Спосіб отримання s-енантіомерів 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3н-1,4-бенздіазепін-2-ону

Реферат: Спосіб отримання S-енантiомерів 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3H-1,4-бенздіазепін-2ону включає проведення стереоселективного гідролізу рацематів циклічних сполук та стереоселективний гідроліз. UA 76777 U (12) UA 76777 U UA 76777 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології і біоорганічної хімії, а саме до способу отримання за допомогою іммобілізованої мікросомальної фракції печінки свині S-енантіомерів 3-ацилокси7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3H-1,4-бенздіазепін-2-ону, які можуть знайти застосування у медицині і фармацевтичній промисловості. Відомий спосіб проведення енантіоселективного гідролізу 3-ацетокси-7-хлор-5-феніл-1,2дигідро-3H-1,4-бенздіазепiн-2-ону за допомогою вільної мікросомальної фракції печінки щурів (див. Yang S.K., Liu К., Guengerich F.P. Enantioselective hydrolysis of oxazepam 3-acetate by esterases in human and rat liver microsomes and rat brain S9 fraction// Chirality. - 1990. - Vol. 2, № 3. - P. 150-155). Відомий спосіб iммобілізації карбоксилестерази печінки свині в гранули альгінату натрію. Однак іммобілізований фермент використовувався для стереоселективного гідролізу офлоксацину, а не естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону. 2+ Спосіб передбачає використання гранул альгінату натрію, модифікованого Са з іммобілізованою в них карбоксилестеразою для отримання левофлоксацину (L-енантіомер офлоксацину) антибактеріального препарату, що належить до групи фторхінолонів. Реакцію проводили в реакторі періодичної дії в 0,1 моль/дм фосфатному буферному розчині рН 6,8, 30 °C і перемішуванні 200 об/хв. Після чого гранули видаляли з реакційного середовища, промивали буферним розчином і використовували повторно. Кінцевий продукт відокремлювали від реакційної суміші за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (див. Lee S.-Y., Min В.-Η., Hwang S.-H. et al. Enantioselective production of levofloxacin by immobilized porcine liver esterase// Biotechnol. Lett. - 2001. - Vol. 23, № 13. - P. 1033-1037). Даний спосіб взятий як найближчий аналог. Аналог та спосіб, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - проведення стереоселективного гідролізу естерів циклічних сполук. - використання препарату карбоксилестерази печінки свині, іммобілізованого в гранулах 2+ альгінату Na, модифікованого Са . Але відомий спосіб мав суттєві недоліки - комерційний препарат карбоксилестерази (Sigma Chemical Co., USA) має високу вартість, низький рівень збереження вихідної активності (58 %); розроблений у прототипі біокаталізатор використовується лише впродовж 5 циклів з 100 % збереженням естеразної активності, крім того, застосування високоефективної рідинної хроматографії не дозволяє отримувати продукт реакції в препаративній кількості. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу розробити спосіб отримання S-енантіомерів естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, в якому шляхом використання карбоксилестерази у складі мікросомальної фракції печінки свині можливо значно підвищити кількість циклів використання біокаталізатора, збереження його естеразної активності та збільшити доступність іммобілізованого препарату. Поставлена задача вирішена у способі отримання S-енантіомерів естерів 7-бром-3-гідрокси5-феніл-1,2~дигідро-3H-1,4-бенздіазепін-2-ону, тим що передбачає проведення стереоселективного гідролізу рацематів циклічних сполук за допомогою карбоксилестерази 2+ печінки свині, іммобілізованої в альгінаті Na, модифікованому Са , тим, що як циклічні сполуки використовують естери 3-гідрокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3H-1,4-бенздiазепін-2-ону, стереоселективний гідроліз яких здійснюють при температурі реакційного середовища 37 °C впродовж 1 години за допомогою карбоксилестерази у складі мікросомальної фракції печінки 3 свині (естеразна активність 258,7 од/см ), з наступним виділенням продукту з реакційного середовища методом колонкової хроматографії. Згідно з корисною моделлю, циклічні сполуки використовують естери 3-гідрокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3H-1,4-бенздіазепін-2-ону, стереоселективний гідроліз яких здійснюють при температурі реакційного середовища 37 °C впродовж 1 години за допомогою карбоксилестерази у складі мікросомальної фракції печінки 3 свині (естеразна активність 258,7 од/см ), з наступним виділенням продукту з реакційного середовища методом колонкової хроматографії. Корисна модель, що заявляється, містить такі нові ознаки: 2+ - одержання іммобілізованої в альгінаті Na, модифікованому Са , мікросомальної фракції печінки свині з 70 % збереженням вихідної активності мікросомальної фракції. - проведення стереоселективного гідролізу рацематів естерів 7-бром-3-гiдрокси-5-феніл-1,2дигiдро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону за допомогою іммобілізованої мікросомальної фракції печінки свині; - виділення продуктів реакції - S-енантіомерів естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигiдро3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону з реакційного середовища за допомогою колонкової хроматографії. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та досягнутим технічним результатом - проведення стереоселективного гідролізу рацематів естерів 7-бром-3-гідрокси-5 1 UA 76777 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, що здійснюють при температурі реакційного середовища 37 °C впродовж 1 години за допомогою карбоксилестерази у складі мікросомальної 3 фракції печінки свині (естеразна активність 258,7 од/см ) з наступним виділенням продукту з реакційного середовища методом колонкової хроматографії дозволяє отримувати Sенантіомери естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону впродовж 12 циклів використання біокаталiзатора з 100 % збереженням естеразної активності іммобілізованої мікросомальної фракції (70 % від вихідної активності вільної мікросомальної фракції). Добре відомо, що фармакологічна активність енантіомерів може значно відрізнятися (див. Спасов А.А., Иежица И.Н., Васильєв П.М. и др. Фармакология стереоизомеров лекарственных веществ. - Волгоград: Изд-во ВолгГМУ, 2011. - 348 с), тому стереохімічна характеристика хіральних лікарських препаратів є дуже важливою. Розробка препаративних методів розділення енантіомерів, в кількостях, необхідних для проведення фармакологічних досліджень, в тому числі естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, потенційних анксіолітичних і снодійних засобів (див. Сівко Г.І., Кириченко І.Μ., Мальцев Г.В., Семенішина Ε.Α., Павловський В.І., Кравченко І.A. Протисудомна активність складних ефірів 3гідроксифеназепаму при їх пероральному введенні// Одеський медичний журнал. - 2006. - Т. 96, № 4. - С 27-29), є актуальною. Карбоксилестераза печінки ссавців є перспективним біокаталiзатором енантiоселективного гідролізу і синтезу широкого ряду аліциклічних, карбоциклічних і гетероциклічних сполук (див. Bornscheuer U.T., Kazlauskas RJ.// Hydrolases in organic synthesis/ Wienheim, Wiley-VCH, 2006. 368 p. Але до недоліків комерційного препарату карбоксилестерази належить: нестабільність, висока вартість, однократність використання. Тому нами для проведення стереоселективного гідролізу естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону була вибрана мікросомальна фракція печінки свині, у зв'язку з її більшою доступністю: методика її виділення є більш простою, порівняно з високоочищеним препаратом карбоксилестерази. Заявлений спосіб забезпечує отримання S-енантiомерів естерів 7-бром-3-гiдрокси-5-феніл1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, краще збереження естеразної активності карбоксилестерази після іммобілізації, значне підвищення кратності застосування препарату з 100 % збереженням естеразної активності iммобілізованої мікросомальної фракції (70 % від активності вільної мікросомальної фракції) та збільшення кількості отриманого продукту. У даному способі з'ясовано залежність ступеня трансформації субстратів за допомогою 2+ мікросомальної фракції печінки свині, іммобілізованої в альгінаті натрію, модифікованому Са , від температури інкубаційного середовища і активності біокаталізатора. Також встановлено залежність естеразної активності біокаталізатора, необхідної для досягнення 50 % ступеня трансформації субстратів, від їх структури. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином. У розчин, що містить естер 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепiн-2-ону 3 з концентрацією 0,5 ммоль/дм , диметилсульфоксид і дистильовану воду в співвідношенні 2:3, вводили мікросомальну фракцію, попередньо змішану з 4 % розчином альгінату Na, і утворенням в результаті гранул, стабілізованих 5 % водним розчином хлориду кальцію. Реакційну суміш витримували при перемішуванні (250 об/хв) при температурі 37 °C протягом 60 хв. Через 60 хв інкубації при 37 °C гранули з включеною мікросомальною фракцією відокремлювали фільтруванням та використовували багаторазово (до 12 раз з 100 % збереженням активності іммобілізованого препарату), введенням в новий розчин з описаними вище компонентами. Отриманий S-енантіомер естеру 7-бром-3-гiдрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н1,4-бенздіазепін-2-ону виділяли з реакційної суміші екстрагуванням хлороформом з подальшим виділенням методом колоночної хроматографії (носій: силікагель L 40/100 , Chemapol, Чехія) з використанням системи хлороформ:етилацетат 1,5:2,5. Структуру S-енантіомеру встановлювали за допомогою рентгеноструктурного аналізу (рентгенівські дифракційні дані вимірювалили при tкімн. в монокристальному дифрактометрі "Oxford Diffraction SuperNova" з мікрофокусним джерелом СuКа випромінювання (=1,54184)), кут обертання - поляриметричним методом (вимірювали на поляриметрі Perkin-Elmer 241-MC). Приклади здійснення способу: Приклад 1. 3 В ємність, що містить 1 дм розчину 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,43 бенздіазепін-2-ону з концентрацією 0,5 ммоль/дм , приготованого на суміші диметилсульфоксид: дистильована вода в співвідношенні 2:3, вводили мікросомальну фракцію 2 UA 76777 U 3 5 10 (естеразна активність 258,7 од/см ), попередньо змішаною з 4 % розчином альгінату натрію, і утворенням в результаті гранул, стабілізованих 5 % водним розчином хлориду кальцію. Реакційну суміш витримували при перемішуванні (250 об/хв) при 37 °C протягом 60 хв. Після інкубації гранули відокремлювали фільтруванням та використовували багаторазово (до 12 раз з 100 % збереженням естеразної активності іммобілізованного препарату), введенням в новий розчин з описаними вище компонентами. Отриманий S-енантіомер 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепiн-2-ону 3 виділяли з реакційної суміші екстракцією 0,75 дм хлороформу і наступною колонковою хроматографією (носій: силікагель L 40/100 , Chemapol, Чехія) з використанням системи хлороформ:етилацетат=1,5:2,5. Вихід продукту становив 50 % (50,0 мг). Кут обертання [ ]D =+195,3°, с=1 в хлороформі. Приклади №№ 2-6 ілюструють здійснення способу аналогічно прикладу № 1, але при використанні різних температур (10-50 °C) реакційного середовища. Приклади №№ 7-9 демонструють здійснення способу аналогічно прикладу № 1, але при використанні біокаталізатора з різною естеразною активністю. В таблиці 1 наведена залежність ступеня трансформації 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-онів за допомогою іммобілізованої мікросомальної фракції печінки свині, від температури інкубаційного середовища і активності біокаталізатора. Приклади №№ 10-18 ілюструють здійснення способу аналогічно прикладу № 1, але при використанні інших естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигiдро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону. В таблиці 2 наведена залежність естеразної активності іммобілізованої мікросомальної фракції, необхідної для 50 % ступеня гідролізу субстратів від структури 3-ацилокси-7-бром-5феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-онів. На фіг. 1 наведена залежність ступеня трансформації 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону від кратності використання бiокаталізатора. Фіг.1 демонструє, що іммобілізований препарат мікросомальної фракції каталізує енантіоселективний гідроліз 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4бенздіазепін-2-ону з 100 % збереженням естеразної активності впродовж 12 циклів використання біокаталізатора. Показано, що естеразна активність іммобілізованої мікросомальної фракції відносно до вивчуваних естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро3Н-1,4-бенздiазепін-2-ону носить нелінійний характер. Так, естеразна активність, що необхідна 3 для 50 % трансформації субстрату, становила 167,9 од/см для 3-пропінілокси-7-бром-5-феніл1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону (приклад 11), в той час як для сполук з прикладів 10 і 12, 3 3 необхідна кількість бiокаталізатора становила 258,7 од/см і 189,1 од/см , відповідно. Також встановлено, що введення алкільних замісників в перше положення молекули субстрату (приклади 17, 18) приводить до збільшення необхідної естеразної активності. Отримані результати дозволяють прийти до наступного висновку: розроблений спосіб дозволяє отримувати S-енантіомери естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4бенздіазепін-2-ону у препаративних кількостях та можливістю багаторазового використання біокаталізатора. 20 15 20 25 30 35 40 Таблиця 1 №№ Τ, °C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 37 10 20 30 40 50 37 37 37 Естеразна активність біокаталізатора, 3 од/см 258,7 258,7 258,7 258,7 258,7 258,7 77,6 142,3 188,9 3 Ступінь трансформації, % 50,0 15,0 17,5 34,8 48,7 25,4 14,6 22,9 35,3 UA 76777 U Таблиця 2 R 1 O N O R N Br 2 O №№ прикладу 10* 11 12 13 14 15 16 17** 18*** R 1 Η Η Η Η Η Η Η СН3 С2Н5 R 2 СН3 С2Н5 С3Н7 С4Н9 С5Н11 С6Н13 С7Н15 СН3 СН3 Естеразна активність біокаталізатора, 3 од/см 258,7 167,9 189,1 204,0 203,2 204,3 275,6 286,0 291,2 [ ]20 (С=1, в хлороформі): *+116,9°, ** +195,3°, *"+ 193,8°. D Вихід: *50,0 % (50,0 мг), **46,2 % (46,2 мг), ***43,1 % (43,1 мг) ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб отримання S-енантiомерів 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3H-1,4-бенздіазепін-2ону, що передбачає проведення стереоселективного гідролізу рацематів циклічних сполук за допомогою карбоксилестерази печінки свині, іммобілізованої в альгінаті Na, модифікованому 2+ Са , який відрізняється тим, що як циклічні сполуки використовують естери 3-гідрокси-7-бром5-феніл-1,2-дигiдро-3H-1,4-бенздіазепін-2-ону, стереоселективний гідроліз яких здійснюють при температурі реакційного середовища 37 °C впродовж 1 години за допомогою карбоксилестерази у складі мікросомальної фракції печінки свині (естеразна активність 258,7 3 од/см ), з наступним виділенням продукту з реакційного середовища методом колонкової хроматографії. 4 UA 76777 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5