Застосування морфолінію 2-(5-(4-піридил)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетату або піперидинію 2-(5-(фуран-2-іл)-4-феніл-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетату як нейротропних агентів

Реферат: Застосування морфолінію 2-(5-(4-піридил)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетату або піперидинію 2-(5-(фуран-2-іл)-4-феніл-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетату як нейротропних агентів. UA 76334 U (12) UA 76334 U UA 76334 U 5 10 15 Корисна модель належить до фармацевтичної хімії і медицини та може бути використана у створенні нових біологічно активних сполук, а також оригінальних лікарських засобів у ряді похідних 3-тіо-1,2,4-триазолу, і застосованою для лікування ішемічних порушень функції головного мозку. В умовах ішемії головного мозку активні форми кисню (АФК), за допомогою активації редокси-чутливих каскадів синтезу чинників ядерної транскрипції білка, підсилюють експресію прозапальних цитокінів, беруть участь у формуванні локального запального осередку в головному мозку, тим самим, підсилюючи явища набряку, головного мозку, ініціюють явища апоптозу і некрозу. Найбільш близькими структурними аналогами речовин, що заявляються, є 4-метил-1,2,4триазол-3-тіон, 4-феніл-1,2,4-триазол-3-тіон, 4-(2-толіл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 4-(2метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(4-нітрофеніл)-4-феніл-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(4нітрофеніл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(фуран-2-іл)-4-(2-толіл)-1,2,4-триазол-3тіон, 5-(фуран-2-іл)-4-(3-толіл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(фуран-2-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4триазол-3-тіон, що мають антиоксидантну активність (Патент України № 43771; Заявл. 27.04.2009; Опубл. 25.08.2009, Бюл. № 16.). Найближчим аналогом для речовини, що заявляється, є токоферолу ацетат (вітамін Е), що виявляє нейропротективну дію (нейропротектор антиоксидантного типу) (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - X.: Торсинг, 1998. - Т. 2.-592 с. (С. 95-96)) і має формулу: 20 CH3 O H3C O H2 C O CH3 25 30 35 H2 C CH3 H2 C C H H2 C CH3 (H2C)2 CH3 C H CH3 Токоферолу ацетат хоча і має нейропротективну дію, однак не є основним засобом, що застосовується при ішемічних ушкодженнях мозку. Крім того, даний препарат обмежено застосовують для лікування осіб, хворих на тяжкий кардіосклероз чи інфаркт міокарду. Суттєві ознаки аналогу і корисної моделі, що збігаються, є такими: - наявність в структурі циклічних органічних фрагментів ароматичного і гетероциклічного характеру; - молекули даних речовин містять атоми вуглецю, що мають ступінь окиснення -3,-2 і -1. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нових біологічно активних сполук, що можуть знайти своє застосування як оригінальні лікарські засоби в ряду похідних 3-тіо-1,2,4триазолу і проявляють нейропротекторну активність у порівнянні з контролем. Поставлена задача вирішується тим, що морфолінію 2-(5-(4-піридил)-4-(2-метоксифеніл)1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетат містить при N4-атомі ядра 1,2,4-триазолу 2-метоксифенільний замісник, в положенні 5 ядра 1,2,4-триазолу 4-піридиновий радикал, а також має в своєму складі двовалентний атом сірки, карбоксильну групу, з'єднану іонним зв'язком з молекулою морфоліну і має формулу: N N N N S H2 C O C O + H2N O OCH3 40 45 (сполука 1) піперидинію 2-(5-(фуран-2-іл)-4-феніл-1,2,4-триазол-3-ілтіо)ацетат містить при N4-aтомi ядра 1,2,4-триазолу фенільний замісник, в положенні 5 ядра 1,2,4-триазолу фуран-2-ільний радикал, а також має в своєму складі двовалентний атом сірки, карбоксильну групу, з'єднану іонним зв'язком з молекулою піперидину, і має формулу: 1 UA 76334 U N N O 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 N S H2 C O C O + H2N (сполука 2) Така структура сполук забезпечує виражений нейротропний ефект: здатність підвищувати виживаність тварин в умовах гострого порушення мозкового кровообігу; здатність впливати на вміст аденілових нуклеотидів, а саме підвищувати рівень АДФ, АТФ, АМФ та знижувати рівень ВВ-КФК; впливати на показники вуглеводного обміну в головному мозку, а саме підвищувати рівень пірувату та знижувати рівень лактату і малату; впливати на показники окислювальної модифікації білку в головному мозку на фоні ГПМК, а саме знижувати рівень продуктів окислювальної модифікації білку АФГ та КФГ; впливати на активність антиоксидантних ферментів, а саме підвищувати активність СОД, каталази, ГПР, та вміст альфа-токоферолу. Нейропротективну активність вивчали на білих щурах лінії Вістар обох статей, масою 150200 г. Всі тварини утримувалися на стандартному раціоні харчування віварію, при природній зміні дня і ночі. Щури отримані з інституту фармакології і токсикології АМН України. Всі експериментальні процедури і оперативні втручання здійснювали відповідно до "Положення про використання тварин в біомедичних дослідженнях" [Стефанов О.В. Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) // Київ: "Авіацена", 2002.-527 с.]. Двобічну перев'язку загальних сонних артерій виконували під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг), з використанням хірургічного доступу шляхом виділення сонних артерій і одномоментного накладення на них шовкової лігатури [Стефанов О.В. Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) // Київ: "Авіацена", 2002.-527 с.]. Двобічна перев'язка загальних сонних артерій спричиняла тяжкі неврологічні зміни у тварин: паралічі, парези, птоз, з максимальним проявом через 4 доби. Так, в ці терміни спостереження в групі нелікованих тварин середній бал за шкалою C.P.mcGrow складав 17,66 балу, що відповідає тяжкому ступеню неврологічної симптоматики (таблиця 1). Для вивчення дії препаратів окремим групам тварин вводили внутрішньочеревно сполуки 1 та 2, що заявляються, в дозі 50 мг/кг, одну групу залишали для контролю. З метою вивчення результатів фармакокорекції, у експериментальних тварин через 4 доби після операції забирався головний мозок. Для біохімічних досліджень використовувалися лобові долі кори. Для біохімічних досліджень тканини мозку гомогенізувалися на холоді, в сольовому ізотонічному середовищі (0,15 М KСl) при температурі +4 °C, за допомогою скляного гомогенізатора, в співвідношенні тканина-сольовий розчин 1:40. Після чого методом диференціального центрифугування виділялася цитозольна фракція (15000 g). Екстракцію ліпідів проводили по методу Кейтса [Прохорова М.И. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) - Л.: Изд-во Ленинградского университета.1982.-272 с.]. Безбілковий екстракт отримували додаванням точної навіски гомогенату тканини мозку в хлорну кислоту (0,6 М) із подальшою нейтралізацією 5,0 М розчином калію карбонату. Стан антиоксидантної системи оцінювали по активності СОД, каталази, ГПР, рівню αтокоферолу, показниках окислювальної модифікації білка в тканинах головного мозку [Прохорова М.И. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) - Л.: Изд-во Ленинградского университета.-1982.-272 с; Чевари Сюб Чаба И., Секей И. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах в клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. дело.-1988. - № 11. - С. 678-681.; Захарова Н.Б., Рубин В.И. Тонкослойная хромотография нуклеотидов эритроцитов на пластинках "Силуфол" // Лаб. дело.-1980. - № 12. - С. 735-738.]. Результати наведені в табл. 5. Стан вуглеводно-енергетичного обміну визначали по рівню найбільш важливих интермедіантів - АТФ, АДФ, АМФ. Про ішемічне пошкодження тканин головного мозку судили по гіперферментомії креатинфосфокінази (ВВ-КФК) [Захарова Н.Б., Рубин В.И. Тонкослойная хромотография нуклеотидов эритроцитов на пластинках "Силуфол" // Лаб. дело.-1980. - № 12. С. 735-738]. Результати наведені в табл. 2. Важливими показниками вуглеводного обміну є рівень пірувату, лактату і малату (табл. 2). 2 UA 76334 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Визначення активності СОД проводили по методиці, описаній Чеварі із співавторами. СОД конкурує з нітросинім тетразолієм (НСТ) за супероксидрадикали, що утворюються в внаслідок аеробної взаємодії НАДН і феназинметасульфату (ФМС). Внаслідок цієї реакції НСТ відновлюється до гідразинтетразолію. У присутності СОД відсоток відновлення НСТ змінюється. Активність СОД виражали в у. о./мг білка/хв. Результати наведені в табл. 5. Активність каталази визначали спектрофотометрично. Каталаза, що знаходиться в пробі, розкладає гідроген пероксиду, залишок пероксиду визначали по реакції з амонію молібдатом. Активність ферменту оцінювали за мірою розкладання водню пероксиду. Активність каталази виражали в мкат/мг білка/хв. Результати наведені в табл. 5. Активність глутатіонпероксидази (ГПР) визначали по методиці. ГПР відновлює за допомогою глутатіону відновленого (ГSH) гідроперекис терт-бутилу. Залишок відновленого терт-бутилу визначали по інтенсивності забарвлення з натрію нітропрусидом, що має максимум поглинання при довжині хвилі 540 нм. Активність ГПР оцінювали по спаду ГSH. Активність ГПР виражали в мкмоль ГSH/мг білка/хв. Результати наведені в табл. 5. 3+ 2+ Вміст α-токоферолу визначали спектрофотометрично, -токоферол відновлює Fe до Fe в 2+ еквівалентному співвідношенні. Fe , що утворився, утворює забарвлений комплекс ,'дипіридилом, з максимумом поглинання при довжині хвилі 540 нм. Вміст α-токоферолу виражали в мкм/г тканини. Результати наведені в табл. 5. Показники окислювальної модифікації білка в тканинах головного мозку визначали по методу В. Halliwell [Halliwell В. Molecular Biology of free Radicals in Human Diseases. - London: St. Lucia: OICA, 1999.-410 p.]. При взаємодії окислених амінокислотних залишків з 2,4динітрофенілгідразином (2,4-ДНФГ) утворюються 2,4-динітрофенілгідразони - альдегідні і карбоксильні угрупування амінокислотних залишків. Для альдегідфенілгідразонів спектр поглинання зареєстрований при довжині хвилі 274 нм, а для карбоксилфенілгідразону - при 363 нм. При спектрі хвиль 254, 272 і 280 нм визначали відповідно крупні, середні та дрібні фрагменти - ступінь дефрагментації білка. Активність ВВ-КФК визначали після поділу, на сефадексі ДЕАЕ-А-50 по оптичному тесту Варбурга. Принцип методу: креатинфосфокіназа КФК каталізує наступну реакцію: креатинфосфат + АДФ→ креатин + АТФ. Креатин, що утворюється в процесі реакції, може бути визначений по реакції з -нафтолом. Активність ферменту прямо пропорційна креатину, що утворився. Активність ВВ - КФК виражали в мкм/л/год. Результати наведені в табл. 4. Неврологічний дефіцит у тварин визначали за шкалою stroke-index С. P. McGrow. Важкість стану визначали по сумі відповідних балів: до 3 балів - легкий ступінь, з 3 до 7 балів - середній ступінь і з 7 балів і вище - тяжкий ступінь. Відзначали парези, паралічі кінцівок, тремор, манежні рухи, птоз, положення на боці, рухливість як прояв неврологічного дефіциту, розглядали утримування щурів на стрижні, що обертався, діаметром 15 см (швидкість 3 об/хв). Тварин тестували щодня, виставляючи суму балів [McGrow С. Р. Experimental Cerebral Infarction Effects of Pentobarbital in Mongolian Gerbils // Arch. Neurol.-1977. - Vol. 34, № 6. - P. 334-336]. Статистичну обробку даних проводили за параметричним критерієм t-Ст’юдента за допомогою програми "Biostat" і MS Excell. Таблиця 1 Вплив сполук, що заявляються, на виживаність і розвиток неврологічного дефіциту тварин в різні терміни після ГПМК Група тварин Контроль (ГПМК) Сполука 1 Сполука 2 Середній бал за шкалою С.Р. McGrow Через 24 Через 72 Через 48 годин 4-а доба години години К-ть тварин, що вижили, на 4-у добу % 16,5±1,32 17,0±1,59 19,12±0,52 16,66±1,02 32 11,67±0,84 12,73±1,24 9,1±0,71* 10,15±0,75 6,33±0,43* 8,52±0,68 5,52±0,51* 6,63±0,42 88 68 Примітка: * - р