Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб отримання охратоксину А, який включає використання як продуцента культуру гриба Aspergillus ochraceus, яку вносять у попередньо підготовлене зерно пшениці, культивування при температурі 30 °С протягом 14 днів, інактивування вегетативних форм гриба автоклавуванням та екстракцію охратоксину хлороформом з ортофосфорною кислотою, упарювання хлороформних екстрактів до густого залишку і визначення в ньому охратоксину А хроматографічним шляхом, який відрізняється тим, що як продуцент охратоксину А в способі використовують 10 денну культуру гриба Aspergillus ochraceus штам №7, вирощену на агарі Чапека при t=29 ° C, яку попередньо суспензують у 20 см3 розчину середовища Чапека без агар-агару і вносять у 100 г пшениці, з додаванням 80 см3 розчину, що вміщує глюкозу, натрію нітрат, магнію сульфат, калію хлорид, заліза (II) сульфат, калію-фосфат двозаміщений та дистильовану воду, культивування здійснюють при t=29 °С протягом 14 днів після чого культуру грибів у зерні з накопиченим охратоксином А інактивують автоклавуванням при 1атм протягом 1 години.

Текст

Реферат: Спосіб отримання охратоксину А включає використання як продуцента культуру гриба Aspergillus ochraceus, яку вносять у попередньо підготовлене зерно пшениці, культивування, інактивування вегетативних форм гриба та екстракцію охратоксину хлороформом з ортофосфорною кислотою, упарювання хлороформних екстрактів і визначення в ньому охратоксину А хроматографічним шляхом. Як продуцент охратоксину А в способі використовують культуру гриба Aspergillus ochraceus штам № 7. UA 77052 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ОХРАТОКСИНУ А UA 77052 U UA 77052 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі мікології, зокрема до методів виділення і дослідження токсичних метаболітів плісеневих грибів, що уражають переважно корми рослинного походження. Корисна модель може бути використана для дослідження здатності Aspergillus ochraceus продукувати охратоксини, з метою використання охраткосинів в наукових експериментах, а також в біологічних, медичних, ветеринарних установах, котрі займаються дослідженням мікроскопічних грибів та їх вторинних метаболітів, у біотехнологічній промисловості - для отримання охратоксинів, які можуть використовуватись як стандарти при визначенні вмісту охратоксинів хроматографічними методами у кормах для тварин, харчових продуктах, в органах і тканинах тощо. В процесі своєї життєдіяльності мікроскопічні гриби виділяють мікотоксини - вторинні низькомолекулярні метаболіти, які мають виражений токсичний вплив. Охратоксини - це група структурно-споріднених сполук, а саме ізокумаринів, зв'язаних пептидним зв'язком з Lфенілаланіном. Охратоксин А - це 5-хлорізокумарин, зв'язаний пептидним зв'язком з Lфенілаланшом. Основними продуцентами охратоксину А є Aspergillus ochraceus і Penicillium viridicatum. Зазначені плісеневі гриби, за сприятливих умов, уражають корми рослинного походження і в процесі своєї життєдіяльності виділяють токсичні метаболіти, одним з яких є охратоксин А. Більшість відомих на сьогодні способів отримання охратоксинів, базуються на культивуванні продуцентів охратоксинів на зерні злакових культур або твердому рисовому середовищі, з додаванням 2 % дріжджового екстракту та % фенілаланіну та з наступною екстракцією охратоксинів сумішшю хлороформу та 0,1 н. розчину ортофосфорної кислоти, реекстракції мікотоксину з хлороформі в 0,1 н. розчин натрію двовуглекислого, відділенні лужного розчину від хлороформу, підкислення його мурашиною кислотою до рН 2-3, реекстракції мікотоксину в нову порцію хлороформу, концентрації його і розділенням методом хроматографії в тонкому шарі ("Лабораторные исследования в ветеринарии. Биохимические и микологические. - Под ред. Б.И. Антонова / М.: 1991.-287 с.). Відомий спосіб виділення охратоксину А з зернофуражу, продуктів його переробки та комбікормів (кн: "Лабораторные исследования в ветеринарии. Биохимические и микологические. - Под ред. Б.И. Антонова / М., 1991. С. 133-135"), який базується на екстракції охраткосину А сумішшю хлороформу та 0,1 н. розчину ортофосфорної кислоти, реекстракції мікотоксину з хлороформу в 0,1 н розчин натрію двовуглекистого, відділенні лужного розчину від хлороформу, підкислення його мурашиною кислотою до рН 2-3, реекстракції мікотоксину в нову порцію хлороформу, концентрації його і розділенням методом хроматографії в тонкому шарі. Недоліком цього способу є довготривалість проведення та надмірне використання реактивів, прогнозована низька кількість отриманих мікотоксинів. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб одержання охратоксину А з використанням штаму гриба Aspergillus ochraceus 740 / ПУ на винахід №10475 А / Спосіб включає культивування гриба з метою накопичення охратоксину А: у вірусологічні 3 3 матраци ємністю 1000 см поміщають 100 г пшениці, додають 80 см водопровідної води, закривають ватно-марлевим корком, обв'язують пергаментним папером і стерилізують в автоклаві при 1 атм 1 год. Як інокулюм використовують 10-ти добову культуру гриба Aspergillus 3 ochraceus, штам 740, вирощену при 30 °C на агарі Чапека. Потім додають в пробірку 5 см стерильної водопровідної води і піпеткою зіскоблюють міцелій з поверхні культури, при цьому старанно перемішуючи з водою елементи гриба. Отриману водну суспензію вносять в матрац зі стерильною пшеницею, старанно струшують і поміщають в термостат при 30 °C на 15 діб. Після закінчення культивування зерно з культурою грибів знешкоджують шляхом автоклавування протягом 20 хв. при 0,5 атм. Після цього відбирають наважку масою 50 г, яку переносять в колбу ємністю 500 мл. В колбу вносять 25 мл 0,1 Μ розчину ортофосфорної кислоти та 250 мл хлороформу. Екстрагують мікотоксин, струшуючи вміст колби на шутель-апараті протягом 30 хв. або настоюванням протягом 12 год. Екстракт відділяють від зерна фільтрацією через паперовий фільтр. Фільтрат переносять в ділильну лійку ємністю 500 мл, додають 200 мл 0,1 н розчину натрію двовуглекислого, вмістиме добре перемішують. Після розділення суміші шар хлороформу видаляють, водний залишок підкислюють мурашиною кислотою до рН 2-3 і додають 50 мл хлороформу, який після відділення об'єднують з першою порцією і випарюють до густого залишку за температури не вище 60 °C. Залишок екстракту в фарфоровій чашці використовують для кількісного визначення вмісту охратоксину А (за допомогою хроматографічних методів дослідження). Вміст охратоксину А в п'ятнадцятидобовій культурі коливається в межах 1,5-2,1 г/кг. 1 UA 77052 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений спосіб і найближчий аналог мають суттєві спільні ознаки: спосіб включає використання як продуцента культуру гриба Aspergillus ochraceus, яку вносять у попередньо підготовлене зерно пшениці, культивування при температурі 30 °C, протягом 14 днів, інактивування вегетативних форм гриба здійснюють автоклавуванням. Екстракцію охратоксину А проводять хлороформом з ортофосфорною кислотою, з наступним упарюванням хлороформних екстрактів до густого залишку і визначенням в ньому охратоксину А методом рідинної хроматографії. Недоліком цього способу є низька кількість отримуваного охратоксину А та недостатній режим автоклавування нативної культури, що може спричинити ураження грибами лабораторії та людей, які у ній працюють. Запропонований нами спосіб усуває недоліки найближчого аналога і забезпечує швидке і ефективне отримання охратоксинів. Цей спосіб є нескладний у виконанні, не потребує дорогих матеріалів. Він не вимагає складного спеціального обладнання, інструментарію, ним може оволодіти працівник без спеціальної освіти. В основу корисної моделі поставлена задача розробити зручний, ефективний, економічно вигідний і нескладний у практичному використанні спосіб отримання охратоксину А. Поставлена задача вирішується тим, що як продуцент охратоксину А в способі використовують 10 денну культуру Aspergillus ochraceus штам № 7 вирощену на агарі Чапека 3 при t=29 °C, яку попередньо суспендують у 20 см розчину середовища Чапека без агар-агару, 3 що вносять у 100 г пшениці з додаванням 80 см розчину, що вміщує глюкозу, натрію нітрат, магнію сульфат, калію хлорид, заліза (II) сульфат, калію-фосфат двозаміщений та дистильовану воду. В процесі росту Aspergillus ochraceus штам № 7 (протягом 14 діб при температурі 29 °C) на описаному субстраті гриби виділяють охратоксини. Після 14 днів культивування зерно з культурою грибів і накопиченими охратоксинами інактивують автоклавуванням (при 1 атм 1 год.) з метою знищення вегетативних форм грибів. За таких умов мікотоксини не руйнуються. Після автоклавування в колбу вносять 100 г субстрату, додають 50 мл 0,1 Μ розчину ортофосфорної кислоти та 500 мл хлороформу. Екстрагують мікотоксин, струшуючи вміст колби на шутельапараті протягом 30 хв. або настоюванням протягом 12 год. Екстракт відділяють від субстрату фільтрацією через паперовий фільтр на лійці Бюхнера під від'ємним тиском. Фільтрат переносять в ділильну лійку ємністю 2000 мл, додають 400 мл 0,1 н розчину натрію двовуглекислого, вміст добре перемішують. Після розділення суміші шар хлороформу зливають через нижній край ділильної лійки, а водний залишок підкислюють мурашиною кислотою до рН 2-3 і додають 100 мл хлороформу, який після відділення об'єднують з першою порцією і випарюють у скляному дистиляційному апараті до густого залишку за температури не вище 60 °C. Залишок екстракту в колбі використовують для кількісного визначення вмісту охратоксину А (за допомогою хроматографічних методів дослідження). Технічний результат заявленого способу забезпечується внаслідок ретельного виконання всіх етапів способу, які відрізняються від найближчого аналога. 3 3 У вірусологічні матраци ємністю 1000 см поміщають 100 г пшениці, додають 80 см рідини наступного складу: глюкоза - 30 г, натрію нітрат -2 г, магнію сульфат - 0,5 г, калію хлорид - 0,5 г, заліза (II) сульфат - 0,01 г, калію-фосфат двозаміщений -1г, Н2О дистильована до 1 л). закривають ватно-марлевою пробкою, обв'язують пергаментним папером і стерилізують в автоклаві при 1 атм 1 год. Як інокулюм використовують 10 денну культуру Aspergillus ochraceus штам №7, вирощену при 29 °C на агарі Чапека. При цьому міцелій гриба знімають з середовища Чапека мікологічним гачком і вносять у 10 мл стерильного розчину середовища Чапека без агар-агару. Останнє додають у матрац зі стерильним зерном пшениці. Матрац старанно струшують, поміщають в термостат при 29 °C на 14 діб. Після закінчення культивування нативну культуру знешкоджуємо автоклавуванням при 1 атм протягом 1 год. Після цього в колбу вносимо 50 мл 0,1 Μ розчину ортофосфорної кислоти та 500 мл хлороформу. Екстрагуємо охраткосин А струшуючи його на шутель-апараті протягом 30 хв. Екстракт фільтруємо через паперовий фільтр, переносимо в ділильну лійку ємністю 1000 мл, додають 400 мл 0,1 н розчину натрію двовуглекислого, вміст добре перемішуємо. Після розділення суміші шар хлороформу зливаємо у фарфорову чашку, а водний залишок повторно обробляємо 100 мл хлороформу, який після відділення об'єднуємо з першою порцією і випарюємо до сухого стану за температури не вище 60 °C. Залишок екстракту в фарфоровій чашці використовуємо для кількісного визначення вмісту охратоксину А за допомогою хроматографічних методів дослідження. 2 UA 77052 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наведені інформаційні відомості пояснюють одержання технічного результату заявленого способу. Таким чином, запропонований нами спосіб усуває недоліки найближчого аналога і забезпечує отримання охратоксину А в досить значних кількостях. При проведенні патентно-інформаційного пошуку знайдено технічне рішення /ПУ на винахід № 10475 А /, що містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим рішенням: спосіб включає використання як продуцента культуру гриба Aspergillus ochraceus, яку вносять у попередньо підготовлене зерно пшениці, культивування при температурі 30 °C протягом 14 днів, інактивування вегетативних форм гриба автоклавуванням та екстракцію охратоксину хлороформом з ортофосфорною кислотою, упарюванням хлороформних екстрактів до густого залишку і визначенням в ньому охратоксину А хроматографічним шляхом. Однак наявність зазначених, спільних з найближчим аналогом ознак, є недостатньою для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які за сукупністю ознак повністю б співпадали із заявленим - не виявлено. У патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, у яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від найближчого аналога і забезпечують досягнення технічного результату тим, що як продуцент охратоксину А в способі використовують 10 денну культуру гриба Aspergillus ochraceus штам № 7, вирощену на агарі 3 Чапека, при температурі 29 °C, яку попередньо суспензують у 20 см розчину середовища 3 Чапека без агар-агару, що вносять у 100 г пшениці, з 80 см розчину, що вмішує глюкозу, натрію нітрат, магнію сульфат, калію хлорид, заліза (II) сульфат, калію-фосфат двозаміщений та дистильовану воду, культивування здійснюють при t=29 °C протягом 14 днів після чого культуру грибів у зерні з накопиченим охратоксином А інактивують автоклавуванням при 1 атмосфері протягом 1 години. Корисна модель належить до галузі мікології, зокрема до методів виділення і дослідження токсичних метаболітів плісеневих грибів, що уражають переважно корми рослинного походження. Корисна модель може бути використана для дослідження здатності Aspergillus ochraceus продукувати охратоксини, з метою використання охраткосинів в наукових експериментах, а також в біологічних, медичних, ветеринарних установах, котрі займаються дослідженням міксоміцетів та їх вторинних метаболітів. Реалізацію заявленого способу здійснюють наступним чином: як продуцент використовують 10 добову культуру Aspergillus ochraceus штам №7, вирощену на агарі Чапека, при температурі 3 29 °C, яку попередньо вносимо у 20 см розчину середовища Чапека без агар-агару. Останнє 3 вносять у 100 г пшениці, з 80 см розчину наступного складу: глюкоза - 30 г, натрію нітрат -2 г, магнію сульфат - 0,5 г, калію хлорид - 0,5 г, заліза (II) сульфат -0,01 г, калію-фосфат двозаміщений -1г, Н2О дистильована до 1 л. Описаний субстрат перед цим автоклавують (при 1 атм протягом 1 год.). Проводять культивування протягом 14 днів в термостаті при температурі 29 °C. Після закінчення культивування нативну культуру знешкоджують автоклавуванням при 1 атм протягом 1 год. Після цього проводять екстракцію охратоксину А сумішшю хлороформу та ортофосфорної кислоти. В колбу вносять субстрат з нагромадженим охратоксином А та заливають 50 мл 0,1 Μ розчину ортофосфорної кислоти та 500 мл хлороформу. Екстрагують охраткосин А струшуючи його на шутель-апараті протягом 30 хв. Екстракт відділяють від субстрату фільтрацією через паперовий фільтр на лійці Бюхнера під від'ємним тиском. Фільтрат переносять в ділильну лійку ємністю 2000 мл, додають 400 мл 0,1 н розчину натрію двовуглекислого, вміст добре перемішують. Після розділення суміші шар хлороформу зливають через нижній край ділильної лійки, а водний залишок підкислюємо мурашиною кислотою до рН 2-3 і додають 100 мл хлороформу, який після відділення об'єднують з першою порцією і випарюють у скляному дистиляційному апараті до густого залишку за температури не вище 60 °C. Залишок екстракту в колбі використовують для кількісного визначення вмісту охратоксину А (за допомогою хроматографічних методів дослідження). Усі дослідження необхідно проводити з дотриманням правил техніки безпеки, з використанням реактивів кваліфікації "ХЧ" або "ЧДА". Ефективність заявленого способу підтверджена прикладом конкретного виконання корисної моделі. В умовах лабораторії кафедри мікробіології та вірусології Білоцерківського національного аграрного університету з трупів свиней було виділено культуру грибів Aspergillus ochraceus штам № 7. Цей штам, в умовах лабораторії кафедри патанатомії і гістології ЛНУВМ та БТ ім. С.З. Гжицького вирощували на агарі Чапека, при температурі 29 °C протягом 10 діб. Після цього 3 культуру гриба суспензували у 20 см розчину середовища Чапека без агар-агару. Суспензію 3 вносили у 100 г пшениці, з додаванням 80 см розчину такого складу: глюкоза - 30 г, натрію 3 UA 77052 U 5 10 15 нітрат -2 г, магнію сульфат - 0,5 г, калію хлорид - 0,5 г, заліза (II) сульфат - 0,01 г, калію-фосфат двозаміщений -1г, Н2О дистильована до 1 л. Проводили культивування на протязі 14 днів в термостаті при температурі 29 °C… Після закінчення культивування нативну культуру знешкоджували автоклавуванням при 1 атм протягом 1 год. Усі види робіт, пов'язані з екстракцією охратоксину А проводили у витяжній шафі. Після цього в колбу вносимо 50 мл 0,1 Μ розчину ортофосфорної кислоти та 500 мл хлороформу. Екстрагували охраткосин А струшуючи суміш на шутель-апараті протягом 30 хв. Екстракт відділяли від субстрату фільтрацією через паперовий фільтр на лійці Бюхнера під від'ємним тиском. Фільтрат переносили в ділильну лійку ємністю 2000 мл, додавали 400 мл 0,1 н розчину натрію двовуглекислого, вміст добре перемішували. Після розділення суміші шар хлороформу зливали через нижній край ділильної лійки, а водний залишок підкислювали мурашиною кислотою до рН 2-3 і додавали 100 мл хлороформу, який після відділення об'єднували з першою порцією і випарювали у скляному дистиляційному апараті до густого залишку за температури не вище 60 °C. Залишок екстракту в колбі використовували для кількісного визначення вмісту охратоксину А (за допомогою хроматографічних методів дослідження). Дані, отримані в результаті порівняння найближчого аналога та запропонованого методу наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Порівняльна оцінка способів екстракції охратоксинів Найближчий аналог Використання як інокулянта Aspergillus ochraceus 740 Для вирощування культуру гриба вносять у 3 зерно, попередньо перемішавши їх у 5 см стерильної водопровідної води з водою за допомогою бактеріологічного гачка Новий метод Використання як інокулянта ochraceus штам № 7 Aspergillus Для вирощування культуру гриба вносять у зерно, попередньо суспендувавши її у 20 мл розчину середовища Чапека без агар-агару Посів культури гриба з метою нагромадження охратоксину А проводять на зерно пшениці з 3 Посів культури гриба з метою накопичення додаванням 80 см розчину такого складу: охратоксину А проводять на зерно пшениці з глюкоза -30 г, натрію нітрат -2 г, магнію сульфат додаванням 80 мл водопровідної води - 0,5 г, калію хлорид - 0,5 г, заліза (II) сульфат 0,01 г, калію-фосфат двозаміщений -1г, Н2О дистильована до 1 л. Культивування проводять при температурі Культивування проводять при температурі 30 °C на протязі 14 днів 29 °C на протязі 14 днів Після 14 днів культивування зерно з культурою Після 14 днів культивування зерно з культурою грибів і накопиченим охратоксином А грибів і накопиченим охратоксином А інактивують автоклавуванням (при 0,5 атм 0,5 інактивують автоклавуванням (при 1 атм 1 год.) год.) Екстракцію охратоксину А проводять хлороформом та ортофосфорною кислотою В п'ятнадцятидобовій культурі продуцент В п'ятнадцятидобовій культурі продуцент утворює 1,5-2,1 г/кг охратоксину А утворює 2,8-3,2 г/кг охратоксину А 20 25 30 При порівняльній оцінці обох методів відзначено, що охратоксин А утворюється в обох випадках, проте запропонований нами спосіб дозволив отримати значно більші концентрації охратоксинів. Триваліші умови автоклавування дозволяють забезпечити кращу безпеку осіб, які проводять екстракцію охратоксину А. Результати досліджень, здійснених у прикладі конкретного виконання корисної моделі підтверджують ефективність заявленого способу. Таким чином, запропонований нами спосіб екстракції охратоксину А є зручним, надійним, не складним у практичному використанні, дозволяє отримати більші концентрації охратоксину А, а тому більш ефективним, порівняно з найближчим аналогом. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання охратоксину А, який включає використання як продуцента культуру гриба Aspergillus ochraceus, яку вносять у попередньо підготовлене зерно пшениці, культивування при 4 UA 77052 U 5 10 температурі 30 °С протягом 14 днів, інактивування вегетативних форм гриба автоклавуванням та екстракцію охратоксину хлороформом з ортофосфорною кислотою, упарювання хлороформних екстрактів до густого залишку і визначення в ньому охратоксину А хроматографічним шляхом, який відрізняється тим, що як продуцент охратоксину А в способі використовують 10 денну культуру гриба Aspergillus ochraceus штам № 7, вирощену на агарі 3 Чапека при t=29 ° C, яку попередньо суспензують у 20 см розчину середовища Чапека без 3 агар-агару і вносять у 100 г пшениці, з додаванням 80 см розчину, що вміщує глюкозу, натрію нітрат, магнію сульфат, калію хлорид, заліза (II) сульфат, калію-фосфат двозаміщений та дистильовану воду, культивування здійснюють при t=29 °С протягом 14 днів після чого культуру грибів у зерні з накопиченим охратоксином А інактивують автоклавуванням при 1атм протягом 1 години. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for production of ochratoxin a

Автори англійською

Rukhliada Valentyn Vasyliovych, Andriichuk Andrii Vitaliiovych, Dankovych Roman Stepanovych, Zaitsev Oleksandr Oleksandrovych

Назва патенту російською

Способ получения охратоксина а

Автори російською

Рухляда Валентин Васильевич, Андрийчук Андрей Витальевич, Данкович Роман Степанович, Зайцев Александр Александрович

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/483

Мітки: спосіб, охратоксину, отримання

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/7-77052-sposib-otrimannya-okhratoksinu-a.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання охратоксину а</a>

Подібні патенти