температурі 28 °С в умовах обмеженої аерації (105 об/хв.). Спосіб одержання етанолу з ксилози за допомогою рекомбінантних штамів дріжджів P. stipitis з поліпшеною алкогольною ферментацією ксилози здійснюють кількома етапами: Етап 1. Сайт-специфічний мутагенез гена XYL1 P. stipitis Порівнявши амінокислотні послідовності генів XYL1 дріжджів, які утилізують ксилозу (Фіг. 1), вибирають 2 амінокислотні залишки, які відповідають за спорідненість до кофакторів у XYL1 P. stipitis (Lys-271 і Asn-273). Заміна відповідних амінокислотних залишків (Lys на Arg; Asn на Asp) у вибраному білковому домені (Фіг.1) у С. tenuis збільшує специфічність ксилозоредуктази до NADH [7]. Відповідну стратегію застосовують для модифікації гена XYL1 P. stipitis. З цією метою синтезують праймери для одержання двох фрагментів XYL1 P. stipitis, які містять дві нуклеотидні заміни (IS311, IS312) (Табл.) і праймери для об'єднання промотору GAPDH P. stipitis з модифікованим геном XYL1 (IS62, IS313) (Табл.). Таблиця Перелік праймерів, які використовують на 1 та 2 етапах способу Назва праймера Послідовність нуклеотидів IS62 5'-TATGGATCCGCAACTGGATGAGGTGCTATC-3' IS310 5'-CAACTTAATAGAAGGCATGATGAATTGTTTATAGGGAAG-3' IS311 5'-CAACAATCTTGGGACAGTGTCGGACCTTGGAATGATGGCAATGC-3' IS312 5'-GCATTGCCATCATTCCAAGGTCCGACACTGTCCCAAGATTGTTG-3' IS313 5'-TACGGATCCTCTCATTTGATTCCTTGGCAGACATG-3' IS314 5'-ATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCTGGTTACGACATGCC-3' 5 На першій стадії геномну ДНК Р. stipitis CBS6054 використовують як матрицю для ампліфікації фрагментів за допомогою ПЛР: промотор GAPDH (праймери IS62/IS310), фрагмент XYL1 (праймери IS311/IS314), фрагмент XYL1 (праймери IS312/IS313). На другій стадії об'єднують три фрагменти ДНК, отримані на першій стадії. У цьому випадку для ПЛР використовують праймери IS62 і IS313, як матрицю використовують фрагменти: промотор GAPDH (праймери IS62/IS310), фрагмент XYL1 (праймери IS311/IS314), фрагмент XYL1 (праймери IS312/IS313). Етап 2. Конструювання плазміди, що містить модифікований ген XYL1 Р. stipitis під промотором GAPDH. Отриманий на першому етапі фрагмент, який містить модифікований ген XYL1 під промотором GAPDH обробляють рестриктазою ВаmHI і клонують на плазмідний вектор р19L2 [8]. Сконструйовану плазміду позначено p19L2+prGAPDH+XYL1modPs (Фіг. 2). За допомогою секвенування на фірмі "Eurofins MWG Operon" (Німеччина) було підтверджено коректну заміну нуклеотидів гена XYL1 на плазмідному векторі pl9L2+prGAPDH+XYL1modPs (Фіг. 3). Для секвенування використовували праймери до гена XYL1: IS314 і IS313 (див. табл.). Етап 3. Конструювання рекомбінантних штамів P. Stipitis. Плазмідою pl9L2+prGAPDH+XYL1modPs, попередньо лінеаризованою рестриктазою Sacl, трансформують реципієнтний штам P. stipitis PLU20 (leu2, ura3). Трансформацію проводять хімічним методом [8], селекцію Leu+трансформантів проводять на мінімальному середовищі YNB з 2 % глюкозою та урацилом. Серед низки трансформантів відбирають стабільні + Leu -інтегранти. Стабільність перевіряють шляхом інкубації трансформантів на неселективному середовищі YPD (ріст протягом 60 генерацій) з 94147 6 наступним перенесенням на селективне середовище YNB з 2 % глюкозою та урацилом. Трансформанти, які залишаються прототрофами за лейциновим маркером є стабільними. Наявність в геномі трансформантів рекомбінантної конструкції промотор GAPDH-XYL1 Р. stipitis перевіряють за допомогою ПЛР з використанням відповідної пари праймерів (IS62 та IS313) (див. табл. 1). Інтегранти, що містять цю рекомбінантну конструкцію, відбирають для перевірки алкогольної ферментації ксилози. Трансформанти вирощують протягом 7 діб у середовищі YNB з 9 % ксилозою в умовах обмеженої аерації (105 об/хв., 28°С). Частина відібраних рекомбінантних штамів (XYL1m2, XYL1m5, XYL1m9, XYL1m10) мають підвищений рівень синтезу етанолу у порівнянні з вихідним штамом P. stipitis PLU20 (Фіг. 4). Отримані рекомбінантні штами синтезують від 1,1 до 1,4 рази більше етанолу з ксилози на 4 день ферментації. Джерела інформації 1. Farrell A.E. et al. // Science. - 2006. - Vol. 311(5760). - P. 506-508. 2. Nigam J.N. // J. Biotechnol. - 2001. - Vol.87, N1. - P.17-27. 3. Hahn-Hägerdal B. et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - Vol.74, N5.-P. 937-953. 4. Sambrook J., Fritsh E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 5. Passoth V., Hahn-Hagerdal B. // Enzyme and Microbial Thechnologies. - 2000.- Vol.26. - P.781784. 6. Wach A., Pick H., Philipsen P. In: Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach (Johnston, J.R., Ed.), IRL Press, Oxford. - 1994. - P. 1-16. 7. Petschacher, B. et al. // Appl Environ Microbiol. - 2005. - Vol.71, N10. - P.6390-6393. 8. Voronovsky A. et al. // FEMS Yeast Res. 2002. - Vol.2, N3. - P.381-388. 7 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 94147 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601