Спосіб одержання комплексу полісахаридів з мембраностабілізуючою та імуномоделюючою дією

1. Спосіб одержання комплексу полісахаридів з мембраностабілізуючою та імуномоделюючою C2 2 (19) 1 3 87066 4 біологічно активних речовин, а з іншого, - потребує Поставлене завдання вирішується наступним певних енергетичних затрат на підтримання такої чином. У способі одержання комплексу полісахатемператури всього часу екстракції. ридів з мембраностабілізуючою та імуномоделююВідомий також спосіб одержання полісахаричою дією, що включає багаторазову екстракцію дів гемостатичної та протизапальної дії [2] шляхом рослинної сировини водою, упарювання сумарного екстракції листя акації білої водою при температуекстракту, висадження спиртом етиловим, фільтрі 90°С та співвідношенні сировина: екстрагент рацію, повторну обробку відокремленого осаду 1:14-15. екстракцію проводять протягом 2-3 годин спиртом етиловим та сушку, згідно з винаходом при перемішуванні та постійній температурі 90°С. передбачено, що в якості рослинної сировини виОдну й ту ж порцію сировини екстрагують принайкористовують траву фіалки, екстракцію проводять мні двічі аналогічним чином. Об'єднані зливи упаметодом настоювання при кімнатній температурі рюють до 1/15 початкового об'єму, в упарений екста загальному співвідношенні сировини до екстратракт додають трикратну кількість 95% спирту генту 1:17, упарювання здійснюють до 1/25-1/30 етилового і залишають на добу до повного висапопереднього об'єму сумарного екстракту, відодження. Осад відфільтровують, промивають спиркремлений осад додатково розчиняють у воді та том етиловим, сушать і подрібнюють. Вихід готоочищують висадженням 96% спиртом етиловим. вого продукту 5,5 - 7 % від повітряно сухої Винаходом передбачено, що екстракцію однієї сировини. порції сировини здійснюють 3 рази по 12 годин Недоліком відомого способу, як і у поперекожний, причому першу екстракцію проводять при дньому випадку, можна вважати проведення екстспіввідношенні сировина: екстрагент 1:7, а решту ракції при температурі 90°С, що викликає руйнупри співвідношенні сировина: екстрагент 1:5. вання частини чутливих до високої температури В офіційній та народній медицині трава фіалки біологічно активних речовин та потребує додатковідома як відхаркуючий, протизапальний, потогінвих витрат енергії на підігрів екстрагента і підтриний та сечогінний засіб [3], який входить, зокрема, мання постійної температури у екстракційному до складу грудних та сечогінних зборів. реакторі. До того ж спосіб забезпечує низький виЗаявлений спосіб дозволяє вилучити з трави хід готового продукту. фіалки біологічно активні речовини, які мають неЗавданням винаходу є створення способу відому досі мембраностабілізуючу та імуномодеодержання комплексу полісахаридів з мембранослюючу дію, вперше досліджену авторами. табілізуючою та імуномоделюючою дією, який, Всі параметри заявленого способу визначені завдяки використанню в якості сировини трави експериментальним шляхом в результаті провефіалки і проведення екстракції водою кімнатної дення численних дослідів. температури при заданих умовах, дозволяє одерВибір екстрагенту здійснювали за критерієм жати субстанцію з вираженою фармакологічною виходу екстрактивних речовин в екстрактах, вилудією, на основі якої може бути створений ряд фачених з трави фіалки, та наявності у цих екстрактів рмацевтичних засобів у різних лікарських формах, очікуваної фармакологічної дії. В якості можливих придатних до ефективного та безпечного тривалоекстрагентів були досліджені вода та спирт етилого вживання з лікувально-профілактичною метою вий від 30 % до 70 %. Результати досліджень напацієнтами різних вікових груп. ведені у таблиці 1. Таблиця 1 Вміст екстрактивних речовин, вилучених з трави фіалки різними екстрагентами в досліджуваній сировині (m=5, у перерахунку на абсолютно суху сировину) Вид сировини Трава фіалки вода 40,21±1,43 Вміст екстрактивних речовин 30% спирт 40% спирт 50% спирт 39,02±1,23 36,08+1,33 33,52+1,15 За даними таблиці 1 кращим екстрагентом для трави фіалки за вмістом екстрактивних речовин є вода. Авторами було досліджено, що неочевидну мембраностабілізуючу та імуномоделюючу дію проявляє комплекс полісахаридів трави фіалки, який входить до складу екстрактивних речовин, вилучених з сировини водою. Експериментальним шляхом було визначено інші ознаки заявленого способу: співвідношення сировини до екстрагенту, час, кратність та температура екстракції. Оптимальні умови здійснення заявленого способу при використанні води, як екстрагенту, визначені за збалансованою сукупністю суттєвих ознак, яка забезпечує високий вихід кінцевого продукту і є економічно доцільною. Фраг 60% спирт 31,42+1,18 70% спирт 28,08±1,19 мент численних варіантів дослідів наведений у таблиці 2. Згідно даних таблиці 2 в перших трьох дослідах проводили визначення оптимальної кратності зливів екстракту. Найбільший вихід комплексу полісахаридів був отриманий при кратності 4, але з огляду на економічність та майже однаковий вихід продукту при кратності 3 (різниця складала 0,15%), оптимальною була обрана кратність зливів 3. Наступним обирали співвідношення сировини до екстрагенту. Найбільш продуктивним за виходом комплексу полісахаридів було співвідношення 1:20. Але, з огляду на збільшення об'єму отриманого екстракту та витрат на його концентрування, оптимальним було обрано співвідношення сировини до екстрагенту 1:17. Для обрання найкращого температурного режиму екстракції для вилучення 5 87066 6 комплексу полісахаридів було отримано результальною температурою екстракції було обрано 25°С ти, які показують, що збільшення температури (кімнатна). Подовження часу екстракції також сутсуттєво не впливає на вихід комплексу полісахатєво не впливало на вихід комплексу полісахариридів. Тому, зважаючи на додаткові витрати на дів, тому оптимальним часом було обрано 12 гопідтримання температури 90°С та 60°С, оптимадин. Таблиця 2 Визначення оптимальних умов здійснення заявленого способу при використанні води в якості екстрагенту Ознаки способу № співвідношення сировина: час настою- кратність п/п екстрагент вання зливів 1 1:15 12 2 2 1:15 12 3 3 1:15 12 4 4 1:5 12 3 5 1:10 12 3 6 1:17 12 3 7 1:20 12 3 8 1:17 12 3 9 1:17 12 3 10 1:17 24 3 Таким чином, оптимальними ознаками заявленого способу можна вважати: співвідношення сировини до екстрагенту 1:17, час екстракції 12 годин, кратність екстракції 3, температура 25°С (кімнатна). Згідно з заявленим способом висадження комплексу полісахаридів з одержаного після трикратної екстракції сумарного упареного екстракту здійснюють спочатку 2-3 кратною кількістю 96% спирту етилового, а очищення кінцевого продукту здійснюють переосадженням з водного розчину відфільтрованого осаду 3-5 кратною кількістю 96% спирту етилового, що дозволяє одержувати кінцевий продукт з економічно доцільним виходом і високим ступенем очищення. На стадії першої екстракції передбачено збільшення кількості екстрагенту з урахуванням коефіцієнту його поглинання сировиною, наступні дві екстракції проводять при визначеному вище оптимальному для даного способу співвідношенні сировина: екстрагент 1:5. Загальне співвідношення для здійснення трикратної екстракції до оптимального виснаження сировини становить 1:17. Експериментальним шляхом було визначено, що упарювання (концентрування) сумарного рідкого екстракту доцільно здійснювати до 1/25 - 1/30 попереднього об'єму, що дозволяє надалі зменшити витрати 96% спирту етилового на висадження комплексу полісахаридів. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Повітряно суху траву фіалки помішують в екстрактор, заливають водою і екстрагують методом настоювання 12 годин при кімнатній температурі. Одержаний екстракт (при співвідношенні сировина: екстрагент 1:7) зливають, а сировину ще двічі екстрагують за аналогічних умов при співвідношенні сировина: екстрагент 1:5. Екстракти об'єднують і концентрують бажано у вакуумі до 1/25 1/30 попереднього об'єму. Висадження комплексу полісахаридів здійснюють 2-3 кратною кількістю Температура 25 25 25 25 25 25 25 60 90 25 Вихід комплексу полісахаридів у % від абсолютно сухої сировини 6,12 9,97 10,08 4,24 5,68 11,07 11,13 11,21 11,65 11,23 96% спирту етилового. Одержаний осад відокремлюють фільтрацією бажано на нутч-фільтрі, розчиняють водою і знов осаджують 3-5 кратною кількістю 96% спирту етилового. Очищений осад знов відокремлюють фільтрацією і піддають сушці. Вихід готового продукту становить 6-11% від маси повітряно сухої сировини. Готовий продукт одержують у вигляді порошку світло коричневого кольору без запаху. Продукт добре розчинний в гарячій воді, розчинний в воді, нерозчинний в хлороформі, 96% спирті етиловому та ацетоні. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. В екстракторі 100кг повітряно сухої трави фіалки залили екстрагентом (з урахуванням коефіцієнту водопоглинання сировини), екстрагували методом настоювання протягом 12 годин при кімнатній температурі. Отриманий екстракт злили в обсязі 700л. Сировину знову залили 500 л води та настоювали протягом 12 годин, отриманий екстракт злили. Сировину ще раз залили 500 л води та екстрагували протягом 12 годин, отриманий екстракт знову злили. Об'єднані витяги концентрували у вакуумі до об'єму 70 л (до 1/25 попереднього об'єму). Потім проводили висадження комплексу полісахаридів двократним об'ємом 96 % спирту етилового. Отриманий осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі, розчиняли його в 10 л води та висаджували трикратним об'ємом 96% спирту етилового. Осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі та висушували в сушарці. Вихід цільового продукту склав 6 % від маси повітряно сухої сировини. Приклад 2. В екстракторі 100 кг повітряно сухої трави фіалки залили екстрагентом (з урахуванням коефіцієнту водопоглинання сировини), екстрагували методом настоювання протягом 12 годин при кімнатній температурі. Отриманий екстракт злили в обсязі 700л. Сировину знову залили 500 л води та настоювали протягом 12 годин, 7 87066 8 отриманий екстракт злили. Сировину ще раз залиня комплексу полісахаридів трикратним об'ємом ли 500 л води та екстрагували протягом 12 годин, 96 % спирту етилового. Отриманий осад відокреотриманий екстракт знову злили. Об'єднані витяги млювали фільтрацією на нутч-фільтрі, розчиняли концентрували у вакуумі до об'єму 70 л (до 1/25 його в 10 л води та висаджували п'ятикратним попереднього об'єму). Потім проводили висадженоб'ємом 96% спирту етилового. Осад відокремлюня комплексу полісахаридів трикратним об'ємом вали фільтрацією на нутч-фільтрі та висушували в 96 % спирту етилового. Отриманий осад відокресушарці. млювали фільтрацією на нутч-фільтрі, розчиняли Вихід цільового продукту склав 11% від маси його в 10 л води та висаджували чотирикратним повітряно сухої сировини. об'ємом 96 % спирту етилового. Осад відокремПриклад 4. Вивчення мембраностабілізуючої лювали фільтрацією на нутч-фільтрі та висушуваактивності комплексу полісахаридів, одержаного ли в сушарці. за заявленим способом, визначали за допомогою Вихід цільового продукту склав 10 % від маси удосконаленого стандартного методу Шрека. повітряно сухої сировини. Для цього у пробірки вносили у рівних об'ємах Приклад 3. В екстракторі 100 кг повітряно суклітинні зависі кісткового мозку пацюків (з конценхої трави фіалки залили екстрагентом (з урахутрацією 240000 клітин в 1 мл) та 1 мл 1% розчину ванням коефіцієнту водопоглинання сировини), тетрацикліну. У контрольну серію додавали рівний екстрагували методом настоювання протягом 12 об'єм фізіологічного розчину, до дослідної - рівний годин при кімнатній температурі. Отриманий екстоб'єм 2% розчину комплексу полісахаридів, одерракт злили в обсязі 700л. Сировину знову залили жаного за заявленим способом, з попередньою 500 л води та настоювали протягом 12 годин, розтитровкою. Час експозиції становив 15 хвил. отриманий екстракт злили. Сировину ще раз залиБула використана модель, на тлі якої тестувалися ли 500 л води та екстрагували протягом 12 годин, препарати порівняння: преднізолон, ессенціале, отриманий екстракт знову злили. Об'єднані витяги які мають мембраностабілізуючу дію. концентрували у вакуумі до об'єму 56л (до 1/30 Результати наведені у таблиці 3. попереднього об'єму). Потім проводили висадженТаблиця 3 Вивчення мембраностабілізуючої дії комплексу полісахаридів з трави фіалки, одержаного за заявленим способом у порівнянні з референспрепаратами (m=5) № п/п 1 2 3 4 5 Варіанти дослідів Комплекс полісахаридів трави фіалки Тетрациклін Ессенціале Преднізолон Контроль (нативний стан) Кількість живих клітин Мембраностабілізуюча активність, % 70,6±0,8 21,4±0,8 49,2±0,5 72,8±0,6 23,6±0,8 84,3±0,8 35,1±0,9 95,8±0,7 Згідно даних таблиці 3, комплекс полісахаридів з трави фіалки, одержаний за заявленим способом, має виражену мембраностабілізуючу дію, яка проявляється на рівні ессенціале та поступається преднізолону. Приклад 5. Вивчення імуномоделюючої дії комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, вивчали на стандартній моделі спонтанного розеткоутворення лімфоцитів людини з еритроцитами барану. Гепаринізовану кров, яка була взята з ліктевої вени, розводили розчином Рінгера у співвідношенні 1:2, нашаровували на градієнт густини фікол-верографін (1,077) та центрифугували 15 хвилин при 300об/хв. Отримане лімфоцитарне кільце переносили у градуйовану центрифужну пробірку та відмивали фізіологічним розчином, отримували чисту завись лімфоцитів людини. Для роботи підготовували необхідну концентрацію лімфоцитів - 2×106 клітин в 1мл та робили розведення комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%, 0,62%, 0,5%, 0,3%. В якості порівняння були використані зразки препаратів рекутан та настоянки ехінацеї. До 1 мл чистої зависі лімфоцитів додавали 0,02 мл розведеного розчину комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, та препаратів порівняння, інкубували протягом 15 хвилин при температурі 37°С. Потім додавали 0,1мл 1% зависі еритроцитів барана, інкубували протягом 10 хвилин при температурі 37°С. Припинення реакції проводили шляхом центрифугування протягом 2 хвилин при 1500об/хв. В якості критеріїв оцінки вибрано кількість лімфоцитів та розеткоутворюючих клітин. Результати дослідів наведено у таблиці 4. 9 87066 10 Таблиця 4 Вивчення імуномоделюючої дії комплексу полісахаридів з трави фіалки, одержаного за заявленим способом у порівнянні з референс-препаратами (m=5) № п/п 1 2 3 4 Експериментальні зразки Комплекс полісахаридів трави фіалки Рекутан Настоянка ехінацеї Контроль Т-РУК Кількість лімфоцитів та розеткоутворюючих клітин Розведення експериментальних зразків, % 10,0 5,0 2,5 1,25 0,62 0,5 0,3 36,8±0,2 44,2±0,4 46,0±0,2 46,5±0,4 48,6±0,4 62,7±0,4 55,7±0,4 60,6±0,5 66,1±0,3 59,5±0,6 Примітка: - - визначення не проводили Дані табл. 4 свідчать про наявність вираженої імуномоделюючої активності комплексу полісахаридів з трави фіалки, одержаного за заявленим способом, який у розведенні 0,5% перевищує аналогічну дію рекутану. Таким чином, заявлено новий спосіб одержання комплексу полісахаридів мембраностабілізуючої та імуномоделюючої дії з трави фіалки, який передбачає використання доступних реактивів та достатньої вітчизняної сировинної бази. Спосіб є простим, економічним і може бути здійснений на стандартному обладнанні хімікофармацевтичних підприємств. Заявлений спосіб забезпечує одержання біологічно активної субстанції з вираженою мембраностабілізуючою та імуномоделюючою дією без побічних ефектів, нетоксичної, яка може бути використана як діюча сировина у лікарських препаратах, виконаних у Комп’ютерна верстка В. Мацело різних лікарських формах і придатних до тривалого вживання пацієнтами різних вікових груп. Заявлений спосіб запобігає руйнуванню екстрагованих термолабільних речовин, забезпечує одержання очищеного готового продукту з економічно доцільним виходом. Джерела інформації 1. Патент на винахід 24032, Україна, МПК 6 А61К35/78, заявл. 28.12.95, опубл. 31.08.98, Бюл. №4. 2. Патент на корисну модель 23647, Україна, МПК (2006) А61К36/00, заявл. 19.10.2006, опубл.11.06.2007, Бюл. №8. 3. Е.И. Светличная, И.А. Толок Этимологический словарь латинских ботанических названий лекарственных растений. Харьков. Изд-во НФаУ «Золотые страницы», 2003, С.252. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601