Спосіб одержання комплексу полісахаридів з мембраностабілізуючою та імуномодулюючою дією

1. Спосіб одержання комплексу полісахаридів з мембраностабілізуючою та імуномодулюючою дією, що включає багаторазову екстракцію рослинної сировини водою з подальшим упарюванням сумарного екстракту, висадження спиртом етиловим, фільтрацію, обробку відокремленого 3 34709 екстракції листя акації білої водою при температурі 90°С та співвідношенні сировина: екстрагент 1:14-15. екстракцію проводять протягом 2-3 годин при перемішуванні та постійній температурі 90°С. Одну й ту ж порцію сировини екстрагують принаймні двічі аналогічним чином. Об'єднані зливи упарюють до 1/15 початкового об'єму, в упарений екстракт додають трикратну кількість 95% спирту етилового і залишають на добу до повного висадження. Осад відфільтровують, промивають спиртом етиловим, сушать і подрібнюють. Вихід готового продукту 5,5-7% від повітряно сухої сировини. Недоліком відомого способу, як і у попередньому випадку, можна вважати проведення екстракції при температурі 90°С, що викликає руйнування частини чутливи х до високої температури біологічно активних речовин та потребує додаткових витрат енергії на підігрів екстрагента і підтримання постійної температури у екстракційному реакторі. До того ж спосіб забезпечує низький вихід го тового продукту. Завданням корисної моделі є створення способу одержання комплексу полісахаридів з мембраностабілізуючою та імуномоделюючою дією, який, завдяки використанню в якості сировини трави фіалки і проведення екстракції водою кімнатної температури при заданих умовах, дозволяє одержати субстанцію з вираженою фармакологічною дією, на основі якої може бути створений ряд фармацевтичних засобів у різних лікарських формах, придатних до ефективного та безпечного тривалого вживання з лікувально-профілактичною метою пацієнтами різних вікових груп. Поставлене завдання вирішується наступним чином. У способі одержання комплексу полісахаридів з мембраностабілізуючою та імуномоделюючою дією, що включає багаторазову екстракцію рос 4 линної сировини водою, упарювання сумарного екстракту, висадження спиртом етиловим, фільтрацію, повторну обробку відокремленого осаду спиртом етиловим та сушку, згідно з корисною моделлю передбачено, що в якості рослинної сировини використовують траву фіалки, екстракцію проводять методом настоювання при кімнатній температурі та загальному співвідношенні сировини до екстрагенту 1:17, упарювання здійснюють до 1/25-1/30 попереднього об'єму сумарного екстракту, відокремлений осад додатково розчиняють у воді та очищують висадженням 96% спиртом етиловим. Корисною моделлю передбачено, що екстракцію однієї порції сировини здійснюють 3 рази по 12 годин кожний, причому першу екстракцію проводять при співвідношенні сировина: екстрагент 1:7, а решту – при співвідношенні сировина:екстрагент 1:5. В офіційній та народній медицині трава фіалки відома як відхаркуючий, протизапальний, потогінний та сечогінний засіб [3], який входить, зокрема, до складу грудни х та сечогінних зборів. Заявлений спосіб дозволяє вилучити з трави фіалки біологічно активні речовини, які мають невідому досі мембраностабілізуючу та імуномоделюючу дію, вперше досліджену авторами. Всі параметри заявленого способу визначені експериментальним шляхом в результаті проведення численних дослідів. Вибір екстрагенту здійснювали за критерієм виходу екстрактивних речовин в екстрактах, вилучених з трави фіалки, та наявності у цих екстрактів очікуваної фармакологічної дії. В якості можливих екстрагентів були досліджені вода та спирт етиловий від 30% до 70%. Результати досліджень наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Вміст екстрактивних речовин, вилучених з трави фіалки різними екстрагентами в досліджуваній сировині (m=5, у перерахунку на абсолютно суху сировину) Вид сировини Трава фіалки вода 40,21±1,43 30% спирт 39,02±1,23 Вміст екстрактивних речовин % 40% спирт 50% спирт 60% спирт З6,08±1,33 33,52±1,15 31,42+1,18 За даними таблиці 1 кращим екстрагентом для трави фіалки за вмістом екстрактивних речовин є вода. Авторами було досліджено, що неочевидну мембраностабілізуючу та імуномоделюючу дію проявляє комплекс полісахаридів трави фіалки, який входить до складу екстрактивних речовин, вилучених з сировини водою. Експериментальним шляхом було визначено інші ознаки заявленого способу: співвідношення сировини до екстрагенту, час, кратність та температура екстракції. Оптимальні умови здійснення заявленого способу при використанні води, як екстрагенту, визначені за збалансованою сукупністю суттєвих ознак, яка забезпечує високий вихідкінцевого продукту і є економічно доцільною. Фраг 70% спирт 28,08±1,19 мент численних варіантів дослідів наведений у таблиці 2. Згідно даних табл. 2 в перших трьох дослідах проводили визначення оптимальної кратності зливів екстракту. Найбільший вихід комплексу полісахаридів був отриманий при кратності 4, але з огляду на економічність та майже однаковий вихід продукту при кратності 3 (різниця складала 0,15%), оптимальною була обрана кратність зливів 3. Наступним обирали співвідношення сировини до екстрагенту. Найбільш продуктивним за виходом комплексу полісахаридів було співвідношення 1:20. Але, з огляду на збільшення об'єму отриманого екстракту та витрат на його концентрування, оптимальним було обрано співвідношення сировини до екстрагенту 1:17. Для обрання найкращого температурного режиму екстракції для вилучення 5 34709 комплексу полісахаридів було отримано результати, які показують, що збільшення температури суттєво не впливає на вихід комплексу полісахаридів. Тому, зважаючи на додаткові витрати на підтримання температури 90°С та 60°С, оптима 6 льною температурою екстракції було обрано 25°С (кімнатна). Подовження часу екстракції також суттєво не впливало на вихід комплексу полісахаридів, тому оптимальним часом було обрано 12 годин. Таблиця 2. Визначення оптимальних умов здійснення заявленого способу при використанні води в якості екстрагенту № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. співвідношення сировина:екстрагент 1:15 1:15 1:15 1:5 1:10 1:17 1:20 1:17 1:17 1:17 Ознаки способу час настою- кратність зливів температура вання 12 2 25 12 3 25 12 4 25 12 3 25 12 3 25 12 3 25 12 3 25 12 3 60 12 3 90 24 3 25 Таким чином, оптимальними ознаками заявленого способу можна вважати: співвідношення сировини до екстрагенту 1:17., час екстракції 12 годин, кратність екстракції 3, температура 25°С (кімнатна). Згідно з заявленим способом висадження комплексу полісахаридів з одержаного після трикратної екстракції сумарного упареного екстракту здійснюють спочатку 2-3 кратною кількістю 96% спирту етилового, а очищення кінцевого продукту здійснюють переосадженням з водного розчину відфільтрованого осаду 3-5 кратною кількістю 96% спирту етилового, що дозволяє одержувати кінцевий продукт з економічно доцільним виходом і високим ступенем очищення. На стадії першої екстракції передбачено збільшення кількості екстрагенту з урахуванням коефіцієнту його поглинання сировиною, наступні дві екстракції проводять при визначеному вище оптимальному для даного способу співвідношенні сировина: екстрагент 1:5. Загальне співвідношення для здійснення трикратної екстракції до оптимального виснаження сировини становить 1:17. Експериментальним шляхом було визначено, що упарювання (концентрування) сумарного рідкого екстракту доцільно здійснювати до 1/25 - 1/30 попереднього об'єму, що дозволяє надалі зменшити витрати 96% спирту етилового на висадження комплексу полісахаридів. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Повітряно суху траву фіалки поміщують в екстрактор, заливають водою і екстрагують методом настоювання 12 годин при кімнатній температурі. Одержаний екстракт (при співвідношенні сировина: екстрагент 1:7) зливають, а сировину ще двічі екстрагують за аналогічних умов при співвідношенні сировина: екстрагент 1:5. Екстракти об'єднують і концентрують бажано у вакуумі до 1/251/30 попереднього об'єму. Висадження комплексу Вихід комплексу полісахаридів у % від абсолютно сухої сировини 6,12 9,97 10,08 4,24 5,68 11,07 11,13 11,21 11,65 11,23 полісахаридів здійснюють 2-3 кратною кількістю 96% спирту етилового. Одержаний осад відокремлюють фільтрацією бажано на нутч-фільтрі, розчиняють водою і знов осаджують 3-5 кратною кількістю 96% спирту етилового. Очищений осад знов відокремлюють фільтрацією і піддають сушці. Вихід готового продукту становить 6-11% від маси повітряно сухої сировини. Готовий продукт одержують у вигляді порошку світло коричневого кольору без запаху. Продукт добре розчинний в гарячій воді, розчинний в воді, нерозчинний в хлороформі, 96% спирті етиловому та ацетоні. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. В екстракторі 100кг повітряно сухої трави фіалки залили екстрагентом (з урахуванням коефіцієнту водопоглинання сировини), екстрагували методом настоювання протягом 12 годин при кімнатній температурі. Отриманий екстракт злили в обсязі 700л. Сировину знову залили 500л води та настоювали протягом 12 годин, отриманий екстракт злили. Сировину ще раз залили 500л води та екстрагували протягом 12 годин, отриманий екстракт знову злили. Об'єднані витяги концентрували у вакуумі до об'єму 70л (до 1/25 попереднього об'єму). Потім проводили висадження комплексу полісахаридів двократним об'ємом 96% спирту етилового. Отриманий осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі, розчиняли його в 10л води та висаджували трикратним об'ємом 96 % спирту етилового. Осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі та висушували в сушарці. Вихід цільового продукту склав 6% від маси повітряно сухої сировини. Приклад 2. В екстракторі 100кг повітряно сухої трави фіалки залили екстрагентом (з урахуванням коефіцієнту водопоглинання сировини), екстрагували ме 7 34709 тодом настоювання протягом 12 годин при кімнатній температурі. Отриманий екстракт злили в обсязі 700л. Сировину знову залили 500л води та настоювали протягом 12 годин, отриманий екстракт злили. Сировину ще раз залили 500л води та екстрагували протягом 12 годин, отриманий екстракт знову злили. Об'єднані витяги концентрували у вакуумі до об'єму 70л (до 1/25 попереднього об'єму). Потім проводили висадження комплексу полісахаридів трикратним об'ємом 96% спирту етилового. Отриманий осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі, розчиняли його в 10л води та висаджували чотирикратним об'ємом 96% спирту етилового. Осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі та висушували в сушарці. Вихід цільового продукту склав 10% від маси повітряно сухої сировини. Приклад 3. В екстракторі 100кг повітряно сухої трави фіалки залили екстрагентом (з урахуванням коефіцієнту водопоглинання сировини), екстрагували методом настоювання протягом 12 годин при кімнатній температурі. Отриманий екстракт злили в обсязі 700л. Сировину знову залили 500л води та настоювали протягом 12 годин, отриманий екстракт злили. Сировину ще раз залили 500л води та екстрагували протягом 12 годин, отриманий екстракт знову злили. Об'єднані витяги концентру 8 вали у вакуумі до об'єму 56л (до 1/30 попереднього об'єму). Потім проводили висадження комплексу полісахаридів трикратним об'ємом 96% спирту етилового. Отриманий осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі, розчиняли його в 10л води та висаджували п'ятикратним об'ємом 96% спирту етилового. Осад відокремлювали фільтрацією на нутч-фільтрі та висушували в сушарці. Вихід цільового продукту склав 11% від маси повітряно сухої сировини. Приклад 4. Вивчення мембраностабілізуючої активності комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, визначали за допомогою удосконаленого стандартного методу Шрека. Для цього у пробірки вносили у рівних об'ємах клітинні зависі кісткового мозку пацюків (з концентрацією 240000 клітин в 1мл) та 1мл 1% розчину тетрацикліну. У контрольну серію додавали рівний об'єм фізіологічного розчину, до дослідної - рівний об'єм 2% розчину комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, з попередньою розтитровкою. Час експозиції становив 15 хвилин. Була використана модель, на тлі якої тестувалися препарати порівняння: преднізолон, ессенціале, які мають мембраностабілізуючу дію. Результати наведені у таблиці 3. Таблиця 3. Вивчення мембраностабілізуючої дії комплексу полісахаридів з трави фіалки, одержаного за заявленим способом у порівнянні з референс-препаратами (m=5) № п/п 1 2 3 4 5 Варіанти дослідів Кількість живих клітин Мембраностабілізуюча активність, % Комплекс полісахаридів трави фіалки Тетрациклін Ессенціале Преднізолон Контроль (нативний стан) Згідно даних таблиці 3, комплекс полісахаридів з трави фіалки, одержаний за заявленим способом, має виражену мембраностабілізуючу дію, яка проявляється на рівні ессенціале та поступається преднізолону. Приклад 5. Вивчення імуномоделюючої дії комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, вивчали на стандартній моделі спонтанного розеткоутворення лімфоцитів людини з еритроцитами барану. Гепаринізовану кров, яка була взята з ліктьової вени, розводили розчином Рінгера у співвідношенні 1:2, нашаровували на градієнт густини фікол-верографін (1,077) та центрифугували 15 хвилин при 300об/хв. Отримане лімфоцитарне кільце переносили у градуйовану центрифужну пробірку та відмивали фізіологічним розчином, отримували чисту завись лімфоцитів людини. 70,6±0,8 49,2±0,5 72,8±0,6 84,3±0,8 95,8±0,7 21,4±0,8 23,6±0,8 35,1±0,9 Для роботи підготовували необхідну концентрацію лімфоцитів - 2-10 клітин в 1мл та робили розведення комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%, 0,62%, 0,5%, 0,3%. В якості порівняння були використані зразки препаратів рекутан та настоянки ехінацеї. До 1мл чистої зависі лімфоцитів додавали 0,02мл розведеного розчину комплексу полісахаридів, одержаного за заявленим способом, та препаратів порівняння, інкубували протягом 15 хвилин при температурі 37°С. Потім додавали 0,1мл 1% зависі еритроцитів барана, інкубували протягом 10 хвилин при температурі 37°С. Припинення реакції проводили шляхом центрифугування протягом 2 хвилин при 1500об/хв. В якості критеріїв оцінки вибрано кількість лімфоцитів та розеткоутворюючих клітин. Результати дослідів наведено у таблиці 4. 9 34709 10 Таблиця 4. Вивчення імуномоделюючої дії комплексу полісахаридів з трави фіалки, одержаного за заявленим способом у порівнянні з референс-препаратами (m=5) № п/п 1 2 3 4 Експериментальні зразки 10,0 Комплекс полісахаридів трави фіалки Рекутан Настоянка ехінацеї Контроль Т-РУК Кількість лімфоцитів та розеткоутворюючи х клітин Розведення експериментальних зразків, % 5,0 2,5 1,25 0,62 0,5 0,3 36,8±0,2 44,2+0,4 46,0±0,2 46,5±0,4 48,6±0,4 62,7±0,4 55,7±0,4 60,6±0,5 66,1±0,3 59,5±0,6 Примітка: - визначення не проводили Дані таблиці 4 свідчать про наявність вираженої імуномоделюючої активності комплексу полісахаридів з трави фіалки, одержаного за заявленим способом, який у розведенні 0,5% перевищує аналогічну дію рекутану. Таким чином, заявлено новий спосіб одержання комплексу полісахаридів мембраностабілізуючої та імуномоделюючої дії з трави фіалки, який передбачає використання доступних реактивів та достатньої вітчизняної сировинної бази. Спосіб є простим, економічним і може бути здійснений на стандартному обладнанні хіміко-фармацевтичних підприємств. Заявлений спосіб забезпечує одержання біологічно активної субстанції з вираженою мембраностабілізуючою та імуномоделюючою дією без побічних ефектів, нетоксичної, яка може бути використана як діюча сировина у лікарських препаратах, виконаних у різних лікарських формах Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко і придатних до тривалого вживання пацієнтами різних вікових гр уп. Заявлений спосіб запобігає руйнуванню екстрагованих термолабільних речовин, забезпечує одержання очищеного готового продукту з економічно доцільним виходом. Джерела інформації: 1. Патент на винахід 24032, Україна, МПК6 А61К35/78, заявл. 28.12.95, опубл. 31.08.98, Бюл. №4. 2. Патент на корисну модель 23647, Україна, МПК (2006) А61К36/00, заявл. 19.10.2006, опубл. 11.06.2007, Бюл. №8. 3. Е.И.Светличная, И.А.Толок Этимологический словарь латинских ботанических названий лекарственных растений. Харьков. Изд-во НФаУ «Золотые страницы», 2003, С.252. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601