Спосіб створення фузаріозостійкого вихідного матеріалу огірка

Реферат: Спосіб створення стійких до фузаріозу вихідних селекційних форм огірка, що включає скринінг генотипів в культурі ізольованих тканин in vitro на поживному середовищі MS, модифікованому як селективний фон 40 % сумішшю фільтратів культуральної рідини (ФКР) 2-х видів грибів (F. oxysporum f. sp. cucumerinum та F. solani) у співвідношенні 2:1, яке відповідає природній їх участі у патогенезі цієї хвороби, добір генотипів, що перевищили за морфометричними параметрами еталонні зразки з високим рівнем стійкості до хвороби. Апікальні меристеми з стерильних проростків висаджують на індукційне поживне середовище з додаванням до нього селективного агента. Добір стійких до трахеомікозів генотипів у культурі in vitro проводять безпосередньо на диференційованому рослинному організмі через 28 діб культивування на селективному середовищі в умовах освітлення 2000 лк і за температури 23-25 °C. Оцінку рівня стійкості рослин-регенерантів на дію ФКР в культурі in vitro проводять шляхом визначення індексу резистентності (RI), вираженого у відсотках. Для подальшого селекційного використання як джерело стійкості розмножують зразки, які перевищили за індексом резистентності еталонні генотипи з визначеною високою польовою стійкістю до фузаріозного в'янення. UA 106769 U (54) СПОСІБ СТВОРЕННЯ ФУЗАРІОЗОСТІЙКОГО ВИХІДНОГО МАТЕРІАЛУ ОГІРКА UA 106769 U UA 106769 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології та сільського господарства і може бути використана у селекції овочевих рослин. У сучасних технологіях вирощування огірка важлива роль відводиться підвищенню екологічної безпеки систем захисту рослин від комплексу хвороб і шкідників. Екологізовані технології захисту мають особливо важливе значення при вирощуванні овочевої продукції захищеного ґрунту, значна частина якої вживається у свіжому вигляді і призначена для дієтичного та дитячого харчування. Нині найбільш ефективним способом захисту більшості сільськогосподарських культур від хвороб різної етіології визнано впровадження у виробництво сортів і гібридів із ознакою тривалої стійкості до найпоширеніших хвороб [1]. Високоефективним шляхом створення вихідного матеріалу, який відповідатиме таким вимогам, є клітинна селекція, методи якої полягають у доборі толерантних біотипів на штучних селективних середовищах, із подальшою регенерацією в умовах in vitro із відібраних експлантатів рослин-регенерантів, їх прискореного розмноження, первинної адаптації, з подальшим отриманням генеративного покоління. Такий підхід дозволяє суттєво скоротити строки селекції. Добір стійких/толерантних до стресів рослин-регенерантів в умовах in vitro має ряд переваг порівняно з добором у польових умовах: швидка і більш точна оцінка кількісних ознак полігенної стійкості; велика кількість проаналізованих генотипів за відносно короткий проміжок часу [2, 3]. В останні роки однією із найбільш шкідливих хвороб огірка в умовах захищеного ґрунту на Україні є кореневі гнилі, основними збудниками якого в умовах Лісостепової зони є некротрофні (токсиноутворюючі) патогени - гриби роду Fusarium Link. ((F. oxysporum f. sp. cucumerinum, F. culmorum, F. moniliforme, F. solani, F. gibbosum, F. solani). Поширеність цих хвороб в останні роки в зонах вирощування гарбузових овочевих культур складає 37-69 % і призводить до істотних втрат врожаю (30-50 %)[4]. Традиційним способом селекції на стійкість до фузаріозу є добір стійких рослин з гібридів та сортів в фазі першого справжнього листка на штучному інфекційному фоні [5], який створюють методами штучного зараження сіянців 15-денною живою культурою гриба Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) та шляхом внесення інокулюму гриба у субстрат для вирощування рослин. За даним методом проростки огірка розміром 0,5 см витримують у розчині суспензії гриба F. oxysporum f. sp. впродовж 30 хвилин. Після чого їх висівають в касети з тирсою, інфікованою суспензією гриба F. oxysporum f. sp, накривають плівкою і інкубують в умовах природного освітлення. На контрольному варіанті сіянці витримують у тирсі, змоченій дистильованою водою. Ступінь ураження кореневої системи сіянців фузаріозом визначають в фазі першого справжнього листа сіянців огірка за 4-бальною шкалою: 0 - ураження кореня відсутнє; 1 - слабе побуріння центрального корінця, яке проявляється у вигляді окремих дрібних плям; 2 побуріння всього центрального корінця; 3 - центральний корінець уражений повністю і значне побуріння бічних корінців; 4 - сіянець в'яне і гине. Даний спосіб показав високу ефективність, але він є трудомістким і тривалим. При оцінці генотипів за цим методом відбувається сильне механічне ушкодження корінців проростків огірка, що знижує точність оцінки на стійкість до даного патогену. Крім того, при подальшому перенесенні проростків з тирси в горщики з ґрунтосумішшю спостерігається низька приживлюваність розсади, а зведена характеристика рівня стійкості зразка при цьому отримується лише після 2-3 років досліджень. Також оцінку рівня стійкості огірків до фузаріозного в'янення можна здійснювати використовуючи експрес-оцінку зразків, яка базується на пророщувань насіння в розчині фільтрату культуральної рідини (ФКР) F. oxysporum f. sp. [6]. За даного способу насіння огірка пророщують на смужках фільтрувального паперу, який попередньо змочують в різних концентраціях ФКР. Вплив дії ФКР на розвиток проростків огірка проявляється в уповільненні швидкості проростання насіння, руйнування кореневої шийки, порушення геліотропізму, відсутність бічних коренів і кореневих волосків, пригнічення росту паростків. Ступінь ураження кореневої системи сіянців в фазі першого справжнього листка оцінюють за шкалою в балах: 0 - без ураження, 1 - незначне побуріння центрального корінця в вигляді окремих плям, 2 - побуріння всього центрального корінця, 3 - центральний корінець, уражений повністю, значне побуріння бічних корінців, 4 - в'янення і загибель рослини. В подальшій селекційній роботі використовують генотипи з балами ураження від 0 до 1. При використанні даного рулонного методу відбувається більш жорсткий добір стійких генотипів, за рахунок дії токсинів ФКР. Але недоліками цього способу є те, що для його здійснення потрібний значний об'єм інфекційного матеріалу. Крім того, прояв симптомів і повного розвитку хвороби відбувається впродовж тривалого періоду. Також існує ризик втрати цінних генотипів, сприйнятливих до фузаріозу, але тих, що мають інші цінні ознаки, тривалий термін проведення досліджень. 1 UA 106769 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Найбільш близьким аналогом є біотехнологічний спосіб створення стійких до альтернаріозу вихідних селекційних форм томата [7]. За даного способу для добору резистентного до некротрофних фітопатогенів селекційного матеріалу як селективні середовища застосовують фільтрати культуральної рідини збудників хвороб [4]. Спосіб-аналог полягає у наступному: 1. Насіння вихідних форм томата вводять у стерильну культуру та культивують на безгормональному середовищі для одержання проростків. 2. Як селективний агент добору використовують 40-відсотковий ФКР, отриманий шляхом культивування високовірулентних штамів гриба Alternaria solani Sorauer. на рідкому середовищі Чапека. 3. Клітинну селекцію проводять за наступною схемою. Сім'ядольні листки 7-10-денних проростків томата висаджують на селективне середовище MS, модифіковане фітогормонами (ІОцК та БАП) із додаванням до нього ФКР гриба (перший пасаж). Отримані органогенні експлантати культивують впродовж 1 місяця (другий пасаж) на безгормональному середовищі MS, після чого їх повторно висаджують на селективне середовище із додавання до нього ФКР (третій пасаж). 4. Дібрані в умовах in vitro та адаптовані до нестерильних умов рослини висаджують у плівкову теплицю в умови in vivo для подальшої інокуляції міцеліально-споровою суспензією A. solani, оцінки їх стійкості та проведення індивідуальних доборів насіння. Наведений спосіб (аналог) клітинної селекції томату на стійкість до ранньої сухої плямистості в культурі in vitro має наступні недоліки: цей спосіб потребує залучення у дослідження в культурі in vivo значного об'єму інфекційного матеріалу, ізольованої ділянки (теплиці) для контролю поширення інфекції, тривалого інкубаційного періоду від початку інокуляції рослини до появи на ній симптомів ураження (20-40 діб). Також оцінка рівня стійкості генотипів до A. solani відбувається на недиференційованих калюсах, які не мають розвинених спеціалізованих провідних тканин, тоді як гриби роду Fusarium насамперед ушкоджують судини рослин, в яких і утворюють декілька видів токсинів, які призводять до серйозних порушень в життєвому циклі рослин. В основу корисної моделі поставлена задача розширення арсеналу методів і засобів для прискорення процесу оцінки і добору в лабораторних умовах фузаріозостійкого вихідного селекційного матеріалу огірка, збільшення його ефективності за рахунок збереження та прискореного розмноження перспективного для селекції матеріалу. Поставлена задача вирішується тим, що добір в культурі in vitro стійких генотипів здійснюють з використанням як селективних агентів ФКР гриба, застосування якого є більш ефективним, ніж використання чистої культури гриба [8], так як при його використанні не відбувається зараження матеріалу фітопатогенами. Для проведення оцінки генотипів на стійкість до ФКР обов'язково залучають як еталон генотипи з визначеною високою польовою стійкістю до фузаріозного в'янення. Вся процедура з культивування рослинних об'єктів в культурі in vitro здійснюється за розробленою методикою [9], в умовах ламінарного боксу. Спосіб, що пропонується, здійснюють наступним чином: 1. Відібрані чисті колонії, з уражених кореневими гнилями рослин огірка, ідентифіковані найбільш поширеними видами грибів, збудників фузаріозного в'янення гарбузових рослин (F. oxysporum f. sp. cucumerinum та F. solani. %) вирощують окремо у півлітрових колбах на рідкому середовищі Чапека у термостаті за температури 20-22 °C впродовж 20 діб. Для отримання чистого ФКР утворені колонії грибів відділяють від культуральної рідини дворазовим фільтруванням. Отриманий чистий ФКР F. oxysporum f. sp. cucumerinum та F. solani. змішують у пропорції 2:1 та розводять дистильованою водою у співвідношенні 1:1. 2. Насіння селекційних зразків вводять у стерильну культуру шляхом послідовної стерилізації у 96 % етанолі (3 хвилини), надалі - у 30 % розчині гіпохлориду натрію А (20 хвилин), після чого його промивають не менше п'яти разів стерильною дистильованою водою у стерильних умовах (ламінарний бокс). 3. Простерилізовані насінини для ініціації їх проростання розміщують на твердому безгормональному поживному середовищі за прописом MS [10]. Культивування проводять за освітлення 2000 лк при температурі 23-25 °C. 4. Через 10 діб з стерильних проростків, які знаходяться у фазі першого справжнього листа, стерильним скальпелем видаляють апікальні меристеми з 2-4 парами премордіальних листків, які по одній розміщують на поверхні твердого селективного середовища MS, модифікованого регуляторами росту (IOцК і БАП). Як селективний агент для скринінгу рівня стійкості генотипів і добору стійких форм огірка до складу середовища додають 40 % суміші ФКР (див. п. 1). Дана концентрація є ефективною для проведення клітинної селекції, так як вона в рекогносцирувальному досліді забезпечувала зниження морфологічних параметрів 2 UA 106769 U 5 10 15 20 25 регенерантів не менше як на 50 % по відношенню до контролю. Контролем слугує базове поживне середовище без додавання до нього ФКР. Культивування меристематичних тканин проводять при 16-годинному фотоперіоді за температури +22…+24 °C при освітленні у 2000 люкс. 5. Оцінку рівня селективної дії ФКР на розвиток експлантатів в культурі in vitro проводять на 28 добу культивування. Вплив комплексу токсинів ФКР на ріст і розвиток апікальних меристем здійснюють шляхом визначення індексу резистентності - RI, який обраховують як відношення довжини пагона (або кореня) після 4 тижнів культивування на селективному середовищі до довжини пагона (кореня) на контрольному варіанті, виражене у відсотках. 6. Пробіркові рослини генотипів, які за показниками індексу резистентності кореневої системи і пагона знаходяться на рівні або перевищують за цими показниками еталонні генотипи, з визначеною високою польовою стійкістю до фузаріозного в'янення, вважають перспективними джерелами стійкості і їх додатково розмножують методами in vitro на безгормональному середовищі MS. 7. Розмножені пробіркові клони адаптують до нестерильних умов за розробленим способом [10] і висаджують для подальшого культивування в умови захищеного ґрунту, де вирощують за загальноприйнятою для культури огірка технологією. Надалі селекційну оцінку рівня прояву ознак проводять згідно з “Методикою проведення експертизи сортів на відмітність, однорідність і стабільність (ВОС)” [11]. Результати досліджень свідчать про те, що при запропонованому способі культивування апікальних меристем на селективному середовищі з 40 % ФКР відбувається диференціація зразків за чутливістю до селективного середовища, що дозволяє шляхом цілеспрямованого індивідуального добору проводити селекцію стійких генотипів в культурі in vitro. В таблиці 1 наведено дані щодо реакції генотипів різного походження на селективне середовище. В результаті досліджень виділено фузаріозостійкі генотипи Pioner F 1, F1 (F5I5Голубчик x F1I3 Кузнечик), F1 (F1I4 Маринда х F3I4Кузнечик), ΑΧ 0339 F1, які за індексом резистентності (RI) були на рівні, а деякі перевищували еталонні зразки. Таблиця 1 Вплив селективного середовища з 40 % ФКР грибів роду Fusarium на морфометричні параметри пробіркових рослин огірка через 28 діб культивування № п.п Генотип, походження Середовище MS (контроль, без ФКР) Довжина Довжина пагона кореня, мм, мм, Селективне середовище MS (40 % ФКР) Довжина пагона Довжина кореня мм, мм, X  Sx 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 CU-SAT-20 F1, Італія Accent F1, Італія New mona F1, Італія Pioner F1, Італія Надія F1 F5I1 Кузнечик F1 (F9I6№ 11 х F5I5 Голубчик) F1 (F8l6 Маринда x F8I6№ 11) F1 (F6l4 Голубчик х F8I6 № 11) F1 (F5I5 Голубчик х F1І3 Кузнечик) F1 (F5I5 Голубчик х Ρ8І4 Fancipak) F1 (F9l6 Anuschka х F9I6№ 11) F1 (F5I4 Кузнечик х F6І4 Голубчик) X  Sx X  Sx 65.01±6,8 61,2±2,9 66,2±4,9 66,7±1,2 61,3±2,5 49,2±1,7 54,7±1,2 86,0±6,4 76,8±5,9 59,7±3,6 61,5±0,8 64,6±1,8 19,3±1,2 38,6±2,8 24,5±1,8 40,2±2,7 26,5±3,6 22,2±1,1 RI, % 29,7 63,0 37,0 58,8 43,2 45,1 66,8±2,3 76,2±1,1 25,2±2,2 37.7 35,6±5,9 46,7 79,6±2,6 68,3±2,7 38,3±0,6 48,1 44,5±4,9 65,2 82,0±4,3 74,7±2,8 42,7±6,2 52,0 50,3±3,1 67,3 83,3±3,4 82,3±3,8 59,5±8,2 71,4 71,0±6,5 86,3 50,8±4,8 68,6±2,0 27,2±1,7 53,5 31,4±4,3 45,7 62,4±3,5 73,7±4,2 23,5±1,4 37,7 31,5±3,6 42,7 67,2±4,7 72,3±1,5 27,1±3,2 40,3 41,9±3,9 57,9 3 28,1±6,0 48,8±2,6 46,0±8,5 39,0±6,7 36,0±4,6 40,8±3,8 RI, % 43,2 56,7 59,9 65,3 58,5 63,2 X  Sx UA 106769 U Таблиця 1 Вплив селективного середовища з 40 % ФКР грибів роду Fusarium на морфометричні параметри пробіркових рослин огірка через 28 діб культивування № п.п Генотип, походження Середовище MS (контроль, без ФКР) Довжина Довжина пагона кореня, мм, мм, Селективне середовище MS (40 % ФКР) Довжина пагона Довжина кореня мм, мм, X  Sx 14 15 16 17 5 10 15 20 25 30 35 F1 (F1I4 Маринда х F3I4 Кузнечик) Каміла F1 (еталон № 1) ΑΧ 0339 F1 Amant F1 (еталон № 2) Середнє X  Sx X  Sx RI, % X  Sx RI, % 77,4±3,3 73,7±2,4 46,6±4,8 60,2 59,3±4,0 80,5 98,0±4,2 84,9±3,2 55,4±5,3 56,5 57,4±5,2 67,6 71,0±1,8 73,5±6,7 59,8±4,6 84,2 69,5±6,7 94,5 63,8±3,2 66,8±1,1 38,6±4,3 60,5 45,8±3,9 68,6 65,2 71,7 36,1 51,7 45,7 62,9 Результати досліджень свідчать про те, що при запропонованому способі завдяки своїй швидкості і об'єктивності можна за 9 місяців провести оцінку селекційного матеріалу на стійкість до фузаріозного в'янення та здійснити розмноження перспективних зразків. Цей спосіб також дозволяє зберігати цінний селекційний матеріал, отримувати з нього насіння і відповідно, сприяє прискоренню процесу добору джерел стійкості огірка лабораторними методами в культурі in vitro. Застосування лабораторних методів оцінки дозволить суттєво зменшити об'єми польових досліджень і виключити обробку рослин живими фітопатогенами роду Fusarium. Список використаних джерел 1. Основи селекції польових культур на стійкість до шкідливих організмів: навчальний посібник / [за ред. В.В. Кириченка та В.П. Петренкової]. - X.: Ін-т рослинництва ім. В.Я. Юр'єва, 2012. - 320 с. 2. Калашникова Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням: дис. … д-ра биол. наук: 03.00.23 / Калашникова Елена Анатолиевна. - М., 2003. - 279 с. 3. Корня Т.М. Вивчення селективних властивостей фільтрату культуральної рідини Fusarium graminerum Schweabe в культурі пиляків м'якої пшениці / Т.М. Корня, С.О. Ігнатова // Вісн. Харківського націон. унту. Сер. Біологія. - 2008. - Вип. З (15). - С. 99-106. 4. Малина Г.В. Видовий склад збудників кореневих гнилей огірка в закритому ґрунті / Г.В. Малина // Овочівництво і баштанництво. - Харків, 2005. - Вип. 50. - С. 383-388. 5. Методика дослідної справи в овочівництві і баштанництві / [За ред. Г.Л. Бондаренка, К.І. Яковенка]. - X.: Основа, 2001. - 369 с. 6. Поляков А.В. Получение растений огурца с повышенной устойчивостью к фузариозному увяданию методами in vitro (Методические рекомендации ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии) / А.В. Поляков, А.А. Ткачева, И.Н. Тарасенко. - 2006. - 28 с. 7. Пат. 62592 Україна, МПК А01Р 1/04 (2006.01). Спосіб створення стійких проти альтернаріозу вихідних форм томата / Мірошниченко В.П., Івченко Т.В., Черненко В.Л., Черненко К.М.; заявник і патентовласник Інститут овочівництва і баштанництва НААН. - № u201014200; заявл. 29.11.2010; опубл. 12.09.2011. Бюл. № 17. 8. Lebeda A. In vitro screening methods for assessing plant disease resistance / A. Lebeda, L. Svabova // Mass Screening Techniques For Selection Crops Resistant to diseases. Joint FAO/IAEA Programme of Nuclear Techniques in Food and Agriculture. - Vienna, 2010. - P. 12-47. 9. Клітинні технології створення вихідного селекційного матеріалу основних овочевих рослин в культурі in vitro (Методичні рекомендації) / [Івченко Т.В., Корнієнко С.І., Віценя Т.І. та ін.]. - X.: Плеяда, 2013. - 48 с. 10. Murashige T.A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Plant Physiology. - 1962. - № 15. - P. 473-497. 11. Охорона прав на сорти рослин. Методика проведення експертизи сортів на відмітність, однорідність і стабільність (ВОС). - К.: Алефа, 2004. - 242 с. 4 UA 106769 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб створення стійких до фузаріозу вихідних селекційних форм огірка, що включає скринінг генотипів в культурі ізольованих тканин in vitro на поживному середовищі MS, модифікованому як селективний фон 40 % сумішшю фільтратів культуральної рідини (ФКР) 2-х видів грибів (F. oxysporum f. sp. cucumerinum та F. solani) у співвідношенні 2:1, яке відповідає природній їх участі у патогенезі цієї хвороби, добір генотипів, що перевищили за морфометричними параметрами еталонні зразки з високим рівнем стійкості до хвороби, який відрізняється тим, що апікальні меристеми з стерильних проростків висаджують на індукційне поживне середовище з додаванням до нього селективного агента; добір стійких до трахеомікозів генотипів у культурі in vitro проводиться безпосередньо на диференційованому рослинному організмі через 28 діб культивування на селективному середовищі в умовах освітлення 2000 лк і за температури 2325 °C; оцінку рівня стійкості рослин-регенерантів на дію ФКР в культурі in vitro проводять шляхом визначення індексу резистентності (RI), вираженого у відсотках; для подальшого селекційного використання як джерела стійкості розмножують зразки, які перевищили за індексом резистентності еталонні генотипи з визначеною високою польовою стійкістю до фузаріозного в'янення. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5