Спосіб ідентифікації генотипів хмелю

Спосіб ідентифікації генотипів хмелю, що включає підготовку зразка до аналізу, аналіз стану молекулярних маркерів, співставлення отриманих даних стану молекулярних маркерів із наявними даними, який відрізняється тим, що як молекулярні маркери використовують мікросателітні послідовності ДНК, а ампліфікацію проводять в таких комбінаціях: 1 реакція H1G-A3, lla-59, H1G-T2; 2 реакція H1G-A9, H1G-T1, H1G-T5; 3 реакція 3а-88, 5-2, H1G-A4, 7а-82. (19) (21) u200905292 (22) 27.05.2009 (24) 26.10.2009 (46) 26.10.2009, Бюл.№ 20, 2009 р. (72) ОВЕРЧЕНКО ВІТАЛІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ, ПАРІЙ МИРОСЛАВ ФЕДОРОВИЧ, СПИРИДОНОВ ВЛАДИСЛАВ ГЕННАДІЙОВИЧ, МЕЛЬНИЧУК МАКСИМ ДМИТРОВИЧ (73) ОВЕРЧЕНКО ВІТАЛІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ, ПАРІЙ МИРОСЛАВ ФЕДОРОВИЧ, СПИРИДОНОВ ВЛАДИСЛАВ ГЕННАДІЙОВИЧ, МЕЛЬНИЧУК МАКСИМ ДМИТРОВИЧ 3 45108 4 (RFLP) і аналіз поліморфізму за допомогою ПЛР шишки. Наприклад, якщо на приквітковій лусочці (RAPD, ISSR, AFLP, SSR). В нашій роботі для винараховується 200 - 250 шт. лупулінових залоз, то рішення завдань ідентифікації та диференціації вміст гірких речовин (ГР) становить 8 - 10% на генотипів використано метод SSR-ПЛР, оскільки суху масу шишок. Це можна визначити за методом SSR маркери характеризуються низкою переваг, оперативної діагностики потенційної або фактичвони є сайтспецифічними, тобто відома їхня локаної смолопродуктивності в шишках хмелю [Бочкалізація в геномі рослини. Цей тип маркерів харакрев А.Н. Методологические основы реформироватеризується кодомінантним типом успадкування. ния сортоиспытания с учетом международных Один локус може мати значну кількість алельних стандартов // Тез. докл: «Методологические основаріантів. Відповідно система ідентифікації та дивы формирования, ведения и использования колференціації сортів хмелю на основі SSR-маркерів лекций генетических ресурсов растений».- Харьнабуває значної диференційно-ідентифікаційної ков, 1996. - С. 7. Жигало Ю.В. До методики здатності. ідентифікації сортів хмелю (Humulus lupulus. L.) за Існує спосіб ідентифікації сортів хмелю за морфологічними ознаками / /Хмелярство. - 2005. комплексом господарсько-морфологічних ознак. Вип. 22. - С. 17-25.]. Цей спосіб обраний як аналог [Жигало Ю.В. До Як прототип корисної моделі, обрано спосіб методики ідентифікації сортів хмелю (Humulus ідентифікації генотипів хмелю за біохімічними маlupulus. L.) за морфологічними ознаками ркерами. В цьому способі використовують вміст //Хмелярство. - Житомир: „Просвіта", 2005. -вип.. загальних смол, a- та b-кислот, співвідношення b22. - с 17-25]. Проведення експертизи на відмінкислот та а-кислот, когумулон в складі a-кислот, ність, однорідність і стабільність, як це вимагає колупулон в складі b-кислот [Ляшенко Н.И. БиохиУПОВ, дозволяє використовувати листки і шишки мия хмеля и хмелепродуктов. Житомир. - „Полисхмелю як сортові ознаки. У хмелю за довжиною ся" - 2002.]. Підготовка зразку до аналізу, аналіз стебла листки за формою і величиною розміщумаркерів, співставлення отриманих даних із наявються неоднаково. У нижній частині стебла форними даними спільні суттєві ознаки відомого спомуються великі три-, п'ятилопатеві, середній чассобу та корисної моделі, однак на відміну від коритині стебла, на бічних гілках формуються сної моделі недоліком відомого способу є те, що п'ятилопатеві і маленькі серцевидні листки. Різновін не забезпечує універсальність (для аналізу листність розрізняють філогенетичну й екологічну. використовуються лише шишки хмелю в фазу техЗа тривалий період селекції хмелю виявлено різні нічної стиглості), точність (на кількість і стан біохіформи листової пластинки, яка ускладнюється під мічних маркерів впливають екологічні умови), інвпливом різних видів схрещування. Форми листоформативність (співставлення лише декількох вих пластинок: серцевидна, три-, п'яти-, семи-, показників) і обмеженість в часі ідентифікації генодев'яти-, одинадцятилопатеві. За несприятливих типів хмелю, в зв'язку з тим що біохімічні маркери, умов лопатевість зменшується, коли умови поліпякі використовуються в цьому способі в кількості шуються, то серед молодих листків можна знову достатній для аналізу знаходяться тільки в шишпомітити збільшення лопатевості. За формою шиках хмелю в фазі технічної стиглості. Це обумовшки поділяють: на округлу, яйцеподібну, яйцеподілює неможливість проведення ідентифікації в пебновидовжену та циліндрично видовжену. За спорші роки росту рослин хмелю. Крім того собом прилягання покривних лусочок (брактей) їх співвідношення біохімічних маркерів що викорисподіляють ще на дві групи: з притиснутими кінчитовуються в прототипі залежить від екологічних та ками брактей та вільними кінчиками. Кожну з цих агротехнічних умов вирощування рослин хмелю, двох груп поділяють ще на чотири типи: першу - на це значно знижує точність ідентифікації. овальну, овальнозагострену (еліптичну), призмаВ основу корисної моделі поставлено задачу в тичну, пірамідальну, другу - на овально-колючу, способі ідентифікації генотипів хмелю збільшити ялинкову шишку, колючо-реберчасту, „пагода". Під точність, універсальність та необмеженість в часі впливом погодних умов і ґрунтового живлення аналізу, шляхом використання мікросателітних розміри та кількість шишок можуть помітно змінюпослідовностей ДНК, які ампліфікуються в таких ватися до нехарактерних для певного сорту, генокомбінаціях: (1 - реакція H1G-A3, 1 la-59, H1G-T2, 2 типу. Можуть утворюватися шишки в екстремаль- реакція H1G-A9, H1G-T1, H1G-T5, 3 - реакція Заних умовах на найнижчих і верхівкових суцвіттях. 88, 5-2, H1G-A4, 7а-82), стан яких може бути виСтабільною ознакою залишається такий показник, значений аналізом будь якої частини рослини і не як індекс щільності шишки (ІШ), що являє собою змінюється в залежності від умов зовнішнього севідношення кількості приквіткових лусочок (бракредовища (екологічні та агротехнічні умови виротей) до довжини шишки. За існуючою методикою щування). морфологічного опису сортів визначають довжину Поставлена задача вирішується тим що у даі щільність шишки та частоту колінець веретенця. ному способі ідентифікації генотипів хмелю, що Кількісна ознака - індекс щільності шишки є геневключає підготовку зразку до аналізу, аналіз стану тично спадковою. Чим більше значення індексу, маркерів, співставлення отриманих даних із наявтим щільніша шишка. Для окультурених форм і ними даними по стану маркерів відповідно до косортів ІШ > 10. Чим менший індекс, тим шишка рисної моделі, що використовують мікросателітні пухкіша і ця ознака наближається до дикої форми. послідовності ДНК, які ампліфікуються в таких Чим щільніша шишка, тим менше вона втрачає комбінаціях: (1 реакція H1G-АЗ, lla-59, H1G-T2, 2 форму за зберігання і тим менші втрати лупуліну. реакція H1G-A9, H1G-T1, H1G-T5, 3 реакція За-88, Кількість лупулінових залоз, які розміщуються на 5-2, H1G-A4, 7а-82) маркери. брактеолях, характеризує смолопродуктивність 5 45108 6 Запропонований спосіб характеризується таНова, відмінна від прототипу, ознака забезпекими суттєвими ознаками: підготовка зразку до чує більш точну розподільчу здатність системи аналізу з будь-якого органу рослини, аналіз стану маркерів, що обумовлює більшу точність, універмікросателітних послідовностей ДНК, які ампліфісальність, інформативність способу ідентифікації куються в таких комбінаціях: (1 реакція H1G-A3, генотипів хмелю. lla-59, H1G-T2, 2 реакція H1G-A9, H1G-T1, H1G-T5, Відомості які дозволяють здійснити Корисна 3 реакція За-88, 5-2, H1G-A4, 7а-82), співставленмодель. Згідно запропонованого способу диференя отриманих даних із наявними даними по стану нціацію генотипів хмелю проводять за довжиною маркерів. Аналіз стану мікросателітних послідовмікросателітних локусів, які наведено в табл. 1. ностей ДНК - є відмінною від прототипу ознакою запропонованого способу. Таблиця 1 Алелі мікросателітних локусів виявлених при генотипуванні 13 сортів хмелю Алелі Локус А С D Е F G 179 196 147 254 187 191 149 225 194 212 Па-59 7а-82 H1G-A3 H1G-T1 H1G-T5 За-88 5-2 H1G-A4 H1G-A9 H1G-T2 В 190 198 150 260 198 193 168 232 216 214 156 262 201 196 176 234 218 218 264 208 198 179 241 220 220 266 212 200 181 232 219 183 223 185 Встановлено, що найменша кількість алелів трапляється в локусах Па-59 і 7а-82 - два алеля з відповідними розмірами 179 й 190 пар нуклеотидів в першому локусі 196 та 198 пар нуклеотидів в другому локусі. Найбільша кількість алелів зустрічається при типуванні геномів хмелю з праймерами до мікросателітних локусів За-88 та 5-2 в кількості семи алелів з диференційованими розмірами (191, 193, 196, 198, 200, 219, 223 пар нуклеотидів та 149, 168, 176, 179, 181, 183, 185 відповідно). Три алеля виявлено за допомогою електрофоре 226 К-ть алелів 2 2 3 5 6 7 7 4 5 4 тичного аналізу продуктів ампліфікації з праймерами в мікросателітних локусах H1G-A3, чотири в H1G-A4 та H1G-T2, п'ять в H1G-T1 та H1G-A9, а також шість у локусі H1G-T5. Середня кількість алелів на один генотип становить 4,5 алелі. Для шифрування (кодування) генотипів рослин хмелю всі виявлені алелі, залежно від їхнього розміру, позначали латинськими літерами А, В, С, D, Е, F, G, де А найменший за розмірами алель, що трапляється при Таблиця 2 Результати генотипування 13 сортів хмелю за 10 мікросателітними локусами Сорт Маркер Алель Руслан 11а-59 7а-82 HIG-A3 H1G-T1 А В А В А В С А В С D Е НаціТріСла- Куонаумф вянка мир льний + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ГайЗлато ОбоЗагПроХмелеПотіїв- даПоліс- лонАльта рамінь слав ський мася ський ва цький + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 7 H1G-T5 За-88 5-2 H1G-А4 H1G-A9 H1G-T2 А В С D Е А В С D Е F G А В С D Е F G А В С D А В С D Е А В С D + + 45108 + + + + + + + + + + 8 Продовження таблиці 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + електрофоретичному розділі продуктів ампліфікації, літера В відповідає наступному за розміром алелю, G - найбільший фрагмент, що трапляється в мікросателітних локусах За-88 та 5-2. У результаті такого кодування створено базу даних сортів хмелю української селекції (табл. 2.) З таблиці 2 проведено «код» кожного сорту хмелю в бінарну форму, яка показує лише наявність або відсутність певного алеля. За такою таблицею можливо побудувати «код» кожного геному у бінарному вигляді (табл. 3). Таблиця 3 Бінарний генетичний код 13 сортів хмелю Сорт Руслан Тріумф Національний Славянка Кумир Промінь Злато Полісся Оболонський Хмелеслав Альта Потіївський Гайдамацький Заграва Генетична формула 11111110011001100010001010001011010101001010 11111011010001100011000000110001010001101010 11110101010001100010000000010011010000110010 10110100000001100010000000010011010000000010 01110100010011000010001000000001010101001010 11110100011001100010100010110001010001100010 11110100010001100110000000110000110000001100 11110100010101101100100000010010110000000010 11111100000001100010101000000100010100001000 11110100000001100000000000110001010010001001 11110100010101110000110001000011010000001010 11110100110001110010000110110011110000001010 11110100010101100010100000010011010001001010 9 45108 Спосіб здійснюється таким чином. Матеріал від рослини хмелю невідомого сорту або походження відбирають, з будь-якого органу рослини (листя, стебло, корінь, бруньки), одноразовим інструментом. Маса проби становить 5-10 г. Маніпуляції, пов'язані з підготовкою проб, проводимо чистим стерильним інструментом, вільним від ДНК рослин хмелю, з використанням одноразових поліпропіленових пробірок і наконечників з аерозольним бар'єром. Пробу рослинного матеріалу масою 0,1-0,2 г переносимо в 1,5 мл пробірки і виділяємо ДНК без попередньої підготовки, гомогенізуючи в рідкому азоті. Лізуючий розчин і «розчин для відмивання 1» прогріваємо при 65 °С до повного розчинення кристалів. До кожної пробірки додаємо по 300 мкл лізуючого розчину. Проби ретельно перемішуємо на вортексі і прогріваємо 5 хв. за температури 65 °С. Центрифугуємо 5 хв. при 5 тис. об/хв. Якщо проба не повністю лізувалась, то її центрифугуємо повторно і використовуємо для виділення на досаду. Ретельно ресуспензуємо сорбент на вортексі. У кожну пробірку окремим наконечником додаємо по 50 мкл сорбенту, перемішуємо на вортексі і витримуємо 3 хв. при кімнатній температурі, ще раз перемішують і витримують 5 хв. Сорбент сепаруємо центрифугуванням при 5 тис. об/хв. про 10 тягом 30 с. Супернатант вилучаємо за допомогою вакуумного відсмоктувача і окремого наконечника для кожної проби. В кожну пробірку додаємо по 300 мкл «розчину для відмивання 1», ресуспензуємо сорбент на вортексі. Сорбент відділяємо центрифугуванням при 5 тис. об/хв. протягом 30 с Супернатант видаляємо повністю за допомогою вакуумного відсмоктувача і, окремого наконечника для кожної проби. Додаємо в кожну пробірку по 500 мкл «розчину для відмивання 2», ресуспензуємо сорбент на вортексі. Відокремлюємо сорбент центрифугуванням при 10 тис. об/хв. протягом 30 с Повністю видаляємо супернатант, використовують вакуумний відсмоктувач і окремий наконечник для кожної проби. Сорбент підсушують, пробірки переносять в термостат на 10 хв. при 65°С. Кришки пробірок відкривають. В пробірки додаємо по 80 мкл ТЕ-буфера для елювіації ДНК. Сорбент ресуспензуємо на вортексі. Пробірки поміщаємо в термостат на 5 хв. при 65°С, періодично струшуємо на вортексі. Пробірки центрифугуємо, при 13 тис. об/хв протягом 3 хв. Супернатант, що містить ДНК, переносимо в чисту пробірку і проводимо ПЛР. Послідовності 10 олігонуклеотидних праймерів для аналізу мікросателітних локусів для даної проби наведено в табл. 4. Таблиця 4 Послідовності праймерів Локус 11а-59 7а 82 H1G-A3 H1G-T1 H1G-T5 За-88 5-2 H1G-A4 H1G-A9 H1G-T2 F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: F: R: F: R: F: R: F: R: Послідовність GCTTCAACCCTCTAATTTCTGACC AGAAGGGATACACTCGGTTAATCC GTGGAGGCGACGGTGTAGAGGAA TCAAAATTCCTCAACTGCGCTTAA TTTCACCAAATTTCCAAGTGC GGTGCCAAGGGATAGACAT CTTTGGAGGAAATAATGGCT ААСАТСТСАСТТСТСТСССТАА ATACCCCTCCTGTTTTTCTACC CGTCGGGTTCCAAAGGATT TAGGCCCTACTCTAGCTCGCCAGA CCTGGTTGTGATAGGGGCTTGGAC TCGAATGGTCCTAGATATCCCC CAGTAAATGGATGCTTGAAGGC CCAACACTAGGGTTTGCATC AGGCTCATCCCAGAAGTATG CCAACACTAGGGTTTGCATC AGGCTCATCCCAGAAGTATG GTCCTTCGAGCAAACCTTATA TCACCCCTTATGCCCAATT Для проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) відбираємо необхідну кількість пробірок (об'ємом 0,5 або 0,2 мл, залежно від типу ампліфікатора), враховують негативний контроль виділення. Пробірки маркують. Реакційну суміш готують для досліджуваних зразків з розрахунку 23,8 мкл ПЛР-суміші додаємо 0,2 мкл Taq-полімерази на один зразок. Для повного аналізу генотипу необхідно підготувати три реакції з різною комбінацією Барвник FAM FAM FAM FAM FAM JOE JOE JOE JOE JOE ДНК-маркерів в такому поєднанні (1 реакція H1GA3, На-59, H1G-T2, 2 реакція H1G-A9, H1G-T1, H1G-T5, 3 реакція За-88, 5-2, H1G-A4, 7а-82). Суміш ретельно перемішують, краплі осаджують центрифугуванням. По 24 мкл готової реакційної суміші поміщають в чисті пробірки. Використовують наконечник з аерозольним фільтром, додають по 1 мкл ДНК зразка в пробірки з реакційною сумішшю. Включають ампліфікатор згідно інструкції до 11 45108 приладу і задають параметри. Пробірки поміщаємо в ампліфікатор і виставляємо параметри табл. 5. Після закінчення реакції пробірки охолоджують H1G-T5 до 4°С і передають для проведення аналізу результатів на генетичному аналізаторі. Таблиця 5 Умови проведення ПЛР реакції на ампліфікаторі з активном регулюванням температури Ампліфікатори з активним регулюванням температури за об'ємом рідини в пробірці - 25 мкл) Кількість цикТемпература, °С Час лів 94 5 хв 1 94 45 с 1хв 36 63 30с 72 30 с 72 10 хв 1 4 зберігання Ампліфіковану ДНК готують до проведення аналізу на АВІ Prism генетичному аналізаторі. Для цього до кожного ПЛР-зразка додають 250 мкл деіонізованої води. Готують суміш з 1 мкл розбавленого ПЛР-зразку, 11,5 мкл Hi-Di формаміда (Applied Biosystems) і 0,5 мкл Genescan-350 ROX стандарту (Applied Biosystems). Суміш ретельно перемішують на вортексі і стряхують краплі зі стінок пробірки центрифугуванням при 5 тис. об/хв протягом 15 с Зразки 2 хв. денатурують при 94°С, після цього витримують З хв. при 0°С. Зразки переносять в реакційну планшету на 96 лунок у відповідні лунки. Зразки поміщають в АВІ Prism генетичний аналізатор і виконують аналіз згідно інструкцією виробника. В процесі проведення капілярного електрофорезу досліджуваних зразків комп'ютерна програма Genescan визначає розмір флуоресцентних мічених ПЛР-продуктів (у парах нуклеотідов) і зберігає отримані дані. Потім збережені дані експортуються в комп'ютерну програму Genotyper або Genemapper для проведення генотипування. В досліджуваному зразку отримують інформацію щодо стану маркерів, які наведені в таб. 6. Таблиця 6 Стан маркерів досліджуваного зразку Локус 11а-59 7а-82 H1G-A3 H1G-T1 Алель А В А В А В С А В С D Е 179 190 196 198 150 156 254 262 264 За-88 5-2 H1G-A4 H1G-A9 H1G-Т2 12 А В С D Е А В С D Е F G А В С D Е F G А В С D А В С D Е А В С D 198 201 193 219 149 181 185 225 234 194 218 212 218 Отриманий генотип хмелю досліджуваного зразку представлено у вигляді бінарного коду 1111111001100110001000101000101101010100101 0. Даний код порівнюється із кодами відомих сортів, які наведені в таблиці 3. Отже досліджувальний зразок відповідає сорту хмелю Руслан. Порівняльний аналіз заявленого способу та прототипу показав, що запропонований спосіб забезпечує вищу розподільчу здатність системи маркерів, що обумовлює більшу точність, універсальність, інформативність способу ідентифікації генотипів хмелю, характеризується новою суттєвою ознакою, яка полягає в тому, що як маркери використовуються мікросателітні повтори ДНК. Технічний результат: запропонований спосіб можливо використовувати в селекції, розмноженні і ідентифікації сортів хмелю, а також у справі випробування та реєстрації сортів а також при визначенні авторських прав на сорти. В загально доступних джерелах відсутні відомості про те, що використання мікросателітних послідовностей ДНК, які ампліфікуються в таких комбінаціях (1 реакція H1G-A3, 1 la-59, H1G-T2, 2 реакція H1GA9, H1G-Т1, H1G-T5, 3 реакція За-88, 5-2, H1G-A4, 7а-82) використовується для збільшення розподільчої здатності системи маркерів, що обумовлює більшу точність, універсальність, інформативність способу ідентифікації генотипів хмелю. 13 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 45108 Підписне 14 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601