Штам вірусу кліщового енцефаліту flavivirus encephalitidem ixodicum №4396 для виготовлення специфічних імунобіологічних препаратів

Реферат: Штам вірусу кліщового енцефаліту Flavivirus encephalitidem ixodicum № 4396 ізольований 14.04.1986 р. від головного мозку 2-х полівок звичайних, зловлених 19.07.1985 р. в с. Краснолісся Симферопольського району Кримської області, депонований в Колекції штамів арбовірусів ДУ "Львівський НДІ епідеміології та гігієни МОЗ України" за № 83, для виготовлення специфічних імунобіологічних препаратів. UA 71097 U (12) UA 71097 U UA 71097 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до медичної вірусології, а саме до лабораторної діагностики і профілактики захворювань, що викликаються вірусом кліщового енцефаліту. На сьогодні відомі кілька штамів вірусу кліщового енцефаліту, які використовуються для виготовлення діагностичних та лікувально-профілактичних препаратів, серед яких найбільш широко вживаними для цих цілей в країнах колишнього Радянського Союзу є штами "Соф'їн", "Абсеттаров", "Пан" та інші [1]. В Україні в природних вогнищах кліщового енцефаліту циркулюють відмінні від вищезгаданих штамів збудники цієї інфекції, що спричиняють спорадичні та масові спалахи захворювання серед населення, серед яких відомим є штам № 2288 [2, 3, 4]. Однак, промислове виготовлення специфічних імунобіологічних препаратів із місцевих штамів до цього часу не налагоджено. Недоліком згаданих "сибірських" штамів арбовірусів є нижча їх авідність та специфічність у порівнянні із місцевими штамами, що негативно відображується на антигенній активності та профілактичній ефективності виготовлених із них препаратів при застосуванні їх в Україні. Задачею корисної моделі є новий оригінальний штам вірусу кліщового енцефаліту, що є етіологічним чинником захворювань людей в Україні і потенційним кандидатом для виготовлення імунобіологічних препаратів для діагностики, лікування та профілактики даної інфекції. Вирішити цю задачу можливо шляхом використання штаму вірусу кліщового енцефаліту (Flavivirus encephalitidem ixodicum) № 4396, ізольованого у Львівському НДІ епідеміології та гігієни 14.04.1986 р. від головного мозку 2-х полівок звичайних, зловлених 19.07.1985 р. в с. Краснолісся Сімферопольського району Кримської області [2]. Даний штам депонований в "Колекції штамів арбовірусів ДУ "Львівський НДІ епідеміології та гігієни МОЗ України" за № 83, яка згідно Постанови Кабінету Міністрів України № 1709 від 19.12.2001 р. віднесена до наукових об'єктів, що становлять національне надбання держави. Штам № 4396 належить до родини Flaviviridae, роду Flavivirus, західного підтипу комплексу кліщового енцефаліту і характеризується наступними ознаками. Він високопатогенний для лінійних і безпородних дорослих та новонароджених білих мишей, проявляючи 100 % сприйнятливість для організму цих тварин. При зараженні їх викликає типову картину експериментального енцефаліту з інкубаційним періодом при внутрішньомозковому шляху зараження 3-5 днів (максимальний титр 12,0 lg LD50/0,02 мл), при підшкірному шляху зараження - 4-7 днів, (максимальний титр 8,0 lg LD50/0,05 мл). Індекс інвазивності - 1,0-3,4. Порівнюючи ці дані із аналогічними показниками штамів Софіїн, Пан та № 2288, наведеними в таблиці 1, можна зробити висновок, що штам № 4396 належить до високовірулентних штамів даної групи вірусів, володіючи певними відмінностями щодо патогенності для лабораторних мишей. Таблиця 1 Характеристика штамів вірусу кліщового енцефаліту за ступенем вірулентності для білих безпородних мишей Штами 4396 Соф'їн Пан 2288 сисунки в/м 11,5 13,3 11,2 10,2 Нейровірулентність у lg LD50/0,02 мл 3-тижневі в/м п/ш І.і. в/м 9,0 7,5 1,5 7,5 8,5 8,0 9,5 8,7 0,8 7,7 дорослі п/ш 5,0 7,5 7,1 5,5 І.і. 2,5 1,0 0,9 2,2 Примітки: 1. в/м - внутрішньомозкове інфікування. 2. п/ш - підшкірне інфікування. 3.І.і. - індекс інвазивності 40 Штам № 4396 добре розмножується в перещеплюваній культурі клітин СНЕВ, викликаючи чітку деструкцію клітин на 3-4 добу. Пік накопичення інфекційної і гемаглютинуючої активності спостерігається на 4 добу. Титр по тканинній цитопатогенній дозі (ТЦД) корелює із показником інтрацеребральної активності і становить максимально 10,12 lg ТЦД50 в 0,1 мл, що є вищою 1 UA 71097 U 5 10 15 20 25 репродуктивною активністю в перещеплюваних клітинах лінії СНЕВ порівняно з аналогічним штамом № 2288, для якого цей показник становив 9,2 lg ТЦД50/0,1 мл. Гемаглютинуюча активність пропонованого штаму при репродукції в мозку мишей становить 1:320-1:1280 в зонах pH 6,3-6,7. В реакції біологічної нейтралізації штам № 4396 нейтралізується гомологічною сироваткою і сироватками до інших штамів вірусу кліщового енцефаліту. Індекс нейтралізації із гомологічною сироваткою - 3,7 lg. Із сироваткою до штаму Соф'їн він складає 2,1 lg, до штамів Абсеттаров, Пан, -2,3-2,5 lg, до штаму № 2288-3,0 lg. Антигенні властивості штаму № 4396 вивчені і в реакціях зв'язування комплементу (РЗК), гальмування гемаглютинації (РГГА) та непрямої імунофлюоресценції (РНІФ). Встановлено, що штам № 4396 володіє значно вищою антигенною активністю порівняно із штамами Соф'їн та Абсеттаров і щонайменше в 2 рази перевищує за титрами комерційний антиген кліщового енцефаліту виробництва Томского НПО "Віріон" (С. 81, К. 1751). Так, в перехресній РЗК при дослідженні гіперімунних сироваток та імунних асцитичних рідин безпородних білих мишей до вказаних серотипів вірусу кліщового енцефаліту з'ясовано, що антиген штаму № 4396 дає титри антитіл з гомологічною імунною сироваткою 1:512, з імунними сироватками еталонних штамів Абсеттаров і Пан, відповідно, -1:64 і 1:32, місцевого штаму № 2288-1:128. Ці результати свідчать про високу антигенну активність та чітку відмінність антигенної структури штаму № 4396 вірусу кліщового енцефаліту від "східного" і "західного" його різновидностей, та в деякій мірі і від його згаданого прототипу, циркулюючого в Україні - штаму № 2288. Виражені відмінності штаму № 4396 від штаму Соф'їн та № 2288 виявлені і при вивченні їх фізико-хімічних властивостей. Як видно із даних таблиці 2 індекси інактивації (різниця між контрольним титром і титром після обробки) пропонованого штаму ефіром (4,8), дезоксихолатом натрію (ДХ-Na) (3,7), ацетоном (4,10), підвищеною до +50 °C температурою (3,6) виразно відрізнялися від аналогічних показників прототипних штамів і вказують при цьому на більшу чутливість першого варіанту до дії фізико-хімічних факторів, що є позитивним моментом для виготовлення на його основі імунобіологічних препаратів. Таблиця 2 Результати вивчення фізико-хімічних властивостей штамів вірусів кліщового енцефаліту в культурі клітин СНЕВ Штами 4396 Соф'їн 2288 Контрольний титр* 9,8 8,7 9,2 Після обробки Після обробки ефіром** ДХ-Na** 5,2/4,6 5,9/3,9 5,2/3,5 5,2/3,5 6,4/2,8 7,2/2,0 Після обробки ацетоном** 5,6/4,2 5,0/3,7 6,2/3,0 Після термоінактивації** 6,4/3,4 6,1/2,6 7,4/1,8 Примітки: 1. * - в lg ТЦД50 в 0,1 мл. 2.** - в чисельнику титр після обробки, в знаменнику індекс інактивації. 30 35 40 Порівняльне вивчення імунобіологічних властивостей штамів вірусу кліщового енцефаліту проводили шляхом визначення здатності їх стимулювати у мишей утворення ендогенного інтерферону (ІФН) та антитіл (AT) до Т-залежного антигену еритроцитів барана. Встановлено (таблиця 3), що штам № 4396 володіє високою інтерфероніндукуючою активністю, хоча і дещо нижчою порівняно із штамом № 2288. Динаміка інтерфероноутворення, індукованого запропонованим штамом характеризується двома вираженими піками накопичення ІФН в крові: 640-1280 та 160 од/мл відповідно через 24 години і 12 днів після зараження дозою 10 ЛД 50/0,2 мл. Інфікування тварин нижчою у 50 разів дозою штаму № 4396 (0,2 ЛД 50/0,2 мл) викликає у перші дні інтерфероногенезу також високі концентрації сироваткового ІФН (160-320 од/мл), пік накопичення яких реєструвався через 48 годин, однак в подальшому на 2-му піку його активності вони сягали помірних величин (40 од/мл) і припадали лише 1 раз на 12 день після інфікування. 2 UA 71097 U Таблиця 3 Інтерфероніндукуюча активність вірусу кліщового енцефаліту штамів №№ 4396 та 2288 Штами Доза в ЛД50 № 4396 10 0,2 10 0,2 № 2288 Штами Доза в ЛД50 № 4396 10 0,2 10 0,2 № 2288 5 10 15 20 25 30 35 6 год.