Поживне середовище для виділення лактобактерій, здатних до деградації оксалатів

Реферат: Поживне середовище для виділення лактобактерій, здатних до деградації оксалатів, містить декстрозу, білковий гідролізат, пептон ферментативний, екстракт харчових дріжджів, натрій лимоннокислий, цитрат амонію, K2НРО4, Tween®80, MgSO4•7H2O, MnSO4•4H2O, агар мікробіологічний. Додатково містить хлорид кальцію та амонію оксалат. UA 108160 U (12) UA 108160 U UA 108160 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до медичної мікробіології, зокрема до бактеріологічних середовищ, а саме є щільним диференціальним середовищем для детекції штамів Lactobacillus spp, що мають функціональні ферментативні системи для деградації оксалатів. В організмі людини оксалати є потенційно токсичним кінцевим продуктом метаболізму гліцину, гліоксилату та аскорбінової кислоти. Крім того, нормальна дієта передбачає надходження 80-120 мг оксалатів на день з їжею. Біодоступність харчових оксалатів може бути досить варіабельною і, за нормальних умов, рівень їх кишкової адсорбції складає біля 10 %. Оскільки в організмі людини та інших ссавців ферментні системи, придатні для деградації оксалату відсутні, він підлягає виведенню, що здійснюється, головним чином, шляхом ренальної екскреції. Зростання концентрації оксалатів в крові внаслідок різноманітних ендогенних або екзогенних причин призводить до розвитку оксалурії (>40mg/24h) та специфічних уражень нирок. Для зменшення токсичного навантаження на нирки існують механізми, що забезпечують екскрецію оксалатів крізь слизову оболонку тонкого кишечнику [1], де вони (так саме як і оксалати, що надходять із їжею) мають три варіанти майбутнього: (і) частина (незначна) утворює нерозчинні комплекси з іонами двовалентних металів (головним чином з кальцієм) та виводиться з фекаліями; (іі) частина може бути утилізована тими представниками кишкової мікрофлори, що мають відповідні ферментні системи; (ііі) оксалати, що залишились, адсорбуються в дистальних відділах товстого кишечнику та потрапляють в кров. Кишкова мікрофлора здатна до ефективної утилізації оксалатів, зокрема Oxalobacter formigenes (для якого оксалати є єдиним джерелом енергії та вуглецю), є досить вразливим компонентом мікробіоценозу, чутливим до дії багатьох загальновживаних антибіотиків [2]. Чисельні дослідження свідчать, що втрата цього кишкового симбіонту пов'язана з суттєвим зростанням ризику формування кальцій-оксалатних конкрементів у нирках [3]. Слід зазначити, що на сьогодні єдиним доступним методом впливу на оксалатний гомеостаз є дієтичні обмеження, що негативно впливають на якість життя пацієнта та, в більшості випадків, є недостатньо ефективними. Одним з альтернативних напрямків корекції є застосування пробіотичних препаратів [4] і, оскільки досягти стабільної реколонізації кишкового тракту представниками виду Oxalobacter formigenes зазвичай досить складно [5], виявлення інших представників нормального кишкового мікробіоценозу з даним видом метаболічної активності є актуальним напрямком досліджень в цій галузі. Лактобактерії мають тривалу історію використання як компонента пробіотичних препаратів, загальновизнаний рівень безпечності та чимало корисних властивостей, що сприяють формуванню симбіотичних відносин з макроорганізмом. Секвенування геному окремих представників Lactobacillus spp. показало наявність ферментних систем, придатних для деградації оксалатів (зокрема, оксалил-коензим А декарбоксилази (Охс) та форміл-коензим А трансферази (Frc), ідентичних Охс та Frc Oxalobacter formigenes), а також продемонструвало внутрішньовидову варіабельність цієї ознаки [6]. Останнє означає, що здатність до деградації оксалатів, може бути надбана внаслідок вертикального або горизонтального трансферу відповідних фрагментів геному, або втрачена внаслідок різноманітних генетичних процесів, тобто є штамо-специфічною ознакою. Відповідно, оцінка здатності до деградації оксалатів не входить до стандартних схем видової ідентифікації Lactobacillus spp. і бактеріологічні середовища, що дозволяють це зробити, відсутні. Стандартним елективним середовищем для культивування Lactobacillus spp. є середовище MRS (de Man-Rogosa-Sharpe) [7] наступного складу (г/л): декстроза 20,0 білковий гідролізат 10,0 пептон ферментативний або 10,0 м'ясний екстракт екстракт харчових дріжджів 5,0 натрій лимоннокислий 5,0 K2НРО4 2,0 цитрат амонію 2,0 Tween® 80 1,0 MgSO4•7H2O 0,1 MnSO4•4H2O 0,05 агар мікробіологічний 15,0. Tween® 80, цитрат та ацетат стимулюють ріст лактобактерій; MgSO4 •7Н2О та MnSO4 •7H2O необхідні для росту в присутності цитрату. Відоме індикаторне бактеріологічне середовище для виділення штамів Oxalobacter formigenes наступного складу [8] (г/л): K2НРО4 0,25 1 UA 108160 U 5 10 15 20 25 30 35 натрію ацетат 0,082 екстракт дріжджів 0,5 1,0 СаСl2  2Н2О Амонію оксалат 5,68 Na2CO3 4,0 0,33 cystein  НСl  Н2О 0,33 Na2S  9H2O агар 22 вода решта. Кальцію хлорид та амонію оксалат утворюють нерозчинний преципітат оксалату кальцію (в реакції СаСl2+ (NH4)2C2O4 >> СаС2О4+2NH4Cl), що робить середовище непрозорим. При культивуванні мікроорганізмів, здатних до деградації оксалату, навколо них формується зона прозорого середовища, що не містить кальцію оксалату. Наявність в складі середовища кальцію хлориду, амонію ацетату, K 2НРО4, цитрату, дріжджового екстракту та агару є спільними з суттєвими ознаками рішенням, що заявляється. До причин, що заважають отриманню бажаного технічного результату можна віднести той факт, що склад середовища не є оптимальним для представників Lactobacillus spp. Оскільки здатність до деградації оксалатів у лактобактерій є індуцибельною ознакою (тобто вимагає певних умов для активації цього метаболічного шляху, на відміну від Oxalobacter formigenes, для якого оксалати є єдиним доступним субстратом), умови культивування (зокрема відсутність іонів Мn2+ [9]), мають суттєвий вплив на можливість досягнення технічного результату. Власно, за формальними ознаками, це середовище не може вважатися аналогом корисної моделі, що заявляється, оскільки не призначене для культивування лактобактерій. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити поживне середовище для виділення лактобактерій, здатних до деградації оксалатів, в якому за рахунок введення індикаторної системи до стандартного середовища MRS, забезпечити можливість візуальної детекції бажаного виду метаболічної активності у представників Lactobacillus spp… Поставлена задача вирішується наступним складом середовища (г/л): декстроза 20,0 білковий гідролізат 10,0 пептон ферментативний 10,0 екстракт харчових дріжджів 5,0 натрій лимоннокислий 5,0 K2НРО4 2,0 цитрат амонію 2,0 Tween® 80 1,0 MgSO4•7H2O 0,1 MnSO4•4H2O 0,1 1,0 CaCl2  2H2O амонію оксалат 5,68 15,0 агар мікробіологічний (рН 5,5) вода решта. Вміст хлориду кальцію та амонію оксалату визначається оптимальними параметрами утворення кальцію оксалату та можливостями його деградації тест-штамом з формуванням зони просвітлення протягом 48 годин інкубації культури. Зміна співвідношення цих компонентів призводить до небажаного накопичення надлишків хлориду кальцію, або оксалату амонію. Збільшення або зменшення концентрації кінцевого продукту реакції (оксалату кальцію) негативно впливає на можливості візуальної оцінки бажаного виду метаболічної активності. Двократне збільшення кількості сульфату марганцю (порівняно з його вмістом в MRS) сприяють підвищенню рівня експресії Охс та Frc [9] та стимуляції бажаного виду метаболічної активності. Подальше підвищення концентрації MnSO4 негативно впливає на ростові властивості середовища. За даними літератури [10] рівень транскрипції Охс та Frc при рН вищий ніж 5.5 є незначним та суттєво підвищується в діапазоні 5,5-4,5. В процесі культивування лактобактерій кислотність середовища зростає і оптимальний діапазон (рН 5,5-4,5) досягається протягом перших 24-36 годин культивування. Наведені нижче дані підтверджують, що розроблена модифікації MRS забезпечує цілком оптимальні умови росту для різних видів лактобактерій (Табл.1). 2 UA 108160 U Таблиця 1 Порівняльні данні ростових властивостей стандартного та сконструйованого середовища Розроблене середовище Розведення культури -6 -7 -6 -7 10 10 10 10 Кількість мікроорганізмів (КУО) в 0,1 мл (M±m) 68,4±0,7 6,7±0,2 65,1±0,5 6,4±0,3 73,4±0,5 7,3±0,2 69,6±0,6 6,9±0,l 70,9±0,8 7,1±0,3 67,8±0,7 6,7±0,2 71,6±0,8 7,1±0,3 69,8±0,7 6,9±0,2 MRS Тест-штами L.gasseri ATCC 33323 L.plantarum 8P-A3 L.acidophilus R0052 L.rhamnosus R0011 5 10 Можливість здійснення корисної моделі підтверджено експериментальними даними, отриманими при використанні розробленого середовища для оцінки здатності до деградації оксалатів різними, (здебільшого доступними в складі комерційних пробіотичних препаратів) штамами лактобактерій (креслення). Креслення. Результати дослідження здатності до деградації оксалатів методом агарової дифузії (метод "колодязів"). Навколо лунок 1, 2 та 8, що містять культури L. plantarum 299v, L. plantarum wt та L.gasseri АТСС 33323, відповідно, спостерігається виражена зона просвітлення культурального середовища. Нумерація штамів та інформація щодо їх походження наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Перелік та походження застосованих штамів № п/п Тест-штам 1. L. plantarum 299v 2. L. plantarum wt 3. L. plantarum 8P-A3 4. L. acidophilus 5. L. acidophilus R0052 6. L. rhamnosus R0011 7. L reuteri DSM17938 8. Lgasseri ATCC 33323 15 20 25 30 Походження пробіотичний препарат "ProbiMage"; Bringwell Швеція виділений авторами KM з фекальної мікрофлори здорової людини пробіотичний препарат "Лактонорм-Плюс"; "Авицена", Україна пробіотичний препарат "L.Acidophilus (60)" / Лактобактерии лиофилизир; Santegra, США пробіотичний препарат "Lacidofil"; Institut Rosell Inc., Канада пробіотичний препарат "Lacidofil"; Institut Rosell Inc., Канада пробіотичний препарат "Lactobacillus reuteri Protectis" Швеція BioGaia LGC's partnership with ATCC: http://www.lgcstandardsatcc.org/Products/All/33323.aspx Як позитивний контроль використано референтний штам Lactobacillus gasseri ATCC 33323 (раніше відомий як "F. Gasser 63 AM") з встановленою здатністю до деградації оксалатів [11]. ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ 1. Hatch М. Intestinal excretion of oxalate in chronic renal failure / Hatch M., Freel RW, Vaziri ND… // J Am Soc NephroL-1994. - V 5. - N 6. - P. 1339-1343. 2. Lange, J.N. Sensitivity of Human Strains of Oxalobacter formigenes to Commonly Prescribed Antibiotics. Lange, J.N.,Wood KD, Wong H, et al. // Urology. -2012. -V79. -N6. -P.1286-1289. doi: 10.1016/j.urology.2011.11.017. 3. Kaufman, D.W. Oxalobacter formigenes May Reduce the Risk of Calcium Oxalate Kidney Stones. Kaufman DW, Kelly JP, Curhan GC, et al. //Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 2008;19(6):l 197-1203. doi:10.1681/ASN.2007101058. 4. Abratt, V.R. Oxalate-degrading bacteria of the human gut as probiotics in the management of kidney stone disease. Abratt V.R., Reid S.J. //Adv Appl Microbiol. - 2010. - V72. - P. 63-87. doi: 10.1016/S0065-2164(10)72003-7. 5. Hoppe, B. Oxalobacter formigenes: a potential tool for the treatment of primary hyperoxaluria type 1. Hoppe В., Beck В., Gatter N., von Unruh G., Tischer A., Hesse A., Laube N., Kaul P., Sidhu H…//Kidney Int.-2006.-V70.-N7.-P. 1305-1311. 6. Azcarate-Peril, M.A. Analysis of the Genome Sequence of Lactobacillus gasseri ATCC 33323 Reveals the Molecular Basis of an Autochthonous Intestinal Organism. Azcarate-Peril MA, Altermann 3 UA 108160 U 5 10 15 E, Goh YJ, et al. //Applied and Environmental Microbiology. - 2008. - V74. - N15. -P. 4610-4625. doi:10.1128/AEM.00054-08. 7. LACTOBACILLI MRS AGAR [Електронний ресурс] - Режим доступу до ресурсу: https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/Content/hugo/LactobacilliMRSAgar.html 8. Milton, J. A. Oxalobacter formigenes gen. nov., sp. nov.: oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract. Milton J. Allison, Karl A. Dawson, William R. Mayberry, John G. Foss// Archives of Microbiology. -1985. - V 141. - N1. - P. 1-7. 9. Tanner, A. Oxalate decarboxylase requires manganese and dioxygen for activity. Overexpression and characterization of Bacillus subtilis YvrK and YoaN. Tanner A., Bowater L., Fairhurst S.A., Bornemann S. //J Biol Chem. - 2001. - V 276. - N47. - P.43627-43634. 10. Turroni, S. Oxalate-Degrading Activity in Bifidobacterium animalis subsp. lactis: Impact of Acidic Conditions on the Transcriptional Levels of the Oxalyl Coenzyme A (CoA) Decarboxylase and Formyl-CoA Transferase Genes. Turroni S., C. Bendazzoli, S.C. F. Dipalo at al. //Appl. Environ. Microbiol. - 2010. - vol. 76. -N 16. -P. 5609-5620. 11.Lauer, E. Lactobacillus gasseri sp. nov., a new species of the subgenus Thermobacterium. Lauer, E., and O. Kandler. //Zentralblatt fur Bakteriologie: I. Abt. Originale C: Allgemeine, angewandte und okologische Mikrobiologie. - 1980. - V 1. - N 1. - P.75-78. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Поживне середовище для виділення лактобактерій, здатних до деградації оксалатів, що містить декстрозу, білковий гідролізат, пептон ферментативний, екстракт харчових дріжджів, натрій лимоннокислий, цитрат амонію, K2НРО4, Tween®80, MgSO4•7H2O, MnSO4•4H2O, агар мікробіологічний, яке відрізняється тим, що додатково містить хлорид кальцію та амонію оксалат при наступному співвідношенні компонентів (г/л): декстроза 20,0 білковий гідролізат 10,0 пептон ферментативний 10,0 екстракт харчових дріжджів 5,0 натрій лимоннокислий 5,0 K2НРО4 2,0 цитрат амонію 2,0 Tween ® 80 1,0 MgSO4•7H2O 0,1 MnSO4•4H2O 0,1 1,0 СаСl22Н2О амонію оксалат 5,68 15,0 агар мікробіологічний (рН 5,5) вода решта. 4 UA 108160 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5