Ферментний потенціометричний біосенсор для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в біомасі культури тканин раувольфії зміїної

Реферат: Ферментний потенціометричний біосенсор для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в біомасі культури тканин раувольфії зміїної (Rauwolfia serpentina), який характеризується тим, що складається з потенціометричного датчика на основі двох рНчутливих польових транзисторів, на один з яких нанесена робоча ферментна мембрана на основі ацетилхолінестерази, що є чутливою до індольних алкалоїдів, на другий нанесена мембрана порівняння на основі сироваткового альбуміну білка, вказаний біосенсор інтегрований до вимірювальної комірки, в яку встановлений і електрод порівняння, виходи датчиків призначені для підключення до відповідних входів аналого-цифрового іонносенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ для вимірювання сигналів потенціометричних датчиків на основі іон-селективних польових транзисторів, а виходи згаданого приладу призначені для підключення до відповідних входів комп'ютера. UA 118762 U (12) UA 118762 U UA 118762 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнологічного та фармацевтичного виробництва і може бути застосована зокрема для експрес-оцінки культур тканин, вирощених in-vitro, для оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів, а більш конкретно, до конструкції аналітичних систем для моніторингу індольних алкалоїдів у розчинах, а саме до ферментного потенціометричного біосенсора для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в культурі тканин раувольфії зміїної. Індольні алкалоїди - це клас алкалоїдів, які містять у своїй структурі ядро індолу або його похідних. Велика кількість цих алкалоїдів володіють фізіологічною активністю, деякі з них знаходять застосування в медицині [1]. Більша частина фізіологічних ефектів цих алкалоїдів пов'язана з їх дією на центральну і периферичну нервові системи [2]. Велика увага приділяється раувольфії зміїній (Rauwolfia serpentina), яка протягом тисячоліть культивується в Індії як лікарська і декоративна рослина. Коріння і кореневища раувольфії зміїної містять до 3 % алкалоїдів, монотерпеноїдних похідних індолу (резерпін, ресцінамін, аймалін, аймаліцін, ізоаймалін, раухімбін, ізораухімбін, раувольфінін, резерпілін, резерпенін, сарпагін, серпентин, серпентінін, серпін, 3-епі-7-іохімбін, аллохімбін, 7-іохімбін, тебаін, папаверин, чаіндрін - всього понад 50 алкалоїдів) [3]. Найбільш важливі з них резерпін, аймалін і аймаліцин. Коріння і кореневища раувольфії зміїної здавна застосовувалися в народній медицині при різних захворюваннях людини та у ветеринарній практиці як ліки від зміїних укусів, лихоманки, божевілля, для зниження кров'яного тиску при гіпертонічній хворобі, а також при лікуванні периферичних і церебральних судинних захворювань. На основі сумарних екстрактів раувольфії або окремих очищених алкалоїдів розроблений ряд фармацевтичних препаратів: AritminaTM, Aphrodyne TM, Lamuran ТМ, Raunatin TM, Rauwasan TM, Rauwopur TM, Pressimed TM, Serpasil TM, Yohimex TM та інші. Дефіцит природної сировини - коренів раувольфії зміїної, зумовив розробку нових біотехнологій отримання рослинної біомаси, а саме вирощування клітинної біомаси раувольфії зміїної в умовах in vitro. Розроблено технології і створено клітинні лінії і штами раувольфії зміїної, що накопичують до 2-3 % індольних алкалоїдів. Технологію отримання алкалоїдів із біомаси культивованих клітин раувольфії зміїної апробовано у заводських умовах [4]. Тому достатньо важливим є контроль цих алкалоїдів у сучасних біотехнологічних і фармацевтичних процесах виробництва ліків. Існує ряд методів для якісного та кількісного визначення індольних алкалоїдів, а саме об'ємний, колориметричний, спектрофотометричний, флуорометричий та інші методи визначення [5]. Ці способи добре вивчені та широко використовуються, але мають деякі недоліки, основні з яких є довготривалість та складна методика підготовки проб, яка може призвести до суттєвих похибок результатів аналізу. Крім того, усі ці методи є відносно дорогими. Тому сьогодні постає дуже актуальне питання створення більш зручного, точного, селективного, швидкого та дешевого методу оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів. На основі проведення патентно-інформаційних досліджень авторами роботи було встановлено, що на сьогодні в галузі біосенсорики не існує даних щодо розробки біосенсорів для визначення вмісту індольних алкалоїдів. В основу корисної моделі поставлена задача створення ферментного потенціометричного біосенсора для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в культурі тканин раувольфії зміїної, вирощених in vitro, який непотребує складного громіздкого обладнання та попередньої підготовки проб, і є простим у використанні. Поставлена задача вирішується пропонованим ферментним потенціометричним біосенсором для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в біомасі культури тканин раувольфії зміїної, який складається з потенціометричного датчика на основі двох рНчутливих польових транзисторів, на один з яких нанесена робоча ферментна мембрана на основі ацетилхолінестерази, що є чутливою до індольних алкалоїдів, на другий нанесена мембрана порівняння на основі сироваткового альбуміну білка, вказаний біосенсор інтегрований до вимірювальної комірки, в яку встановлений і електрод порівняння, виходи датчиків призначені для підключення до відповідних входів аналого-цифрового іонносенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ для вимірювання сигналів потенціометричних датчиків на основі іон-селективних польових транзисторів, а виходи згаданого приладу призначені для підключення до відповідних входів комп'ютера. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де: на фіг. 1 представлено загальний вигляд пропонованого ферментного потенціометричного біосенсора на основі рН-ПТ; на фіг. 2 продемонстровано відгуки біосенсора на основі рН-ПТ на додавання субстрату та соку культури тканин раувольфії зміїної на реальному прикладі проведення експерименту; 1 UA 118762 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 на фіг. 3 наведено залежність рівня інгібування від концентрації аймаліну, який знаходиться в соку, отриманому із культури тканин раувольфії зміїної; Ферментний потенціометричний біосенсор для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в біомасі культури тканин раувольфії зміїної складається: з двох рН-чутливих р-канальних польових транзисторів 1 та 2 (ПТ) в якості перетворювачів (фіг. 1). На поверхню транзистору 1 нанесена робоча мембрана 3 (РМ), яка містить у собі фермент ацетилхолінестеразу, селективний до індольних алкалоїдів, на поверхню транзистору 2 (ПТ) нанесена референтна мембрана 4 (РфМ) на основі сироваткового альбуміну білка; портативної системи для вимірювань з іон-селективними польовими транзисторами, що ідентична системі, яка описана в [6]. В основі роботи ферментного потенціометричного біосенсора на основі рН-ПТ для експресоцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в культурі тканин раувольфії зміїної лежить ефект інгібування ферменту ацетилхолінестерази індольними алкалоїдами. Реакція розщеплення субстрату під каталітичною дією ферменту має наступний вигляд: AXE Ацетилхолін  2 H 2O   Холін  CH 3COO   H  .  В процесі ферментативної реакції ацетилхолінестераза розщеплює ацетилхолін, при цьому збільшується концентрація протонів в робочій мембрані, відповідно, відбувається зміна рН, яку і можна реєструвати за допомогою рН-ПТ. За допомогою ІСПТ з рН-чутливим шаром відбувається перетворення біохімічного сигналу в електричний, що дозволяє реєструвати відгуки біосенсора на додавання субстрату. Для аналізу концентрації індольних алкалоїдів необхідно додати досліджуваний зразок у кювету з ІСПТ, на який нанесено фермент, при цьому в ході контакту з індольними алкалоїдами відбувається інгібування ферменту. В процесі ферментативної реакції при наявності індольних алкалоїдів розщеплюється менше ацетилхоліну, що призводить до зміни рН в мембрані у меншій мірі ніж без індольних алкалоїдів. В залежності від цієї різниці і визначали наявність індольних алкалоїдів в досліджуваному зразку. Пропонований ферментний потенціометричний біосенсор для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в біомасі культури тканин раувольфії зміїної працює наступним чином. На робочу поверхню рН-ПТ 1 (ПТ) потенціометричного біосенсора наносили вихідну суміш для створення робочої мембрани З (РМ) (об'єм 25-70 нл), яку вносили в насичені пари глутарового альдегіду (ГА) на 15-20 хвилин. Цю робочу мембрану готували із 20 мМ фосфатного буфера, рН 7.0, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас. %): ацетилхолінестераза 0,5-2 сироватковий альбумін бика (БСА) 0,5-2 гліцерин 6-14. На інший рН-ПТ 2 (ПТ) наносили вихідну суміш для створення референтної мембрани 4 (РФ) (25-70 нл), яку вносили в ГА на 15-20 хвилин, цю мембрану формували з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7.0, і наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас. %): (БСА) 1.5-3 гліцерин 6-14. Співвідношення компонентів біоселективних мембран біосенсорної системи було отримано експериментально. Його підібрали для покращення аналітичних характеристик біосенсорів, таких як час відгуку, селективність, чутливість, операційна стабільність та ін. Після процесу іммобілізації біосенсори висушували 15 хв. на повітрі за кімнатної температури. Перед початком роботи, для видалення надлишку незв'язаних ферменту та інших компонентів мембран, біосенсори відмивали протягом 20 хв. у буфері, в якому і проводили подальші досліди. Вимірювання проводили за допомогою аналого-цифрового іонно-сенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ, розробленого та виготовленого в Інституті фізики напівпровідників ім. B.C. Лашкарьова НАН України [7], що працює по схемі прямого вимірювання струму в каналі польового транзистора з активним навантаженням. Чутливість приладу становила близько 25 мкА/рН. До входу приладу підключався двохелементний потенціометричний ферментний біосенсор, а також електрод порівняння. Вихід приладу підключався до комп'ютера через послідовний СОМ або USB порт. Пропоновану систему використовували наступним чином. Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Створення ферментного біосенсора: виготовляли робочу мембрану 3 (РМ). Для цього готували розчин з вмістом 1 % ацетилхолінестерази, 1 % БСА та 10 % гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7.0. 2 UA 118762 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Референтну мембрану 4 (РфМ) виготовляли таким же чином, але замість наважки ферменту брали лише 2 % БСА. Гліцерин у складі мембран 3 (РМ), 4 (РфМ) використовувався для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасного підсихання розчину, нанесеного на поверхню перетворювача до його внесення в ексикатор з ГА для ковалентної зшивки. В свою чергу, БСА в складі робочої мембрани 3 (РМ) відігравав роль стабілізуючого агенту для ферменту. Для створення мембран біосенсора, відповідно, 3 (РМ) та 4 (РфМ), краплю суміші ацетилхолінестераза-БСА (50 нл) наносили на затворну область поверхні перетворювача 1 (ПТ), а на іншу 2 (ПТ) - розчин БСА без ферменту (це був датчик порівняння). Для іммобілізації мембран датчики розміщували в атмосфері насичених парів глутарового альдегіду (ГА) на 1520 хв. і потім підсушували на повітрі й відмивали від надлишку ГА у буферному розчині протягом 10-20 хв. Зразки для аналізу сумарного вмісту ідольних алкалоїдів готували з сирої біомаси калюсної культури Rauwolfia serpentina штам К-20 [4]. Для приготування зразка брали сиру біомасу калюсу 2-місячного віку після пасажування, витискали вручну сік через капроновий фільтр з розміром комірок 0,3 мм. Одну частину соку використовували для визначення сумарного вмісту індольних алкалоїдів одразу, другу частину соку розливали по пробірках Eppendorf об'ємом 1,5 мл і заморожували при -20 °C. Після розморожування сік Rauwolfia serpentina також аналізували. Перед початком вимірювань з нанесеними мембранами біосенсор встановлювали у вимірювальній комірці та додавали 2,5 мл 5 мМ буферного розчину, рН 7.4, витримували 10-20 хв. для отримання стабільного базового сигналу. Далі в комірку додавали 6 мМ АХХ і отримували сигнал (Фіг. 2), величину відгуку якого приймали за 100 %. Потім додавали певний об'єм соку культури тканин раувольфії зміїної та отримували зменшення відгуку сенсора. Рівень інгібування визначали по співвідношенню відгуків біосенсора до та після інгібування, згідно з наступною формулою: І% = (А0/Аі)* 100, %, де А0 - відгук біосенсора на субстрат до інгібування, Аі - відгук біосенсора на субстрат після інгібування. Після цього отримували залежність рівня інгібування іммобілізованої ацетилхолінестерази при додаванні в розчин різних об'ємів соку культури тканин раувольфії зміїної, що відповідало концентрації індольних алкалоїдів в еквіваленті концентрації аймаліну, та одержували графік (фіг. 3), за допомогою якого можна визначати вміст індольних алкалоїдів в зразках культури тканин раувольфії зміїної. Використовуючи запропонований біосенсор було проаналізовано різні зразки культури тканин раувольфії зміїної на загальний вміст індольних алкалоїдів. З калібрувальних графіків видно, що запропонований ферментний потенціометричний біосенсор для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів може бути використаний у експрес-аналізі вмісту індольних алкалоїдів у біомасі культури тканин раувольфії зміїної при виробництві лікарських препаратів. Джерела інформації: 1. Кнунянц И.Л. Индольные алкалоиды. //Химическая энциклопедия. - М: Советская энциклопедия.-1988.-623 с. 2. P.M. Dewick. Medicinal Natural Products. // A Biosynthetic Approach. Second Edition.- Wiley.2002.- С 356. 3. Белоусова Л.С., Денисова Л.В. Редкие растения мира. - М.: Лесная промышленностью1983.-344 с. 4. Кунах В. А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. Київ, "Логос", 2005.-730 с. 5. G.S. Panwar, S.K. Guru, Alkaloid profiling and estimation of reserpine in Rauwolfia serpentina plant by TLC, HP-TLC and HPLC. // Asian Journal of Plant Science.-2011.-10 (8).- P. 393-400. 6. Архипова B.M., Шелякіна М.К., Солдаткін О.О., Дзядевич С.В. Ферментний потенціометричний біосенсор для визначення 1-аргініну у водних розчинах на основі рНчутливих польових транзисторів та ефекту інгібування уреази. // Патент України на винахід № 105570. - Подано: 26.10.2012. - Опубліковано: 26.05.2014, бюл. № 10. 7. Кукла О.Л., Павлюченко О.С., Бушма О.В., Голтвянський Ю.В., Дзядевич С.В., Солдаткін О.П., Патент України на корисну модель "Аналого-цифровий іонно-сенсорний вимірювач параметрів рідких середовищ", UA № 48359 МПК G01N 27/26, 27/27, заявл. 26.10.2009, опубл. 10.03.2010, Бюл. № 5. 60 3 UA 118762 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Ферментний потенціометричний біосенсор для експрес-оцінки сумарного вмісту індольних алкалоїдів в біомасі культури тканин раувольфії зміїної (Rauwolfia serpentina), який характеризується тим, що складається з потенціометричного датчика на основі двох рНчутливих польових транзисторів, на один з яких нанесена робоча ферментна мембрана на основі ацетилхолінестерази, що є чутливою до індольних алкалоїдів, на другий нанесена мембрана порівняння на основі сироваткового альбуміну білка, вказаний біосенсор інтегрований до вимірювальної комірки, в яку встановлений і електрод порівняння, виходи датчиків призначені для підключення до відповідних входів аналого-цифрового іонносенсорного вимірювача параметрів рідких середовищ для вимірювання сигналів потенціометричних датчиків на основі іон-селективних польових транзисторів, а виходи згаданого приладу призначені для підключення до відповідних входів комп'ютера. 4 UA 118762 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5