Спосіб моделювання патоморфологічних змін, що супроводжують порушення функцій аноректальної ділянки та безпосередньо прямої кишки, які викликані патологією органів нервової системи при spina bifida (в експерименті)

Реферат: Спосіб моделювання патоморфологічних змін, що супроводжують порушення функцій аноректальної ділянки та безпосередньо прямої кишки, які викликані патологією органів нервової системи при Spina bifida (в експерименті), який включає перерізання корінців спинномозкових нервів, з яких формується nervus pudendus з правої або лівої сторін при моделюванні однобічного ураження, та двобічне перерізання корінців виконують при моделюванні повного ушкодження іннервації аноректальної ділянки, далі аналізують морфологічні зміни стінки прямої кишки. UA 107573 U (12) UA 107573 U UA 107573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель, що заявляється, належить до галузі медицини, зокрема до дитячої хірургії і може бути використана для вивчення в експерименті особливостей патогенезу захворювання, морфологічних змін, які виникають в аноректальній ділянці та безпосередньо у прямій кишці у хворих з ураженням органів нервової системи при Spina bifida та дає змогу вивчати дію нових методик оперативного або медикаментозного лікування у наближених до клінічної практики умовах. До порушень функції аноректальної ділянки відносять неутримання випорожнення, закрепи, та випадіння прямої та товстої кишок. Частота, з якою зустрічається ця патологія в популяції дітей по даним (Levine M. D., 1982). складає від 1 % до 5 %. По даним Ленюшкина А.И. (1991), Салова ПП. (1993) причинами виникнення явищ дисфункції аноректальної зони є відносна морфо-функційна незрілість її м'язово-нервового апарату до віку 5-7 років. Існує велика кількість робіт, в яких проведене електроміографічне дослідження функцій тазового дна у пацієнтів з порушеннями функцій аноректальної зони, яке доводить наявність виражених неврологічних розладів. (Swash М. (1980). Ленюшкин А.И. (1991), Салов ПП. (1993)). Цими дослідженнями доведено, що основною причиною виникнення розладів та патології функції аноректальної зони є механізм денервації, або диснервації промежини. Також проведені дослідження доводять, що покращення інервації м'язових структур аноректальної ділянки можливе при проведенні консервативного лікування та постійних тренуваннях. Але до теперішнього часу не з'ясовані етіологія і патогенез денервації структур тазового дна у дітей, а проведення діагностики неврологічних розладів аноректальної зони майже не можливе по причині неможливості використання голкових електродів.(Hobday D. I., Aziz Q., Thacker N., 2001). При проведенні рентгенологічного обстеження у дітей з хронічними закрепами нез'ясованої етіології, неутримання випорожнення та випадіннями прямої кишки в значній кількості випадків знаходять ознаки патології розвитку поперекового відділу хребта - Spina bifida. (Levitt M. A., Softer S. Z., Репа А., 1997). Задача корисної моделі, що заявляється, полягає в розробці експериментальної моделі, яка б адекватно відтворила особливості патогенезу та патоморфологічної картини при порушеннях функції аноректальної ділянки, які викликані патологією органів нервової системи. Поставлена задача досягається способом, який полягає в тому, що виконують перерізання корінців спинномозкових нервів, з яких формується nervus pudendus з правої або лівої сторін при моделюванні однобічного ураження, та двобічне перерізання корінців виконують при моделюванні повного ушкодження іннервації аноректальної ділянки, далі аналізують морфологічні зміни стінки прямої кишки. Експериментальна модель здійснювалась наступним чином: дослідження проводилось на щурах чоловічої статі в віці 5 місяців вагою від 260 до 290 грам в умовах віварію Національної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика. Загальна кількість щурів склала 100 тварин, які були розподілені на 4 групи. 1 група - 30 щурів, яким були перерізані нервові корінці, з яких формується n. pudendus зліва; 2 група - 30 щурів, яким були перерізані нервові корінці, з яких формується n. pudendus справа; 3 група - контрольна - 10 інтактних щурів; 4 група - 30 щурів, яким були перерізані нервові корінці, з яких формується n. pudendus з обох сторін. До кінця експерименту дожили всі щури. Всі оперативні втручання проводили з дотриманням правил асептики та антисептики. Використовували тіопенталовий наркоз (35-40 мг/кг). Всі маніпуляції із щурами проводились у відповідності до принципів Директиви 2010/63/EU Європейського Парламенту та Ради Європи про захист тварин, що використовуються з науковою метою. Тваринам першої групи було відтворено доступ до нервових корінців S-2-S-4, з яких формується n. pudendus зліва, проведено їх перерізання, шов рани не проводився. Тваринам другої групи було відтворено доступ до нервових корінців S-2-S-4, з яких формується n. pudendus справа, проведено їх перерізання, шов рани не проводився. Тваринам третьої контрольної групи оперативне втручання не проводилось. Тваринам четвертої групи було відтворено доступ до нервових корінців S-2-S-4, з яких формується n. pudendus з обох боків, проведено їх перерізання, шов рани не проводився. Щури виводились з експерименту на 60, 120 та 180 добу після оперативного втручання. За один раз виводилось по 10 щурів з кожної з дослідницьких груп. Проводилось забирання всього анатомічного відділу промежини разом з прямою кишкою. Перед забором матеріалу тваринам вводили летальну дозу тіопенталу (200 мг/кг). Для світлооптичної мікроскопії матеріал фіксували у 10 %-му розчині формаліну та після стандартної проводки заключали у парафінові блоки. Виготовляли зрізи, які фарбували гематоксиліном та еозином, азур II-еозином, фосфорновольфрамовим гематоксиліном. 1 UA 107573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Препарати тонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопу "Олімпус". Дані проведених досліджень свідчать, що у тварин контрольної групи визначалася типова будова стінки товстої кишки. В її складі чітко розрізнялися слизова і м'язова оболонки. Епітелій крипт включав велику кількість келихоподібних клітин, значна частина яких виявляла ознаки секреторної активності. Прошаки сполучної тканини між криптами тонкі, містили вузькі капіляри та незначну кількість лімфоїдних елементів. М'язова пластинка слизової оболонки відділена від донець крипт вузьким прошарком пухкої волокнистої сполучної тканини. Підслизова основа також представлена пухкою волокнистою сполучною тканиною, до якої входять тонкі пучки колагенових волокон, помірна кількість клітинних елементів, вузькі капіляри та, іноді, виявлялися дрібні артеріальні та венозні судини. М'язова оболонка у нижній частині прямої представлена внутрішнім циркулярним і суцільним зовнішнім шарами. Між ними можна спостерігати ганглії міжм'язового нервового сплетення. В їх складі виявлялися нейрони великих розмірів з крупними світлими ядрами і поодинокі гліальні елементи з невеличкими темними ядрами. Спостереження, проведені у щурів, яким було виконано одностороннє перерізання корінців, з яких формується n. pudendus справа або зліва (перша та друга групи тварин), показали, що зміни в стінці товстої кишки були однотипними, та розповсюджувалися, перш за все, на бік ушкодження. Через 60 діб після перерізання корінців, з яких формується n. pudendus з боку пошкодження в стінці прямої кишки виявлялися дистрофічні та осередкові деструктивні зміни, помірна запальна інфільтрація. Крипти мали помірно розширений просвіт, а також збільшені проміжки між криптами, що свідчить про не різко виражені явища набряку у власній пластинці слизової оболонки. Місцями спостерігалося деяке збільшення кількості сполучнотканинних волокон між криптами. Іноді тут зустрічалися ділянки некрозу, які розповсюджуються на всю товщу власної пластинки слизової оболонки. М'язова пластинка слизової оболонки кишки потовщена за рахунок набряку. М'язові елементи характеризувалися мозаіцизмом тинкториальних властивостей. Переважна більшість гладких міоцитів потовщена, нерівномірно забарвлювалася. Перш за все це пов'язано з послабленням сприйняття барвників їх центральними, колоядерними ділянками. Міоцити м'язової оболонки з боку операції також зазнавали змін, але менш виразних, ніж у м'язовій пластинці слизової оболонки. Це проявлялось нерівномірністю забарвлення їхньої цитоплазми, яка може набувати зернистого вигляду. У міжм'язових гангліях відмічалося деяке збільшення ядер нейроцитів, які доволі часто набували пухирцеподібного вигляду з чітко означеним ядерцем. Цитоплазма нейронів, у порівнянні з контролем, ставала менш базофільною. Можна відмітити певну тенденцію до зменшення кількості нейронів і збільшення гліоцитів у складі гангліїв. Через 120 діб після перерізання корінців, з яких формується n. Pudendus, у 9 щурів з 10 було виявлено збільшення діаметру товстої кишки приблизно на третині її довжини від анального каналу. Діаметр кишки був збільшений приблизно вдвічі в порівнянні з матеріалом від контрольної групи. Збільшення відбувалось за рахунок переповнення каловими масами. При мікроскопічному дослідженні стінки прямої кишки у тварин, в яких не визначалися макроскопічно зміни, її стан візуально практично не відрізнявся від того, що спостерігався на попередньому строку спостережень. У щурів, в яких була значно розширена товста кишка, визначалися виразні дистрофічні та деструктивні зміни в її стінці. З боку перерізання корінців перш за все звертало на себе увагу розповсюджені деструктивні зміни поверхневих ділянок слизової оболонки кишки, які іноді розповсюджувалися на всю товщу власної пластинки. У цих ділянках спостерігається виразна запальна інфільтрація. Сполучна тканина власної пластинки набрякла, помірно інфільтрована лейкоцитарними елементами. Місцями в ній спостерігається збільшення кількості колагенових волокон. Крипти за звичай розширені, а їхні келихоподібні клітини переважно характеризуються ознаками помірної або низької секреторної активності. М'язова пластинка слизової оболонки набрякла, її міоцити зазнавали дегенеративних змін. Внутрішній шар м'язової оболонки кишки виявляв слабе сприйняття барвників. Його гладкі міоцити набряклі, з просвітленою цитоплазмою. Нормальні тинкториальні властивості зберігали лише окремі гладкі м'язові клітини. Прошарок сполучної тканини між шарами м'язової оболонки потовщений зі значним вмістом колагенових волокон. Зовнішній шар м'язової оболонки також зазнає значних дегенеративних змін, але дещо у меншому ступені ніж внутрішній шар. Міжм'язові нервові ганглії характеризувалися збільшенням кількості гліоцитів та зменшенням - нейроцитів. Останні часто виявляли незначну оксифілію цитоплазми. 2 UA 107573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 З контрлатеральної від перерізання корінців сторони у щурів, в яких був збільшений діаметр товстої кишки, спостерігалися помірні явища набряку та інфільтрації слизової оболонки, помірні дегенеративні зміни частини міоцитів м'язової оболонки. Через 180 діб після перерізання n. pudendus у всіх щурів спостерігалися збільшення діаметру товстого кишечника на всьому протязі у 3 та більше рази. Мікроскопічно в стінці прямої кишки в цей час визначався помірний набряк. Крипти виглядали дещо розширеними з ознаками гіперсекреції келихоподібних залоз. Власна пластинка помірно інфільтрована лейкоцитарними елементами. В ній виявлялися осередки фіброзу. М'язова пластинка характеризувалася виразними дистрофічними змінами міоцитів та фіброзними змінами. Кровоносні судини слизової оболонки, перш за все венозні, у більшості розширені і переповнені кров'ю. Внутрішній шар м'язової оболонки зазнавав практично тотальної дистрофії. Міоцити втрачали здатність до сприйняття барвників, а їхні ядра округлялися. Місцями тут спостерігалися осередки фіброзу. Зовнішній шар м'язової оболонки зазнавав значно менших змін і більшість гладких м'язових клітин зберігало звичайну здатність до забарвлення. Ганглії міжм'язового нервового сплетення характеризувалися суттєвим зменшенням кількості нейроцитів, аж до їх повної відсутності в окремих гангліях. Разом з тим тут збільшувалася кількість гліоцитів. Типовим був розвиток навколо гангліїв сполучнотканинної капсули, що чітко візуалізувалася. З контлатеральної від сторони операції в стінці прямої кишки відбувалося зростання, у порівнянні з попереднім строком спостереження, виразності дегенеративно-деструктивних процесів. Це проявлялося набряком, запальною інфільтрацією та осередками некрозів епітеліальної та власної пластинок слизової оболонки. М'язова пластинка дещо потовщувалася за рахунок набряку, зазнавала помірних дегеративних змін. Спостерігалися незнані осередки фіброзу у власній пластинці, а також зростала, у порівнянні з контролем, щільність підслизової основи. Помірні дегенеративні явища виявлялися також у м'язовій оболонці, переважно в її внутрішньому шарі, а також у гангліях міжм'язового нервового сплетення. Через 60 діб після перерізання n. pudendus з обох боків спостерігається збільшення діаметру товстої кишки здебільшого в низхідній частині, у двох щурів цієї групи була збільшена приблизно половина товстої кишки. Збільшення відбувалось за рахунок переповнення каловими масами. Мікроскопічно в стінці кишки з обох боків спостерігаються дегенеративні і осередкові зміни. Причому, їх виразність є більшою, ніж зі сторони ураження при однобічному перерізанні n. pudendus. Слизова помірно набрякла. Власна пластинка помірно інфільтрована лімфоцитарними елементами. В ній виявляються осередки некрозу, які можуть розповсюджуватися до підслизової основи. Між криптами відмічається деяке збільшення кількості колагенових волокон. М'язова пластинка зазнає виразних дегенеративних змін. У підслизовій основі збільшується, у порівнянні з контролем щільність сітки сполучнотканинних волокон, а також товщина їхніх пучків. М'язова оболонка прямої кишки зазнає виразних дегенеративних змін, які мають на цей час мозаїчне розповсюдження і більш виражені у внутрішньому шарі. У гангліях міжм'язового нервового сплетення зменшується кількість нейроцитів. Збережені клітини цього типу мають пухирцеподібні ядро з чітко візуалізуємими ядерцями, майже прозору цитоплазму. У складі гангліїв дещо зростає кількість гліальних клітин. У тварин через 120 діб спостерігали збільшення діаметру товстого кишечнику на всьому протязі, у 5 в 2 рази, у 4 в 2,5 рази, а у 1 в 3 рази, а також збільшення довжини товстої кишки. При мікроскопії відмічається наростання, у порівнянні з попереднім строком спостереження, дегенеративно-деструктивних змін у стінці прямої кишки. Наряду з численними осередками поверхневої деструкції у власній пластинці слизової налічують осередки некрозів, що можуть розповсюджуватися до підслизової основи. У власній пластинці є виразною запальна інфільтрація, а між криптами часто спостерігається фіброзування сполучної тканини. М'язова пластинка слизової оболонки, а також м'язова оболонка прямої кишки зазнають виразних дегенеративних змін. Ганглії міжм'язового нервового сплетення виглядають спустошеними. У них виявляються лише поодинокі нейроцити. Але, у порівнянні з попереднім строком спостережень їхня цитоплазма набуває помірної базофілії. Навколо гангліїв до цього часу починає формуватися сполучнотканинна капсула, що через 120 діб після операції вже чітко візуалізується. Через 180 діб у всіх щурів довжина товстої кишки була збільшена, діаметр товстої кишки перебільшував діаметр контрольної групи у 4 щурів в З рази, а у 3 в 4 і більше раз. Стінка товстої кишки була потовщеною, в просвіті кишки визначалося калове каміння. 3 UA 107573 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Через 180 днів після двосторонньої невротомії у стінці прямої кишки спостерігається зменшення, у порівнянні з попереднім строком спостереження, виразності запальної інфільтрації слизової оболонки. Деструктивні явища у ній практично не зустрічаються. Разом з тим у проміжках між криптами виявляються численні осередки фіброзу. Крипти за звичай помірно розширені, келихоподібні клітини часто великих розмірів, але без морфологічних ознак активної секреції. М'язова пластинка слизової оболонки фрагметована за рахунок розростання сполучної тканини. Її ділянки, що збереглися, характеризуються термінальними ознаками дегенеративних змін. Підслизова основ кишки зазнає виразних фіброзних змін, а розташовані тут кровоносні судини розширені і переповнені кров'ю. Внутрішній шар м'язової оболонки на більшому протязі зазнає дегенеративних змін. Гладкі міоцити втрачають здатність до забарвлення, що свідчить про руйнування їхнього скоротливого апарату. Їхні ядра округлюються. Збільшується кількість фібробластичнх елементів та сполучнотканинних волокон. Зовнішній шар зазнає менших дегенеративних змін, і в більшій чи меншій ступені в ньому зберігаються нормальні гладкі міоцити. Ганглії міжм'язового нервового сплетення в цей час у своєму складі мають значно більше клітинних елементів, ніж у контролі чи на попередньому стропі спостереження. Це пов'язане з значним зростанням кількості гліальних клітин. Доволі часто їх ядра є гіперхромними. Кількість нейронів у гангліях різко зменшена, а в частині гангліїв вони взагалі відсутні. У збережених нейронах певною мірою відбувається відновлення здатності цитоплазми до забарвлення. В ній можна спостерігати базофільні грудочки, хоча нерідко вона проявляє схильність до ацидофілії. Наші досліди свідчать, що при однобічному перерізані n. pudendus відбувається низка дегенеративних змін у стінці прямої кишки з боку ушкодження. Вони торкаються слизової і м'язової оболонок. При цьому спостерігаються дегенеративні, деструктивні і запальні зміни епітеліальної та власної пластинок слизової. Це з часом призводить до фіброзних змін. Дегенеративні зміни практично повністю руйнують м'язову пластинку слизової оболонки. Поступово відбуваються як фіброзні зміни останньої, так і підслизової основи. М'язова оболонка також зазнає дегенеративних змін, причому більш виразними вони є у внутрішньому її шарі. Денервація призводить до суттєвих змін гангліїв міжм'язового нервового сплетення, що проявляється зменшенням кількості нейроцитів та збільшенням - гліоцитів. Можна говорити також про певну адаптацію прямої кишки до умов денервації, про що свідчить помітне зменшення виразності запальних і дегенеративно-деструктивних змін до 6 місяця після невротомії, у порівнянні з картинами, що спостерігалися через 2 і 4 місяці. Слід особливо зазначити, що дегенеративні явища, які виникали з боку ушкодження при однобічній невротомії мали тенденцію до поширення, і через 4 і особливо 6 місяців виявлялися і з контрлатеральної сторони, хоча і не так виразно. Виходячи з отриманих даних можна зробити висновки, що порушення іннервації промежини за рахунок одностороннього пошкодження n. pudendus з плином часу призводить до виникнення важких деструктивних змін у стінці прямої кишки. Також встановлено, що патологічні зміни наростають прямо пропорційно термінам захворювання та при тривалому перебігу захворювання морфологічні зміни з'являються і на контрлатеральній стороні. При двобічному перерізані n. pudendus відбувається низка дегенеративних змін у стінці всієї прямої кишки, що аналогічні однобічному, але ступінь їх глибини більший на відміну від однобічного перерізання. Таким чином, даний спосіб моделювання полягає в тому, що з метою відтворення патоморфологічних змін, що супроводжують порушення функцій, які виникають в аноректальній ділянці та безпосередньо в прямій кишці у хворих з ураженням органів нервової системи при Spina bifida проводилось перерізання корінців спинномозкових нервів, з яких формується nervus pudendus, що викликає ушкодження іннервації аноректальної ділянки та завдяки цьому формуються дегенеративні зміни у стінці прямої кишки у вигляді фіброзного переродження епітеліальної, власної пластинок слизової оболонки, підслизової основи, переважно внутрішнього шару м'язової оболонки та призводить до суттєвих дегенеративних змін гангліїв міжм'язового нервового сплетення, що проявляється зменшенням кількості нейроцитів та збільшенням - гліоцитів. Проведене дослідження дозволяє припустити, що моделювання патоморфологічних змін, що супроводжують порушення функцій аноректальної ділянки та безпосередньо прямої кишки, які викликані патологією органів нервової системи при Spina bifida шляхом перерізання корінців спинномозкових нервів, з яких формується nervus pudendus у щурів викликає дегенеративні зміни стінки прямої кишки, які притаманні хворим з ураженням органів нервової системи при Spina bifida. 4 UA 107573 U 5 Технічний результат: спосіб, що заявляється, дозволяє відтворити особливості патогенезу та патоморфологічної картини при порушеннях функції аноректальної ділянки, які викликані патологією органів нервової системи і дає змогу вивчати дію нових методик оперативного або медикаментозного лікування у наближених до клінічної практики умовах, що дозволить підвищити ефективність лікування порушення функцій аноректальної ділянки та безпосередньо прямої кишки, які викликані патологією органів нервової системи при Spina bifida. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб моделювання патоморфологічних змін, що супроводжують порушення функцій аноректальної ділянки та безпосередньо прямої кишки, які викликані патологією органів нервової системи при Spina bifida (в експерименті), який включає перерізання корінців спинномозкових нервів, з яких формується nervus pudendus з правої або лівої сторін при моделюванні однобічного ураження, та двобічне перерізання корінців виконують при моделюванні повного ушкодження іннервації аноректальної ділянки, далі аналізують морфологічні зміни стінки прямої кишки. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5