Спосіб моделювання гіпертрофічно-гіперпластичного типу ожиріння з ознаками запалення

Спосіб моделювання гіпертрофічногіперпластичного типу ожиріння з ознаками запалення, що здійснюють шляхом гестаційного стресування, який відрізняється тим, що вагітну самицю піддають дії соціально-емоційного стресу з 2 по 8, а потім з 15 по 21 день вагітності, отриманих нащадків у віці 11 місяців піддають дії стресу харчової депривації та гіпокінезії. (19) (21) u201005303 (22) 30.04.2010 (24) 27.09.2010 (46) 27.09.2010, Бюл.№ 18, 2010 р. (72) СЕРГІЄНКО ЛОРІАНА ЮРІЇВНА, ПЕРЕЦЬ ОЛЕНА ВІКТОРІВНА, КАРТАВЦЕВА ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА, ЧЕРЕВКО ГАННА МИКОЛАЇВНА, ТОЛМАЧОВА ЛЮБОВ МИКОЛАЇВНА, БОНДАРЕНКО ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДОКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ ІМ. В.Я. ДАНИ 3 ваних тварин необхідно мати спеціальне обладнання та персонал відповідної кваліфікації. Виходячи з того, що формування надлишку жирової тканини залежить від енергетичної цінності та складу вживаної їжі запропоновано ряд моделей ожиріння, що базуються на відтворенні змін якісного складу харчового раціону. Так, для формування у лабораторних тварин ожиріння проводять тривале пероральне введення фруктози, сахарози (цукрози), глюкозаміну та жиру, як окремо, так і в різних комбінаціях [11]. Широкого застосування набула так звана високожирова дієта [12], при якій жири в добовому раціоні щурів складають 60% від загального калоражу. При моделюванні інсулінорезистентності - основної ознаки метаболічного синдрому, з одночасним розвитком дісліпідемії та ожиріння, використовують також такі хімічні сполуки як алоксан, дитизон, стрептозотоцин, дексаметазон [13]. Останнім часом запропоновано модель з комбінацією чинників: високожирова дієта та стрептозотоцин [14], при відтворенні якої поряд з гіперглікемією, інсулінрезистентністю розвивається ожиріння, зростають показники неестерифікованих жирних кислот та тригліцеридів у сироватці крові. На підставі уявлень про пов'язаність метаболічного синдрому та цукрового діабету 2 типу в нащадків з умовами їх розвитку в ембріональному періоді було запропоновано ряд моделей відтворення вказаних патологій шляхом порушення харчування вагітної самиці. Вказані моделі базуються на зниженні необхідного калоражу, підвищенні вмісту жирів або порушенні метаболізму глюкокортикоїдів у організмі матері та плодів як шляхом застосування специфічних фармакологічних чинників, так і шляхом операційного втручання [15-19]. Однак ці моделі спрямовані, перш за все, на відтворення таких ознак метаболічного синдрому як гіперглікемія, інсулінорезистентність, гіпертензія, в той час як формування надлишкової жирової тканини розглядається як корелятивний симптом. Як відомо, запорукою успішної боротьби з будь-яким захворюванням є створення докладної класифікації форм цієї патології на підставі вивчення етіології та патогенезу. На сьогодні загально прийнятим є розподіл ожиріння на первинне та вторинне (симптоматичне). До первинного ожиріння відносять так звану аліментарно-конституційну форму, а до вторинного - ендокринні форми ожиріння, тобто такі, при яких ендокринні порушення відіграють провідну роль. В той же час на підставі оцінки кількості, розмірів та активності новоутворення клітин жирової тканини відрізняють гіпертрофічний, гіперпластичний та змішаний (гіпертрофічно-гіпершіастичний) типи ожиріння. Гіпертрофічний тип, притаманний аліментарно-конституційній формі ожиріння, характеризується накопиченням ліпідів у жирових клітинах та збільшенням їх розмірів, без ознак активного зростання кількості адипоцитів. Гіпершіастичний тип ожиріння супроводжується збільшенням загальної кількості адипоцитів. Вважається, що цей тип ожиріння більш важкий, погано підлягає дієтотерапії та притаманний ендокринним формам ожиріння. 53260 4 На сьогодні в проблемі ожиріння та його негативних наслідків велика увага приділяється проявам неасептичного запалення, притаманним жировій тканині при гіпертрофічно-гіперпластичному типі її розвитку, характерному для метаболічного синдрому та цукрового діабету 2 типу. Встановлено, що саме вогнища запалення в жировій тканині є джерелом зміни секреції адипокинів, що впливають на дисфункцію -клітин, на розвиток інсулінорезистентності, підвищують продукцію вільних жирних кислот, сприяючи стеатозу печінки, тобто запалення жирової тканини відіграють патогенетичну роль як у розвитку діабету 2 типу, так і його ускладнень [20]. Крім того, знайдено, що при запаленні в жировій тканині спостерігається активація апоптозу адипоцитів, що є причиною виникнення осередків макрофагальної інфільтрації [21]. Форма кільця або напівкільця, притаманна цим скупченням, дала змогу [22] назвати їх вінець-подібними (crownlike) структурами. Саме ці утворення вважаються структурною ознакою запалення жирової тканини та джерелом цілого переліку адипокінів, що відіграють патогенетичну роль у порушеннях вуглеводного та ліпідного обмінів при метаболічному синдромі та цукровому діабеті 2 типу. Тому створення моделі ожиріння з ознаками запалення конче необхідно для проведення подальших досліджень ролі адипокінів у патогенезі метаболічного синдрому і діабету 2 типу та поглиблення знань про причинно-наслідкові зв'язки між ожирінням та цими ендокринопатіями. Задача даної корисної моделі полягає в створенні наближеної до реальних життєвих обставин патогенетичної моделі розвитку гіпертрофічногіперпластичного типу ожиріння з ознаками неасептичного запалення. Поставлена задача вирішується тим, що вагітну самицю піддають дії соціально-емоційного стресу з 2 по 8, а потім з 15 по 21 дні вагітності. Отримані нащадки у віці 11 місяців піддаються дії стресу харчової депривації та гіпокінезії. Технічний результат - розширення арсеналу та підвищення специфічності експериментальних моделей ожиріння шляхом відтворення гіпертрофічно-гіперпластичного типу ожиріння з наявністю ознак неасептичного запалення жирової тканини. Спосіб апробовано на 35 самцях щурів популяції Вістар - нащадках гестаційно стресованих матерів. Відібрані для експерименту молоді репродуктивнозрілі самиці спаровуються зі статево активними самцями за відомою методикою [23]. При цьому першим днем вагітності вважають той, коли у вагінальному мазку знаходять сперматозоїди. Вагітну самицю піддають дії соціальноемоційного стресу, для чого її поміщають кожного дня на 12 годин світлової частини доби до клітки, де знаходяться 20-25 статевозрілих невагітних самиць. Решту часу вагітна самиця перебуває в окремій клітці для відпочинку. Таке «занурення» у незнайомий соціум проводять двічі - з 2-го по 8-й день вагітності, а потім з 15-го по 21-й день вагітності. Склад оточення при цьому кожного разу змінюють. Щурята народжуються природним шляхом 5 53260 та в подальшому утримуються в рекомендованих для цих тварин умовах. По досягненню тваринами 11-місячного віку їх позбавляють їжі на 2 доби, а через 5 діб після відновлення харчування у них відтворюють стрес гіпокінезії шляхом утримання в спеціальних пеналах (1 година/3 доби). Через 1 місяць після закінчення експерименту тварин зважували, відсепаровували та зважували вісцеральну жирову тканину, визначали вагу її мезентеріальної фракції. Мезентеріальний жир фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, проводили заливку в парафін, зрізи товщиною 5 мкм фарбували гематоксилінеозином. Гістологічні препарати досліджені на світловому мікроскопі "Jenaval" (С. Zeiss, Jena), оцінена частота виявлення вогнищ макрофагальної інфільтрації на 100 полів зору [24]. В сироватці крові за допомогою високоспецифічного набору (Mause and rat leptin Elisa) визначали рівень лептину. Концентрацію неестерифікованих жирних кислот (НЕЖК) у сироватці крові оцінювали фотоколориметрично [25], а рівень тригліцеридів спектрофотометричним методом [26]. Як контроль використані 11-місячні нащадки інтактних самиць. Підтвердженням наявності ожиріння гіпертрофічно-гіперпластичного типу з ознаками запалення 6 є результати, отримані нами на 35 самицях щурів популяції Вістар - нащадках гестаційно стресованих матерів у співставленні з результатами дослідження, проведеного на такій же кількості нащадків інтактних самиць. Отримані дані наведені в таблиці та підтверджені гістологічними дослідженнями (Фіг.1-5). В результаті проведеного дослідження було встановлено, що через 1 місяць після закінчення гіпокінезії вага стресованих нащадків та маса їх вісцеральної жирової тканини статистично значуще більша контрольних тварин, що співпадає з виразним зростанням у цієї ж групи концентрації НЕЖК, тригліцеридів та лептину в сироватці крові (табл.) Гістологічне дослідження зрізів мезентеріальної жирової тканини показало, що основна маса тканини у піддослідних тварин, як і в контрольних, сформована окремими прошарками сполучної тканини, в якій проходять кровоносні судини різного калібру. Часточки складаються з достатньо крупних клітин - адипоцитів, яким притаманна округла або неправильно овальна форма, чіткі клітинні контури, світла, гомогенно зафарбована цитоплазма, плескаті, розташовані ексцентрично ядра. Адипоцити лежать щільно, за розмірами в базальному стані вони різні - від дрібних до крупних (в 2-3 рази більших) (Фіг.1). Таблиця Вагові та біохімічні показники обміну нащадків інтактних __ та ембріонально стресованих самиць щурів, ( x Показники Маса тіла, г Маса вісцеральної жирової тканини, г НЕЖК, ммоль/л Тригліцериди, ммоль/л Лептин __ S x ), n=35 Групи тварин Контрольні Стресовані до експерименту після експерименту до експерименту після експерименту 1 2 3 4 244,4±5,1 246,7±5,2 265,3±6,6 273,0±7,4 Р3-1