Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii 1MB В-7405 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин. Концентрація технічного гліцерину у середовищі для одержання інокуляту становить 5-7 г/л, а у середовищі для біосинтезу поверхнево-активних речовин - 2224 г/л. UA 110789 U (12) UA 110789 U UA 110789 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані як антиадгезивні агенти у харчовій, фармацевтичній промисловості та медицині. Відомим аналогом є спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С21N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру /Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., ВільдановаМарцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Недоліком аналога є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найближчим аналогом до корисної моделі є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii ІMB В-7405 [Пат. 105975 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин /Пирог Т.П., Мащенко О.Ю., Покора Х.А., Гриценко Н.А., Опубл. 10.07.2014, Бюл. № 13], який включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 у рідкому середовищі з технічним гліцерином в концентрації 3,9-4,1 % (об'ємна частка). Недоліком найближчого аналога є недостатньо високі антиадгезивні властивості синтезованих ПАР. В основу корисної моделі поставлена задача створення нового способу одержання ПАР, який покращує антиадгезивні властивості поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин, згідно з корисною моделлю, концентрація технічного гліцерину у середовищі для одержання інокуляту становить 5-7 г/л, а у середовищі для біосинтезу поверхнево-активних речовин - 22-24 г/л. Використання для одержання інокуляту і біосинтезу ПАР технічного гліцерину у концентрації 5-7 і 22-24 г/л відповідно дає змогу одержати ПАР, після обробки розчинами яких абіотичних поверхонь адгезія мікроорганізмів на них знижується на 15-25 % (до 30-45 %). Корисну модель виконують наступним чином. Культивування N. vaccinii ІMB В-7405 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4•7H2O-0,1, СаСl2•2Н2О - 0,1, КН2РО4-0,1, FeSO4•7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують технічний гліцерин у концентрації 23 г/л. Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену у середовищі наведеного складу з 6 г/л технічного гліцерину. 4 5 Інокулят, в якому чисельність бактерій становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу одержати ПАР, після обробки розчинами яких абіотичних поверхонь адгезія мікроорганізмів на них знижується на 15-25 % (до 30-45 %). Приклад 1. Антиадгезивні властивості ПАР N vaccinii ІMB В-7405 залежно від якості гліцерину у середовищі культивування. Культивування штаму ІMB В-7405 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4•7H2O-0,1, СаСl2•2Н2О - 0,1, КН2РО4-0,1, FeSO4•7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують очищений та технічний гліцерин (Комсомольський біопаливний завод, Полтавська обл.) у концентрації 20 г/л. Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 5 г/л відповідного гліцерину. 4 5 Інокулят, в якому чисельність бактерій становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Позаклітинні поверхнево-активні речовини виділяють так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1М НСl, воронку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1М НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують 1 UA 110789 U 5 10 15 20 25 органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Антиадгезивні властивості ПАР визначають так. Однакові очищені пластинки 2 досліджуваного матеріалу (1 см ) стерилізують відповідно до матеріалу: скло, кераміка, нержавіюча сталь - при 112 °C, 1 год.; пластик, лінолеум (полівінілхлорид) - 112 °C, 30 хв., після чого вносять у розчин ПАР (0,05 мг/мл) і висушують упродовж 24 год. у термостаті при 30 °C. Потім однодобові тест-культури бактерій та дріжджів вирощені на м'ясо-пептонному (МПА) та глюкозо-картопляному агарі (ГКА), суспендують у 100 мл стерильної водопровідної води, у суспензію поміщають попередньо оброблені і не оброблені (контрольні) матеріали, витримують 2 год. у термостаті і ополіскують 10 мл стерильної водопровідної води, щоб змити неадгезовані клітини. Далі пластинки матеріалів обробляють метанолом (99 %) протягом 15 хв. з метою фіксування адгезованих клітин з подальшим висушуванням при кімнатній температурі. Потім пластинки витримують у 1 % розчині генціанвіолету 5 хв. і ополіскують водопровідною водою. Після висушування досліджувані матеріали обробляють 10 мл 33 % розчином оцтової кислоти і вимірюють оптичну густину отриманої суспензії. Кількість адгезованих клітин визначають як відношення оптичної густини суспензії, одержаної з оброблених препаратами ПАР зразків до оптичної густини з контрольних зразків і виражають у відсотках. Як тест-культури під час визначення антимікробних властивостей ПАР використовують штами бактерій (Escherichia coli IEM-1, Bacillus subtilis БТ-2) і дріжджів (Candida albicans Д-6) з колекції живих культур кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій. Дані щодо адгезії мікроорганізмів на абіотичних поверхнях, оброблених ПАР, наведено у табл. 1. Таблиця 1 Антиадгезивні властивості ПАР N. vaccinii ІMB В-7405, синтезованих на очищеному і технічному гліцерині Гліцерин як субстрат очищений технічний 30 35 40 Матеріал пластик кахель сталь лінолеум пластик кахель сталь лінолеум В. subtilis БТ-2 (спори) 53 59 59 51 39 45 48 39 Адгезія, % Candida albicans Д6 65 66 62 67 54 53 50 52 Escherichia coli IEM-1 56 51 58 57 44 40 46 42 Наведені дані свідчать, що ПАР, синтезовані на технічному гліцерині, проявляють вищі антиадгезивні властивості, ніж одержані на очищеному субстраті. + Приклад 2. Вплив катіонів калію та натрію на активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази N. vaccinii ІMB В-7405 Згідно з літературними даними, аміноліпіди є ефективнішими антимікробними таантиадгезивними агентами порівняно з гліколіпідами. Оскільки штам ІMB В-7405 синтезує комплекс гліко-, аміно- та нейтральних ліпідів, можна припустити, що у процесі культивування N. vaccinii ІMB В-7405 на технічному гліцерині вміст аміноліпідів у складі синтезованого комплексу ПАР є вищим, ніж одержаного на середовищі з очищеним субстратом. Однією з причин посилення синтезу аміноліпідів за умов росту штаму ІMB В-7405 на відходах виробництва біодизелю може бути наявність у складі такого субстрату високої концентрації катіонів калію чи + натрію - потенційних активаторів НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази - ключового ферменту біосинтезу аміноліпідів у N. vaccinii ІMB В-7405. Для перевірки цього припущення аналізують + + + вплив різних концентрацій K і Na на активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази за умов росту N. vaccinii ІMB В-7405 на очищеному гліцерині. Культивування штаму ІMB В-7405 здійснюють як описано у прикладі 1 упродовж 48 год. Як джерело вуглецю використовують очищений гліцерин) у концентрації 20 г/л. 2 UA 110789 U 5 10 Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв., + 4 °C). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05 М К -фосфатним буфером (рН 7,0), центрифугуючи (4000 g, 15 хв., 4 °C). Відмиті клітини ресуспендують в 0,05 М + К -фосфатному буфері (рН 7,0) і руйнують ультразвуком (22 кГц) 3 рази по 60 с при 4 °C на апараті УЗДН-1. Одержаний дезінтеграт центрифугують (12000 g, 30 хв., 4 °C), осад відділяють, а супернатант використовують як безклітинний екстракт. Активність глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4) аналізують за утворенням глутамату під час окиснення НАДФН при 340 нм. Як видно з наведених у табл. 2 даних, внесення у реакційну суміш 50-100 мМ катіонів калію та натрію супроводжується збільшенням активності ферменту в 1,3-2,3 рази порівняно з активністю без катіонів. Приклад 3. Залежність антиадгезивних властивостей ПАР від концентрації технічного гліцерину у середовищі культивування N. vaccinii ІMB В-7405 Культивування штаму ІMB В-7405 здійснюють як описано у прикладі 1. 15 Таблиця 2 + Активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази N. vaccinii ІMB В-7405 за наявності різних концентрацій катіонів калію та натрію Наявність у реакційній суміші KСl NaCl Без солей (контроль) 20 Концентрація, мМ 50 100 50 100 0 -1 -1 Активність, нмоль хв. мг білку 635±32 1111±55 794±39 1111±55 476±232 Як джерело вуглецю використовують технічний гліцерин у концентрації 20-25 г/л. Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 5 г/л субстрату. Виділення ПАР і визначення антиадгезивних властивостей здійснюють як описано у прикладі 1. Як свідчать дані, наведені у табл. 3, ступінь адгезії С. albicans Д-6 був мінімальним (42-46 %) на поверхнях, оброблених ПАР, синтезованими на середовищі з 22-24 г/л технічного гліцерину. Таблиця 3 Вплив концентрації технічного гліцерину у середовищі культивування N. vaccinii ІMB В-7405 на антиадгезивні властивості ПАР Концентрація технічного гліцерину у середовищі, г/л 20 21 22 23 24 25 25 30 Адгезія С. albicans Д-6 (%) сталь 53 53 43 42 43 49 кахель 54 53 46 45 45 50 лінолеум 52 52 44 43 45 52 Приклад 4. Вплив концентрації технічного гліцерину у середовищі для одержання інокуляту на антиадгезивні властивості ПАР Культивування штаму ІMB В-7405 здійснюють як описано у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують технічний гліцерин у концентрації 23 г/л. Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 4-7 г/л субстрату. Виділення ПАР і визначення антиадгезивних властивостей здійснюють як описано у прикладі 1. Дані щодо адгезії С albicans Д-6 на абіотичних поверхнях після обробки ПАР, синтезованими з використанням інокуляту різної якості наведено у табл. 4. 35 3 UA 110789 U Таблиця 4 Залежність антиадгезивних властивостей ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 від концентрації технічного гліцерину у середовищі для одержання інокуляту Концентрація технічного гліцерину у середовищі для одержання інокуляту, г/л 4 5 6 7 8 5 10 15 Адгезія С. albicans Д-6 (%) кахель сталь лінолеум 54 45 43 45 55 53 33 42 43 53 52 43 43 43 55 Таким чином, використання посівного матеріалу, вирощеного на середовищі, що містить 5-7 г/л технічного гліцерину, супроводжується синтезом ПАР з найвищими антиадгезивними властивостями. Приклад 5. Порівняння антиадгезивних властивостей ПАР N. vaccinii ІMB В-7405, синтезованих, згідно із запропонованим способом і прототипом. Культивування штаму ІMB В-7405 здійснюють як описано у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують технічний гліцерин у концентрації 23 г/л і 4 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 6 г/л і 0,5 % (об'ємна частка) технічного гліцерину. Тривалість культивування становить 120 і 168 год. на середовищі, що містить 23 г/л і 4 % (об'ємна частка) технічного гліцерину відповідно. Виділення ПАР і визначення антиадгезивних властивостей здійснюють як описано у прикладі 1. Дані щодо адгезії мікроорганізмів на абіотичних поверхнях після обробки ПАР, синтезованими в різних умовах культивування штаму ІMB В-7405 на технічному гліцерині, наведено у табл. 5. Таблиця 5 Антиадгезивні властивості ПАР N. vaccinii ІMB В-7405, синтезованих на технічному гліцерині Спосіб одержання ПАР Запропонований спосіб Прототип Матеріал пластик кахель сталь лінолеум пластик кахель сталь лінолеум В. subtilis БТ-2 (спори) 33 39 39 31 53 54 54 48 Адгезія, % Candida albicans Д6 45 43 42 43 65 63 57 58 Escherichia coli ІЕМ-1 30 35 37 30 55 56 55 45 20 25 Отже, використання для одержання інокуляту і біосинтезу ПАР технічного гліцерину у концентрації 5-7 і 22-24 г/л відповідно дає змогу одержати ПАР, після обробки розчинами яких абіотичних поверхонь адгезія мікроорганізмів на них знижується на 15-25 % (до 30-45 %) порівняно з застосуванням розчинів ПАР аналогічної концентрації, одержаних згідно з прототипом. 4 UA 110789 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii 1MB В-7405 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин, який відрізняється тим, що концентрація технічного гліцерину у середовищі для одержання інокуляту становить 5-7 г/л, а у середовищі для біосинтезу поверхнево-активних речовин - 22-24 г/л. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5