Спосіб отримання s-енантіомерів 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3н-1,4-бенздіазепін-2-ону

Реферат: Спосіб отримання S-енантіомерів 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2ону, включає проведення стереоселективного гідролізу циклічної сполуки, як циклічну сполуку використовують 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-он, здійснення стереоселективного гідролізу, виділення кінцевого продукту з реакційного середовища методом колонкової хроматографії. UA 75709 U (12) UA 75709 U UA 75709 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології і біоорганічної хімії, а саме до способу отримання за допомогою іммобілізованої мікросомальної фракції печінки свині S-енантіомерів 3-ацилокси7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, які можуть знайти застосування у медицині і фармацевтичній промисловості. Відомий спосіб проведення енантіоселективного гідролізу 3-ацетокси-7-хлор-5-феніл-1,2дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону за допомогою вільної мікросомальної фракції печінки щурів (див. Yang S.K., Liu K., Guengerich F.P. Enantioselective hydrolysis of oxazepam 3-acetate by esterases in human and rat liver microsomes and rat brain S9 fraction // Chirality. - 1990. - Vol. 2, № 3. - P. 150-155). Відомий спосіб іммобілізації карбоксилестерази печінки свині в гранули к-карагінану. Однак отриманий препарат іммобілізованого ферменту використовувався для хемоселективного гідролізу метил-2-ацетоксибензоату, а не естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,42+ бенздіазепін-2-ону. Спосіб передбачає використання гранул карагінану, модифікованого Са з іммобілізованою в них карбоксилестеразою для хемоселективного гідролізу метил-2ацетоксибензоату. Реакцію проводили в реакторі періодичної дії у водно-органічному середовищі ацетон:фосфатний буферний розчин (рН 5-8) = 1:9. Після чого гранули видаляли з реакційного середовища, промивали буферним розчином і використовували повторно. Кінцевий продукт відокремлювали від реакційної суміші за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (див. P.D. Desail, A.M. Davel, S. Devi. Chemoselective hydrolysis of methyl 2-acetoxybenzoate using free and entrapped esterase in к-carrageenan beads // Journal of Applied Polymer Science. - 2008. Vol. 108, № 4. - P. 2617-2622). Даний спосіб вибрано найближчим аналогом. Найближчий аналог та спосіб, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - проведення селективного гідролізу естерів циклічних сполук. - використання препарату карбоксилестерази печінки свині, іммобілізованого в гранулах 2+ карагінану, модифікованого Са . Але відомий спосіб мав суттєві недоліки - комерційний препарат карбоксилестерази (Sigma Chemical Co., USA) має високу вартість, низький рівень збереження вихідної активності (48 %); розроблений у найближчому аналозі біокаталізатор використовується лише впродовж 1 циклу зі 100 % збереженням естеразної активності і впродовж 7 циклів з 50 % збереженням активності, крім того, застосування високоефективної рідинної хроматографії не дозволяє отримувати продукт реакції в препаративній кількості. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлена задача розробити спосіб отримання S-енантіомерів естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, в якому шляхом використання карбоксилестерази у складі мікросомальної фракції можливо значно підвищити кількість циклів використання біокаталізатора, підвищити збереження естеразної активності іммобілізованого у карагінан Phyllophora nervosa препарату та збільшити доступність іммобілізованого препарату. Поставлена задача вирішується тим, що у способі отримання S-енантіомерів естерів 7бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, що включає їх одержання за 2+ допомогою карбоксилестерази печінки свині, іммобілізованої в карагінан, модифікований Са , тим, що стереоселективний гідроліз рацематів естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону проводили за допомогою карбоксилестерази у складі мікросомальної фракції печінки свині, іммобілізованою в гелі карагінану з чорноморської водорості Phyllophora 2+ nervosa, модифікованого Са при рН реакційного середовища 7,0, при температурі 37 °С, з наступним відокремленням кінцевого продукту методом колонкової хроматографії. Новим в корисній моделі, що заявляється, є те, що отримують S-енантіомери естерів 7бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону за допомогою карбоксилестерази у складі мікросомальної фракції печінки свині, іммобілізованої у карагінан з чорноморської 2+ водорості Phyllophora nervosa, модифікованого Са при рН реакційного середовища 7,0, температурі 37 °С з наступним відокремленням кінцевого продукту методом колонкової хроматографії. Корисна модель, що заявляється, містить такі нові ознаки: - одержання іммобілізованої в карагінан з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, 2+ модифікованого Са , мікросомальної фракції печінки свині з 80 %-ним збереженням вихідної естеразної активності; - проведення стереоселективного гідролізу рацематів естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону за допомогою іммобілізованої мікросомальної фракції печінки свині; 1 UA 75709 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - виділення продуктів реакції - S-енантіомерів естерів 7-бром-3-гідрокси-5 -феніл-1,2дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону з реакційного середовища за допомогою колонкової хроматографії. Відомо, що енантіомери біологічно активних речовин можуть мати суттєві відмінності у своїх фармакологічних властивостях (див. Ariëns E.J. Stereochemistry, a basis for sophisticated nonsense in pharmacokinetics and clinical pharmacology // Eur. J. Clin. Pharmacol. - 1984. - V.26, № 6. - P. 663-668). Оскільки розділення енантіомерів сполук пов'язано з рядом труднощів, перспективна розробка препаративних біотехнологічних методів отримання стереоізомерів, що дозволяють виділяти речовини з високим ступенем енантіомерної чистоти, в кількостях, необхідних для проведення фармакологічних досліджень. Карбоксилестерази печінки ссавців є перспективним біокаталізатором енантіоселективного гідролізу і синтезу широкого ряду аліциклічних, карбоциклічних і гетероциклічних сполук (див. Bornscheuer U.T., Kazlauskas R.J. // Hydrolases in organic synthesis / Wienheim, Wiley-VCH, 2006. 368 p.), в тому числі естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, потенційних анксіолітичних і снодійних засобів (див. Сівко Г.І., Кириченко І.М., Мальцев Г.В., Семенішина Е.А., Павловський В.І., Кравченко І.А. Протисудомна активність складних ефірів 3гідроксифеназепаму при їх пероральному введенні // Одеський медичний журнал. - 2006. - Т.96, № 4. - С 27-29). Комерційний препарат ферменту має ряд недоліків: нестабільність, високу вартість, однократність використання. Тому нами для проведення стереоселектівного гідролізу естерів 7бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону була обрана мікросомальна фракція печінки свині, у зв'язку з її більшою доступністю: методика її виділення є більш простою, порівняно з високо очищеним препаратом карбоксилестерази. Використання для іммобілізації мікросомальної фракції каррагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, обґрунтовано його більшою доступністю і економічністю, порівняно з фірмовими препаратами. Заявлений спосіб забезпечує отримання S-енантіомерів естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону, краще збереження естеразної активності карбоксилестерази після іммобілізації, значне підвищення кратності застосування препарату з 100 % збереженням активності ферменту та збільшення кількості отриманого продукту. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином. У розчин, що містить естер 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону 3 з концентрацією 0,5 ммоль/дм , диметилсульфоксид і К-фосфатний буферний розчин (0,0167 3 моль/дм , рН 7,0) в співвідношенні 2:3 вводили мікросомальну фракцію, попередньо змішану з 4 % розчином карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, і утворенням в результаті гранул, стабілізованих 20 % водним розчином хлориду кальцію. Реакційну суміш витримували при перемішуванні (250 об/хв) при температурі 37 °C протягом 60 хв. Через 60 хв. інкубації при 37 °C гранули з включеною мікросомальною фракцією відокремлюють фільтруванням та використовують багаторазово (до 5 раз з 100 % збереженням активності іммобілізованого препарату), введенням в новий розчин з описаними вище компонентами. Отриманий S-енантіомер естеру 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін2-ону виділяють з реакційної суміші екстрагуванням хлороформом з подальшим виділенням методом колонкової хроматографії (носій силікагель L 40/100 μ, Chemapol, Чехія) з використанням системи хлороформ:етилацетат 3:1. Структуру S-енантіомеру встановлюють за допомогою рентгеноструктурного аналізу (рентгенівські дифракційні дані виміряли при tкімн. в монокристальному дифрактометрі "Oxford Diffraction SuperNova" з мікрофокусним джерелом CuКa випромінювання ( = 1,54184)), кут обертання - поляриметричним методом (вимірювали на поляриметрі Perkin-Elmer 241-MC). Приклади здійснення способу: Приклад 1. 3 В ємність, що містить 1 дм розчину 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,43 бенздіазепін-2-ону з концентрацією 0,5 ммоль/ дм , приготованого на суміші 3 диметилсульфоксид: К-фосфатний буферний розчин (0,0167 моль/дм , рН 7,0) в співвідношенні 3 2:3, вводили мікросомальну фракцію (естеразна активність 199,2 од/см ), попередньо змішаною з 4 % розчином карагінану, і утворенням в результаті гранул, стабілізованих 20 % водним розчином хлориду кальцію. Реакційну суміш витримували при перемішуванні (250 об/хв) при температурі 37 °C протягом 60 хв. Після інкубації гранули з включеною мікросомальною фракцією відокремлювали фільтруванням та використовували багаторазово (до 5 разів з 100 % збереженням естеразної 2 UA 75709 U 5 10 15 20 25 30 активності іммобілізованого препарату), введенням в новий розчин з описаними вище компонентами. Отриманий S-енантіомер 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону 3 виділяли з реакційної суміші екстракцією 0,75 дм хлороформу і наступною колоночною хроматографією (носій силікагель L 40/100 μ, Chemapol, Чехія) з використанням системи хлороформ:етилацетат=3:1. 20 Вихід продукту становив 50 %. Кут обертання  D  195,3  , с=1 в хлороформі. Приклади №№ 2-13 ілюструють здійснення способу аналогічно прикладу № 1, але при використанні різних температур (10-50 °C) і рН (3,0-10,0) реакційного середовища. Приклади №№ 14-16 демонструють здійснення способу аналогічно прикладу № 1, але при використанні біокаталізатора з різною естеразною активністю. В таблиці 1 наведена залежність естеразної активності мікросомальної фракції печінки 2+ свині, іммобілізованої в карагінан Phyllophora nervosa, модифікований Са , від температури, рН інкубаційного середовища і активності біокаталізатора. Креслення демонструє, що іммобілізований препарат мікросомальної фракції каталізує енантіоселективний гідроліз 3-ацетокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону з 100 %-им збереженням естеразної активності впродовж 5 циклів використання біокаталізатору. Приклади №№ 17-34 ілюструють здійснення способу аналогічно прикладу № 1, але при використанні інших естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону та різного часу проведення енантіоселективного гідролізу. В таблиці 2 наведена естеразна активність мікросомальної фракції печінки свині, 2+ іммобілізованої в карагінан, з Phyllophora nervosa, модифікований Са , що необхідна для 50 % ступеня гідролізу 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-онів при різному часі проведення реакції. Як видно з наведених даних, використання інших естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ону або змінення часу проведення реакції для отримання Sенантіомерів потребує змінення активності біокаталізатора для досягнення 50 % ступеня гідролізу субстратів (див. приклади №№ 17-34). Отримані результати дозволяють прийти до наступного висновку: розроблений спосіб дозволяє отримувати S-енантіомери естерів 7-бром-3-гідрокси-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4бенздіазепін-2-ону у препаративних кількостях та можливістю багаторазового використання біокаталізатора. Таблиця 1 №№ T, °C рН 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 37 10 20 30 40 50 37 37 37 37 37 37 37 37 37 37 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 9,0 10,0 7,0 7,0 7,0 Естеразна активність 3 біокаталізатора, од/см 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 199,2 49,8 99,6 149,4 35 3 Вихід продукту, % 50,0 13,0 19,0 32,8 47,8 20,5 6,7 11,6 26,7 37,3 45,5 47,6 41,7 12,3 25,8 37,1 UA 75709 U Таблиця 2 R1 O N O R2 N Br O №№ прикладу 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 R 1 R 2 H СН3 H С2Н5 Н С3Н7 Н С4Н9 Н С5Н11 Н С6Н13 Н С7Н15 СН3 СН3 С2Н5 СН3 Час проведення гідролізу, год. 1 2,5 1 2,5 1 2,5 1 2,5 1 2,5 1 2,5 1 2,5 1 2,5 1 2,5 Естеразна активність 3 біокаталізатора, од/см 199,2 100,0 129,2 65,9 146,4 77,6 157,8 79,6 157,1 83,3 173,2 88,3 212,0 110,24 220,3 112,9 224,4 115,0 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб отримання S-енантіомерів 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2ону, що передбачає проведення стереоселективного гідролізу циклічної сполуки за допомогою 2+ карбоксилестерази печінки свині, іммобілізованої в карагінані, модифікованому Са , який відрізняється тим, що як циклічну сполуку використовують 3-ацилокси-7-бром-5-феніл-1,2дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-он, стереоселективний гідроліз якого здійснюють при рН реакційного середовища 7,0, температурі 37 ºС за допомогою карбоксилестерази у складі 3 мікросомальної фракції печінки свині (естеразна активність 199,2 од/см ), іммобілізованої в гелі карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, з наступним виділенням кінцевого продукту з реакційного середовища методом колонкової хроматографії. 4 UA 75709 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5