Спосіб застосування киснево-вуглекислотного середовища для анестезії осетрових риб

Реферат: Спосіб застосування киснево-вуглекислотного середовища для анестезії осетрових полягає в насиченні води, у якій перебуває риба, газовою сумішшю СO2 і O2. Газова суміш подається у співвідношенні 1:1 під тиском 0,2 атм, при температурі води 17 С, а припиняється подача газової суміші через 10-15 хв, після чого риба лягає на дно, її рух припиняється, коливання зябрових кришок стають малопомітними, зникає реакція на подразнення, у такому стані рибу витримують 1 год., для виходу з якого особин переносять в чисту воду де протягом 5-8 хв відновлюються їх фізіологічні функції. UA 111947 U (12) UA 111947 U UA 111947 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі аквакультури та може бути використана в іхтіологічних дослідженнях і рибництві при переведенні осетрових риб, зокрема стерляді, до гіпометаболічного стану для зниження стресу, упередження ушкоджень під час сортування, транспортування, а також проведення маніпуляцій, наприклад штучного запліднення, маркування, біометричної оцінки, біопсії, гормональної обробки тощо. Найбільш близьким аналогом є спосіб (Патент № 37303, опубл. 15.05.2001, Бюл. № 4, "Спосіб переведення та зберігання риби в стані штучного гіпобіозу і установка для його здійснення"), особливістю якого є використання установки для переведення та зберігання риби в стані вуглекислотного гіпобіозу, що полягає в насиченні водного середовища газовою сумішшю діоксиду вуглецю та кисню у співвідношенні 25…75 %: 75…25 %, доведенні рН води до 6,0…6,7 при плюсових значеннях температур. Недоліком аналога є необхідність створення спеціальної установки, використання газових сумішей в широкому діапазоні концентрацій, що потребує контролю рН води, особливо з підвищенням концентрації діоксиду вуглецю, та відсутності аналізу стосовно оцінки стану організму риб за даних умов. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу застосування кисневовуглекислотного середовища для анестезії осетрових риб, у якому переведення до гіпометаболічного стану особин, зокрема стерляді, зменшить чинник стресу за тривалого перебування в цьому стані, що доведено результатами біохімічних досліджень. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб застосування киснево-вуглекислотного середовища для анестезії осетрових риб полягає у насиченні води, в якій перебуває риба, газовою сумішшю СО2 і O2, згідно з пропонованим рішенням газова суміш подається у співвідношенні 1:1 під тиском 0,2 атм. при температурі води 17 °C, а припиняється подача газової суміші через 10-15 хв, після чого риба лягає на дно, її рух припиняється, коливання зябрових кришок стають малопомітними, зникає реакція на подразнення, у такому стані риб витримують 1 год., для виходу з якого особин переносять у чисту воду де протягом 5-8 хв відновлюються їх фізіологічні функції. Приклад. Для проведення досліджень використано стерлядь (Acipenser ruthenus), однорічного віку та вагою 180-200 г, яка мешкала в інкубаційному цеху. Рибу в кількості по 3 штуки розміщували в 3 акваріум з відстояною водою (50 дм ) та закривали скляною кришкою. Протягом 10-15 хв воду насичували сумішшю СО 2 і О2 під тиском 0,2 атм. при температурі води 17 °C. Балон містив газову суміш діоксиду вуглецю - кисень у співвідношенні 1:1. Риба лягала на дно, її рух припинявся, коливання зябрових кришок ставали малопомітними, зникала реакція на подразнення. У такому стані рибу витримували 1 год., для виведення з якого її переносили в чисту воду, де протягом 5-10 хв вона відновлювала фізіологічні функції. В подальшому риба знаходилась в басейні інкубаційного цеху, де протягом 1-2 місяців не спостерігали у неї фізіологічних змін. Зроблено біохімічний аналіз за впливу різних анестетиків на стерлядь: кисневовуглекислотного середовища та ефірної олії гвоздики. Стерлядь утримували в басейні інкубаційного цеху. Риби розділяли на групи (по 6 особин у кожній): 1-ша - контрольна, що не піддавалася впливу анестезії; 2-га - перебувала у киснево-вуглекислотному середовищі (1 год.); 3-тя - через 24 год. після перенесення із киснево-вуглекислотного середовища; 4-та - за дії ефірної олії гвоздики, яку додавали у воду в кількості 0,7 см/дм. Рибу утримували у цьому середовищі протягом 10 хв. Органолептична оцінка риби за перебування у киснево-вуглекислотному середовищі: добре виражена застиглість м'язів (брали рибу за середину тулуба, вона не згиналася), при натисканні пальцем в ділянці спинних м'язів ямка швидко зникала; луска у риби блискуча з перламутровим відтінком; слиз прозорий, без домішок крові та стороннього запаху; шкіра пружна, має природний колір, щільно прилягає до м'язів. плавники цілі, природного кольору; зяброві кришки щільно закривають зяброву порожнину; зябра вкриті тягучим, чистим, прозорим слизом, який мав запах сирої риби; очі випуклі, рогівка прозора; черевце не здуте, не осіле, не натягнуте, не рване, без плям; 1 UA 111947 U 5 10 15 м'язова тканина пружна, щільно прилягає до кісток, на поперечному розрізі спинні м'язи мали характерний для риби однорідний колір; без стороннього запаху, відчувався специфічний запах свіжої риби; внутрішні органи добре анатомічно виражені, природного кольору і структури, кишечник не здутий, без стороннього запаху. Дня біохімічних досліджень відбирали зразки тканин печінки та серця, а також кров, з якої одержували сироватку. Вимірювали біохімічні показники сироватки крові стерляді на спектрофотометричному аналізаторі. Результати досліджень представлено в Таблиці 1. За гіпокси-гіперкапнічного впливу встановлено зростання концентрації глюкози (в середньому на 28 %), що може бути пов'язане із загальним зниженням інтенсивності метаболічних процесів і зменшенням витрат глюкози. Вміст сечовини у крові, яка є кінцевим продуктом метаболізму білків у організмі, знижується у середньому на 26 %, що може бути пов'язане зі зменшенням утворення аміаку, внаслідок гальмування білкового обміну і розкладу білків та порушенням окисного дезамінування амінокислот. Вміст креатиніну - одного із кінцевих продуктів білкового обміну в організмі, також знижується. За виходу стерляді із гіпоксигіперкапнічного стану (3-група) рівень досліджуваних показників нормалізується (табл. 1). Таблиця 1 Біохімічні показники сироватки крові стерляді за досліду (М±m, n=6) Показники Сечовина, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Креатинін, мкмоль/л Загальний білок г/л Альбумін, г/л АЛТ, Од/л ЛФ, Од/л ГГТ, Од/л ACT, Од/л рН крові АСТ/АЛТ 1-група (контроль) М±m 4,7±1,3 5,7±4,5 69,1±6,5 41,4±2,7 10,8±1,4 11,9±1,8 235,8±26,7 18,3±0,7 362,1±28,3 7,71±0,09 30,4 2-група М±m 3,5±0,2* 7,3±1,3* 62,5±5,2 42,5±4,5 11,0±0,9 16,9±1,4* 214,7±21,6 15,4±0,5* 317,0±25,6* 7,29±0,08 18,8 % 74 128 90 103 102 142 91 84 88 95 3-група М±m 4,1±0,2 6,3±1,2 68,5±6,21 39,4±1,3 9,5±0,7 12,4±1,3 241,1±26,5 18,2±1,8 376,1±38,3 7,61±0,03 30,3 4-група % М±m % 87 4,4±1,3 92 110 4,7±1,5* 82 99 66,1±6,5 95 95 43,4±3,5 107 88 11,5±0,9 103 105 18,2±1,4* 153 102 245,8±21,5 98 100 17,9±1,1 98 104 452,1±28,3* 125 99 7,65±0,03 99 25,1 * - Р0,05 відносно контролю. 20 25 30 35 40 Активність клітинних ферментів у сироватці крові є низькою у порівнянні з їх активністю у клітинах. Аналіз отриманих результатів свідчить, що у гіпокси-гіперкапнічному стані зниження активності ферментів аспартатамінотрансферази (ACT), гамма-глутамілтрансферази (ГГТ), лужної фосфатази (ЛФ) сироватки крові стерляді характеризує зменшення інтенсивності обмінних процесів. Активність ферментів сироватки крові, особливо амінотрансфераз, є чутливим індикатором до дії різних чинників, що може бути використано для оцінки фізіолого-біохімічного стану риб. Органоспецифічні амінотрансферази (АЛТ та ACT) приймають участь в реакціях трансамінування та є зв'язуючою ланкою між вуглеводним та білковим обмінами. Зниження активності ACT (у середньому на 12 %) поряд зі зростанням активності АЛТ (на 42 %), що призводить до зниження величини коефіцієнта деРітіса (співвідношення АСТ/АЛТ), може мати регуляторний характер за гіпокси-гіперкапнічного стану. Подібні дослідження біохімічних показників сироватки крові риб проведено за дії анестетика - ефірної олії гвоздики. Встановлено лише зниження вмісту глюкози (у середньому на 18 %), одночасне зростання активності ACT (на 25 %) та АЛТ (на 53 %), що можна розглядати як стрес-реакцію на дію чинника, оскільки співвідношення АСТ/АЛТ майже не відрізняється щодо контролю (табл. 1). Порівняльний аналіз отриманих результатів свідчить про відсутність патологічних змін організму риб при застосуванні як киснево-вуглекислотного середовища, так і ефірної олії гвоздики. Окисні процеси в тканинах стерляді за умов досліду 2 UA 111947 U 5 10 15 Для клітин організму характерно утворення активних форм кисню (АФК) із залученням нуклеїнових кислот, білків, ліпідів. Дія на організм несприятливих чинників призводить до зростання накопичення в тканинах АФК, а порушення балансу між продукцією АФК і механізмами антиоксидантного контролю за їх змістом обумовлює прояв окисного стресу в клітинах. Дослідження інтенсивності окисних процесів проводили шляхом визначення у печінці і серці стерляді вмісту тіобарбітурат-активних продуктів (ТБК АП), які утворюються на кінцевих етапах (при розпаді гідропероксидів ліпідів) пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ). Встановлено, що за гіпокси-гіперкапнічного впливу у печінці і серці вміст ТБК АП вірогідно зменшується в середньому на 20 і 19 % відповідно у порівнянні з контролем, що свідчить про пригнічення окисних процесів в тканинах, а за виходу із цього стану цей показник не відрізняється від контрольних значень. За дії ефірної олії гвоздики встановлено зростання вмісту ТБК АП в тканинах печінки та серця в середньому на 18 і 19 % відповідно у порівнянні з контролем (табл. 2), що характеризує активацію окисних процесів та, ймовірно, виступає як стрес - реакція. Таблиця 2 Вміст тирбарбітурат-активних продуктів (ТБК АП) у тканинах стерляді (М±m, n=6) Показник, ТБК АП Печінка Вміст, нмоль/мг Серце 1- група (контроль) 1,02±0,11 2,12±0,14 2-група 0,82±0,07* 1,72±0,11* 3- група 0,96±0,08 2,0±0,1 4- група 1,18±0,12* 2,52±0,11* *-Р0,05 відносно контролю. 20 25 30 35 Вміст жирних кислот сироватки крові стерляді за умов досліду Ліпіди крові екстрагували хлороформ-метаноловою сумішшю за методом Фольча та проводили гідроліз і метилювання жирних кислот (ЖК). Газовохроматографічний аналіз метилових етерів ЖК проводили на газовому хроматографі з полум'яно-іонізаційним детектором. Жирні кислоти ідентифікували за допомогою стандартного зразка, а їх кількісну оцінку проводили методом нормування площин піків хроматографи метильованих похідних ЖК і визначали їхній вміст у відсотках. У результаті проведених досліджень отримано хроматограми ЖК ліпідів. У зразках ідентифіковані міристинова, міристолеїнова, пальмітинова, пальмітолеїнова, стеаринова, олеїнова, лінолева, ліноленова, арахінова та ін. кислоти (табл. 3), які являють собою насичені жирні кислоти (НЖК) та ненасичені жирні кислоти (ННЖК). Сумарний рівень ННЖК вищий НЖК (коефіцієнт насиченості становить 0,36). За умов досліду жирнокислотний спектр ліпідів сироватки крові не відрізняється від контролю, однак спостерігається перерозподіл вмісту ЖК. За гіпокси-гіперкалнічного впливу серед НЖК найбільше змінюється вміст арахінової кислоти С20:0 (знижується на 41 %). Серед моноєнових ННЖК незначно зменшується вміст олеїнової кислоти (на 14 %). Важливе значення для риб має ерукова кислота С22:1, зростання вмісту якої пов'язують із загибеллю організму, її вміст в умовах досліду не змінюється. 3 UA 111947 U Таблиця 3 Вміст жирних кислот у сироватці крові стерляді в контролі та за умов досліду (М±m, n=5) Жирна кислота С12:0 С14:0 С15:0 С16:0 С16:1 С17:0 С18:0 С18:1 С:18:2ω6 С18:3ω6 С18:3ω3 С20:0 С20:1 С20:4ω6 С21:0 С22:0 С22:1 С22:2ω6 С22:5ω3 С22:6ω3 ΣНЖК ΣІННЖК ΣМоноєнові ННЖК ΣПолієнові ННЖК Σω-3 Σω-6 ω-3/ω-6 1 - група (контроль) 0,02±0,01 1,94±0,02 0,19±0,01 16,95±0,31 2,82±0,02 0,49±0,02 4,21±0,03 29,52±0,04 23,96±0,13 2,16±0,03 0,84±0,01 2,05±0,05 2,10±0,02 0,62±0,13 0,63±0,01 0,05±0,01 3,27±0,02 2,11±0,01 0,52±0,01 5,55±0,04 26,53±1,34 73,47±4,12 37,71±2,11 35,76±1,33 6,91±0,66 28,85±1,66 0,24 2 - група 0,01±0,01 2,09±0,01 0,19±0,01 16,05±0,21 2,66±0,03 0,50±0,01 4,68±0,03* 25,45±0,3* 30,32±0,15* 2,15±0,01 0,65±0,03* 1,20±0,01* 2,28±0,01 0,47±0,01* 0,60±0,01 0,07±0,01 3,38±0,03 2,29±0,02 0,51±0,01 4,65±0,04* 25,39±1,55 74,61±3,65 33,77±1,46 41,04±2,11* 5,81±0,26 35,23±2,26 0,16 3 - група 0,01±0,01 1,99±0,01 0,18±0,01 16,65±0,21 2,76±0,03 0,50±0,01 4,48±0,02 28,05±0,30 27,32±0,15* 2,13±0,01 0,75±0,03 1,80±0,01* 2,20±0,01 0,57±0,01 0,61±0,01 0,07±0,01 3,30±0,03 2,25±0,02 0,51±0,01 5,00±0,04 26,29±1,51 72,55±2,65 36,31±1,36 38,53±1,51 6,26±0,24 32,27±2,16 0,19 4 - група 0,03±0,01 2,42±0,01 0,20±0,01 16,29±0,21 2,26±0,01* 0,47±0,01 4,11±0,01 28,67±0,41 26,51±0,14 2,44±0,01* 0,72±0,01 1,34±0,03* 2,4±0,03* 0,55±0,01* 0,66±0,01 0,06±0,01 3,26±0,01 2,10±0,01 0,54±0,01 4,97±0,04 * 25,68±1,96 74,32±3,16 36,59±2,11 37,76±2,66 6,21±0,41 31,61±1,91 0,20 * - Р0,05 відносно контролю. 5 10 15 20 Такі полієнові ННЖК - лінолева та ліноленова - не синтезуються в організмі, але дуже важливі як попередники інших кислот. Вміст першої зростає на 27 % (можливо за рахунок пригнічення метаболізму). Важливими для росту риб є докозопентаєнова С22:5ω3 та докозагексаєнова С22:6ω3 кислоти, вміст останньої знижується на 16 % (див. табл. 3). Співвідношення НЖК/ННЖК не міняється. Водночас, змінюється сумарний вміст со-3 кислот (5,81±0,26 відносно 6,91±0,66 % в контролі, Р