Спосіб одержання захисного антигенного білка сибірки з е.coli

1. Спосіб одержання захисного антигенного білка (захисного антигену) сибірки з Е.соlі з використанням культивування з підживленням, що передбачає: a) трансформацію клітин DH5a Е.соlі рекомбінантною конструктивною експресуючою плазмідою, що включає ген захисного антигену, для одержання рекомбінантних клітин DH5a , що експресують білок захисного антигену, b) вирощування рекомбінантних клітин DH5a і контроль за експресією захисного антигену шляхом лізису вказаних рекомбінантних клітин з наступним електрофорезом в денатур уючому гелі 2 (19) 1 3 80809 4 2. Спосіб за п. 1, у якому використана рекомбінантна конструктивна експресуюча плазміда експресує білок захисного антигену у вигляді нерозчинних тілець включення в клітинах DH5a Е. соlі. 3. Спосіб за п. 1, у якому збирання клітин шляхом центрифугування культури з високою щільністю клітин виконують при 5000 об./хв. протягом 10 хвилин. 4. Спосіб за п. 1, у якому центрифугування дебрису культури з високою щільністю клітин виконують при 10000 об./хв. протягом 30 хвилин для максимізації збирання клітин. 5. Спосіб за п. 1, у якому поліол, який застосовують під час ферментації, являє собою гліцерин. 6. Спосіб за п. 1, у якому вуглевод вибирають з групи, що включає глюкозу, галактозу, мальтозу, фр уктозу та лактозу. 7. Спосіб за п. 1, у якому органічна кислота являє собою яблучну кислоту. 8. Спосіб за п. 1, у якому при застосуванні поліолу, вуглеводу або органічної кислоти як первинної добавки у середовищі Luria Broth максимальна щільність клітин варіюється в діапазоні від 10 до 14 одиниць оптичної густини в культурах у колбах для струшування. 9. Спосіб за п. 1, у якому середовище Luria Broth вводять у біореактор у від 5 до 25 разів розведеній концентрації від початкової концентрації середовища Luria Broth. 10. Спосіб за п. 1, у якому середовище Luria Broth вводять у біореактор у розведеній в 25 разів концентрації від початкової концентрації середовища Luria Broth. 11. Спосіб за п. 1, у якому плазміда являє собою вектор серії pQE, що містить промотор фата, який упізнається Е.соlі. Цей винахід стосується способу конститутивного одержання захисного антигену антракс з високим рівнем виходу продукту в Е.соїі, використовуючи культур у підживлюваних клітин. Рівень техніки Антракс — це зоонозне захворювання, викликане грампозитивними, спороутворюючими бактеріями Bacillus anthracis. Захисний антиген (ЗА) є головним компонентом усіх вакцин проти антраксу. На сьогодні супернатанти культури В. anthracis є головним джерелом очищення ЗА. Проте, робота з культурами в. anthracis потребує РЗ обладнання, яке є дорогим. Окрім цього, препарати ЗА з в. anthracis часто містять домішки інших білків токсинів антракс. Дослідники намагалися експресувати та очищати ЗА з інших мікроорганізмів, таких як Bacillus subtilis, Baculovirus та Е.соїі. Виділення ЗА з Bacillus subtilis дало поганий вихід, потребувало росту в збагаченому середовищі й велика кількість ЗА руйнувалася завдяки протеазам, які секретувалися організмом [L.W. J. Baillie et al, Lett. Appl. МікроЬіаі (1994) 19, 225-227]. Бакуловірусні вектори експресували ЗА в клітинах комах; однак, очищення не було можливим завдяки, можливо, низькому виходу. Хоча ЗА й експресували в Е.соlі, спроби надекспресувати білок виявилися невдалими [М. Н. Vodkin et al, Cell, (1983) 34, 693697]. Дослідники також очищали ЗА, спрямовуючи білок у периплазматичний простір, однак, вихід очищеного ЗА був дуже низьким. Усі відомі експресійні системи для експресії захисного антигену, використовуючи Е.соІі, є індуцибельними системами, що потребують використання IPTG, дорогого реагенту. [Патент США №2017606] описує одержання антигену антракс шляхом вирощування Bacillus anthracis на придатному культуральному середовищі та виділення бактерії з культурального середовища. [Патент США №2151364] описує спосіб одержання вакцини антракс, який складається з одержання суспензії спор антракс та додавання до суспензії стерильного розчину, що містить галун. Недоліками вищезгаданих патентів США є те, що вони обидва використовують Bacillus anthracis культури або спори. Bacillus anthracis є інфекційним організмом і з ним не можливо працювати без використання захисного обладнання. Кількість захисного антигену, що експресується в Bacillus anthracis, є дуже низькою. Цей вид одержання вакцини також містить домішки інших токсичних та нетоксичних білків з Bacillus anthracis, що призводить до появи побічних ефектів та реакційності. Метою цього винаходу є створення конститутивної експресійної системи для швидкого, ефективного, прибуткового та високопродуктивного одержання ЗА антракс з Е.соlі, використовуючи к ультур у клітин. Для досягнення вищезгаданої мети цей винахід пропонує процес одержання білка захисного антигену антракс з Е.соїі, використовуючи культур у клітин, що складається з: трансформації клітин DH5a Е.соlі рекомбінантною плазмідою, що конститутивно експресується, яка містить ЗА ген, для одержання рекомбінантних DH5a клітин, що експресують білок ЗА, - вирощування вищезгаданих рекомбінантних клітин DH5a та тестування експресії ЗА лізисом вищезгаданих клітин з наступним денатуруючим гель-електрофорезом та методом Вестернблотинг, використовуючи антитіла до ЗА, - ферментування вищезгаданих клітин у біореакторі, використовуючи: - поліоли, вуглеводи або органічні кислоти як первинні додатки у Luria Broth середовищі за 32 42°С, - культивування культури підживлюваних клітин, та - використання pH-DO-stat методу підвищення чутливості до відміни поживного компоненту для 5 80809 одержання культури з високим вмістом клітин, що експресують білок ЗА, збирання вищезгаданих клітин центрифугуванням вищезгаданої культури з високим вмістом клітин за 5000-10000об/хв протягом 10-30 хвилин, - солюбілізації вищезгаданої культури з високим вмістом клітин, використовуючи 6-8 Μ розчин сечовини та перемішуючи за температури навколишнього середовища протягом 1-2 годин, - виділення осаду вищезгаданої культури з високим вмістом клітин центрифугуванням за 10000-15000 об/хв протягом 30-60 хвилин за 3242°С та збирання супернатанту, що містить ЗА, денатурований сечовиною, виділення вищезгаданого ЗА, денатурованого сечовиною з вищезгаданого супернатанту та очищення його Ni-NTA хроматографією шляхом поступового видалення сечовини, у той час як вищезгаданий ЗА зв'язаний з колонкою для афінної хроматографії, та - елюювання вищезгаданого очищеного ренатурованого ЗА та зберігання білка захисного антигену (ЗА) як заморожених аліквот за температури від -20 до -70°С залежно від термінового або довготривалого використання. Вищезгадана використовувана рекомбінантна конститутивна експресійна плазміда експресує білок ЗА як нерозчинні включення в DH5a клітинах штаму Е.соlі. Збирання вищезгаданих клітин центрифугуванням вищезгаданої культури з високим вмістом клітин виконується за 5000об/хв протягом 10 хвилин. Центрифугування осаду вищезгаданої культури з високим вмістом клітин виконується за 10000об/хв протягом 30 хвилин для збільшення збирання вищезгаданих клітин. Вищезгаданим поліолом, використовуваним як первинний додаток у Luria Broth середовищі під час ферментації, є гліцерин. Вищезгаданими вуглеводами, використовуваними як первинний додаток у Luria Broth середовищі, є глюкоза, галактоза, мальтоза, фр уктоза та лактоза. Вищезгаданою органічною кислотою, використовуваною як первинний додаток у Luria Broth середовищі, є яблучна кислота. Використовуючи поліол, вуглевод або органічну кислоту як первинні додатки у Luria Broth середовищі, максимальна кількість клітин сягає між 10-14 одиницями оптичної густини для культур, які вирощують у колбах. Максимальна кількість рекомбінантних клітин досягається, використовуючи культур у клітин, що містить MgSO4. Концентрація Luria Broth середовища, що використовується для споживання, становить 525Х. Концентрація Luria Broth середовища, що використовується для споживання, становить 25Х для того, щоб мінімізувати об'єм поживного середовища, доданого під час ферментації. Вищезгаданою плазмідою є pQE вектор, що містить промотор фага, який впізнається Е.соlі. 6 Антиген антракс складається з очищеного структурно, біологічно та функціонально активного рекомбінантного захисного антигену (ЗА) білка Bacillus anthracis, експресованого як 6Х гістидиновий складений білок в Е.соlі DH5a клітинах, що не містить полісахаридів, мертвих бактерій, культурального середовища, водорозчинних та нерозчинних побічних продуктів та суспендованих включень. Короткий опис графічних матеріалів Винахід буде описано з посиланням на наступний протокол та супровідні графічні матеріали. На Фігурі 1 показано, що максимальну оптичну густину в культурі для вирощування в колбі одержують, використовуючи глюкозу як додаткове джерело вуглецю, а мінімальну оптичну густину одержують, використовуючи мальтозу. На Фігурі 2 показано оптичну густину, одержану в культурі клітин та культурі підживлюваних клітин з використанням та без використання MgSO4. На Фігурі 3 показано, що одержаний рекомбінантний ЗА є біологічно та функціонально активним і природним ЗА з Bacillus anthracis. Рекомбінантну плазміду з властивою конститутивною експресією, що містить ЗА ген, клоновану у вектор серн pQE, використовували для трансформації компетентних клітин штаму DH5a E.coli. Вищезгадані клітини, що містять рекомбінантну плазміду, вирощували протягом ночі за 37°С та 250об/хв в Luria broth з 100 мкг/мл ампіциліну. Клітини збирали центрифугуванням за 5000об/хв протягом 20 хвилин. Експресію та локалізацію ЗА підтверджували за допомогою SDS-PAGE. Більш ніж 90% рекомбінантного білка виявляли у включеннях. Кількість експресованого білка підвищувалась у прямій пропорції з підвищенням кількості клітин вирощуваної культури. Складне середовище модифікованого 100 мл LB 5х концентрацій кожне одержували з глюкози, фр уктози, галактози, лактози, мальтози, яблучної кислоти та гліцерину як семи різних джерел вуглецю в колбах. Лише LB без будь-якого додаткового джерела вуглецю використовували як контроль. Рівнозначну кількість атомів вуглецю використовували як джерело вуглецю, а концентрацію підтримували рівнозначну 0,5% глюкози. Також додавали 10 мМ MgSO4 , 100 мМ фосфа ту калію та слідові елементи. Усі колби засівали водночас посівним матеріалом DH5a клітин, які вирощували протягом ночі, що містив вищезгадану рекомбінантну плазміду. Зразки збирали асептично щогодини та вимірювали ODeoo- Аліквоти культур збирали та їх вміст рекомбінантного білка аналізували за допомогою SDS-PAGE. Найвища OD60o (оптична густина за 600 нанометрів) може бути досягнута там, де глюкозу використовували як головне джерело вуглецю та найнижчу ODeoo спостерігали у випадку LB та мальтози (Фігура 1). Максимальну концентрацію білка одержували, використовуючи яблучну кислоту, мальтозу та гліцерин як головне 7 80809 джерело вуглецю. Найнижчу концентрацію білка спостерігали у випадку LB та лактози. A 5L Biostat В (В Braun Biotech International) ферментер, обладнаний зондами для рН, температури, розчинного кисню та протипінним зондом, використовували для ферментації. Ферментер було підключено до персонального комп'ютера. Програмне забезпечення MFCS/win 2.0 використовували для обробки даних та керування ферментера в режимах як культури клітин, так і підживлюваної культури клітин. Середовище, яке використовували для ферментації, було складним середовищем, що складалося з Luria Broth з MgSO4 x7H2O (10мМ), фосфа ту калію (5г/л) та гліцерину (1%) за рН 7,4. Для культури клітин MgSO4 додавали до середовища перед автоклавуванням. Гліцерин також додавали до середовища перед автоклавуванням. 25Х поживне середовище одержували з 25% гліцерину (вага/об'єм) та 25Х LB та автоклавували окремо. Розчин фосфату калію також автоклавували окремо, охолоджували до кімнатної температури і додавали асептично відразу перед початком. рН зонд калібрували зі стандартними буферами рН 7,0 та 9,2 перед автоклавуванням. Після автоклавування середовища, ферментер автоматично підводили до рН 7,4 додаванням 1N NaOH/1M НСІ і встановлювали температуру 37°С. DO (розчинний кисень) зонд калібрували, встановлюючи електронно значення нуля розчинного кисню у діапазоні від нуля +15 наноампер (нАмпер) і 100% DO значення надавали тиску кисню в 2 wm накачуваного повітря за швидкості перемішування 250 об/хв. Ферментер включали у фазі культури клітин з робочим об'ємом 2л. Клітини, що містять рекомбінантну плазміду, вирощували протягом ночі в LB під селективним тиском 100 мкг/мл ампіциліну за 37°С, 250 об/хе. 1% нічної культури використовували для посіву у ферментер. DO значення встановлювали на 40% і перемішувач переключали на каскадний режим. У цьому режимі після посівання, як тільки DO починає падати нижче 40%, швидкість перемішувана підвищується автоматично для підтримання значення на рівні 40%. Зразки збирали в інтервалах 1 години. Аліквоти культури розводили до оптичної густини (ΟD600) приблизно нижче 0,5 одиниць. Як тільки вирощувана культура досягала середини логфази, починали подавати 25Х середовище, використовуючи перистальтичний насос (Pharmacia). Швидкість подачі спостерігали та вручн у контролювали для підтримання рН значення між 7,2 та 7,4. Додавання кисню ставало необхідним після досягання OD 70. Кисень подавали до культури, використовуючи Gasmix функцію ферментера. Культуру вирощували до ΟD600 120 одиниць, після чого клітини збирали. Протипінну речовину спочатку додавали до середовища перед автоклавуванням, а пізніше її додавали як і коли потрібно. Для оптимізації складу середовища та інших умов для наступної g ферментації, серії культивування клітин виконували на модифікованому LB з 8 гліцерином з додаванням або без додавання MgSO4 в середовище для зростання. Культивування клітин без MgSO4 в модифікованому LB (з гліцерином як джерелом вуглецю) дозволяло одержати максимально OD 14, тоді як культивування з MgSO 4 в модифікованому LB дозволяло одержувати значення ΟD600 більше за 18. Був зроблений висновок, що MgSO4 є необхідним для росту клітин за більшої щільності. Включення MgSO4 в середовище для зростання є необхідним для досягнення більшого виходу біомаси під час ферментації. (Фігура 2). 5мл культури з високим вмістом клітин центрифугували за 10000g протягом півгодини в попередньо зважених пробірках. Після висушування супернатанту пробірку з центрифугованими клітинами зважували на вагах для визначення сирої ваги клітин. Для визначення сухої ваги клітин ту саму пробірку лишали протягом ночі в інкубаторі за 70°С і зважували наступного дня. Для перевірки стабільності плазміди pMW1 у ферментері зразки культури асептично збирали щогодини під час ферментації. Зразки розводили так, щоб ODeoo кожного зразка становило 5,0, і центрифугували за 10000g протягом 1 хвилини. Супернатант висушували повністю й осад суспендували в 100мкл буфері для лізису, що містить буфер — 100мМ фосфату калію, рН 8,0 з 8 Μ сечовиною. Ці зразки піддавали SDS-PAGE для перевірки на експресію білка з рекомбінантної плазміди. Також одержували препарати колоній та мініпрепарати плазмідної ДНК, щоб безпосередньо перевіряти присутність рекомбінантної плазміди всередині експресованих клітин. Не спостерігали жодного утворення клітин без плазміди. Білок очищали, використовуючи метал-хелат хроматографію за спорідненістю за денатуруючих умов. Коротко, осад зі 100мл культури ресуспендували в 100мл денатуруючого буфера, що містить 100мМ фосфатно-натрієвий буфер, 300мМ хлорид натрію та 8М сечовину (рН 8,0). Ресуспендований осад інкубували за 37°С протягом 2 годин на коловому вструшувачеві. Лізат центрифугували двічі протягом 60 хвилин кожний за кімнатної температури і супернатант перемішували з 50% Ni-NTA суспензією. Суспензію наносили на колонку й залишали для врівноваження. Проточний потік повторно пропускали через колонку. Ni-NTA основу промивали 500мл денатуруючого буфера, що містить 8М сечовину, з наступною ренатурацією білка в колонці, використовуючи 8М-0 М градієнт сечовини. Білок елюювали 250мМ хлоридом імідазолу в буфері для елюювання, 100мМ фосфа том натрію рН 8,0 з 250мМ імідазолом та 300мМ хлоридом натрію. 10мкл кожної фракції аналізували на 12% SDS-PAGE. Фракції, що містять білок, збирали, змішували та діапізували проти 10мМ буфера HEPES, що містить 50мМ NaCI і зберігали замороженими за -70°С в аліквотах. 9 80809 Специфічний білок визначали кількома методами. Денситометрію виконували, використовуючи систему BioRad і програмне забезпечення Quantity One. Ступінь очищення ЗА визначали на різних стадіях, підраховуючи кількість білка, потрібного для загибелі 50% J774A.1 макрофаг-подібних клітин (ЕС50) разом з LF (1 мкг/мл) протягом 3 годин за 37°С. Очищений білок визначали за методом Бредфорда, а також визначенням OD препарату за 280нм. ЗА приходився на більш ніж 30% загального білка клітини і був присутній у клітині у формі включення. 5-8г/л ЗА утворювався всередині клітин. Біологічну активність рЗА (рекомбінантний ЗА) також визначали аналізом на цитотоксичність на J774A.1 макрофаг-подібній лінії клітин. Усі експерименти виконували тричі. Коротко, різні концентрації рЗА білка разом з LF (1мкг/мл) додавали до клітин. Природний ЗА з В. anthracis разом з LF використовували як позитивний контроль. Після 3 годин життєздатність клітин визначали, використовуючи МTT барвник, а осад, що утворився, розчиняли в буфері, що містить 0,5% (вага/об'єм) додецил сульфату натрію, 25мМ НСІ в 90% ізопропіловому спирті. Поглинання зчитували за 540 нм, використовуючи мікрогіланшетний зчитувач (BioRad), і визначали відсоток життєздатності. Було виявлено, що рЗА разом з LF були повністю здатні лізувати клітини макрофагів і його біологічна активність була подібною до ЗА, одержаного з В. anthracis. EC5o рЗА та нЗА (нативний захисний антиген) становила ~50нг/мл кожного (Фігура 3). Ступінь очищення білка визначали на кожній стадії очищення вищезгаданим аналізом на цитотоксичність. (Таблиця 1) 10 термінаторів трансляції, чітку регуляцію транскрипції генів, доступність рибосом, посттрансляційні модифікації,- стабільність та розчинність самого рекомбінантного білка, а також клітину-хазяїна та умови культивування. Процеси, в яких досягається високий рівень експресії чужорідного білка, використовують сильні промотори, такі як Т5, Т7, PL, PR, Ptrc, Ptac, для створення ефективних експресійних систем. Більшість із таких систем містять індуцибельні промотори й індукції передує фаза низького утворення або відсутності утворення продукту. Після індукції специфічна швидкість одержання підвищується до максимальної за короткий термін і білок безперервно утворюється протягом 4-5 годин. Після індукції відбуваються деякі зміни, такі як зміни в метаболізмі вуглецю, що призводять до накопичення ацетату, підвищення дихальної активності, зменшення синтезу власних білків та появи білків теплового шоку та SOS-реакцій. Усі з цих реакцій ведуть до деградації рекомбінантних продуктів. Утворення включень перешкоджає руйнуванню рекомбінантного білка клітинними протеазами, які можуть призвести до значної деградації білка, тобто до низького виходу виділеного білка. SDS-PAGE та Вестерн-блот аналізи у різних проміжках часу підтверджують той факт, що експресія ЗА з рекомбінантної плазміди pMW1 є незалежною від розглянутих факторів та пропорційною OD культури. Без жодної значної деградації більшість білка була присутня всередині клітин у формі включень. Як тільки створена сильна експресійна система, одержання рекомбінантного білка в E.cott може бути значно підвищене, використовуючи культури з високим вмістом клітин, застосовуючи різні способи. Концентрації клітин більше, ніж 50 г/л сухої ва ги може бути загально прийнято досягнуто для прибуткового Таблиця 1 одержання рекомбінантних білків. Однак, культури з високим вмістом клітин Очищення ЗА з Escherichia coli також мають кілька недоліків, такі як обмежена здатність Фракції Об'єм (мл) Білок (мг/мл)інгібування субстратом, Очищення (ступінь)6 Активність переносити кисень,50утворення інгібіторів росту й (ЕС )а Лізат клітин 10 291 обмежене розсіювання тепла, що призводить до 57,3 1 перемішуваної ефективності Спорідненість 25 1,8 зменшення 0,0241 1965 ферментера. Головною проблемою одержання Очищення рекомбінантних білків у культурі з високим вмістом а клітин (HCDC) є накопичення ацетату, ЕС50 визначається як концентрація ЗА ліпофільного агента, що є шкідливим для росту (мкг/мл) разом з LF (1мкг/мл), потрібна для клітин. Накопичення ацетату в середовищі для загибелі 50% J774A.1 клітин. Після 3 годин зростання зменшує ви хід рекомбінантного білка. інкубації життєздатність визначали за допомогою Було розроблено кілька стратегій для зменшення барвника МІГ. Результати представляють середнє утворення ацетату в культурі клітин, наприклад, трьох експериментів. b контролювання специфічної швидкості росту Ступінь очищення визначали діленням EC50 обмеженням необхідних поживних речовин у для лізату клітин на ЕС 50 для фракцій, одержаних середовищі, таких як джерело вуглецю або азоту, з різних колонок. змінюючи умови росту та штами Е.соli. Оскільки Обговорення первинною метою досліджень у ферментації є Надекспресія будь-якого рекомбінантного прибуткове одержання рекомбінантних продуктів, білка залежить від оптимальної конфігурації різних важливою є розробка методу культивації, який елементів системи експресії. Кілька факторів дозволяє збільшувати ви хід бажаного продукту. значно впливають на експресію рекомбінантного Склад середовища для росту є критичним для білка, силу промотора, стабільність плазм іди, збільшення продукту утворення, а також кількість копій плазмід, термінатори транскрипції, зменшення ацетату. Ацетат одержували в Е.соli за ефективність транскрипції та трансляції, що умов обмеженої доступності кисню або за врешті решт підсилює стабільність мРНК, 11 80809 присутності надлишку глюкози за аеробних умов, коли потік вуглецю в центральному метаболічному шляхові перевищує метаболічну потребу в ньому та здатність утворювати енергію всередині клітини. На основі кінетики росту та ви ходу рекомбінантного білка гліцерин був обраний як головне джерело вуглецю для HCDC з 7 інших джерел вуглецю, а саме: глюкози, фруктози, лактози, галактози, мальтози, яблучної кислоти та гліцерину. Ацетат не утворюється, коли гліцерин використовують як джерело вуглецю, висока кількість клітин може бути досягнута відносно легко, використовуючи гліцерин. Менша швидкість транспорту гліцерину в клітину, порівняно з глюкозою, очевидно призводить до зменшення потоку вуглецю через гліколіз, значно зменшуючи утворення ацетату, і клітини ростуть більш повільно на гліцерині. Гліцерин також має протипінний ефект, що призводить до меншого піноутворення під час процесу ферментації. Спосіб подачі поживного середовища є також критичним для успішного ведення HCDC, оскільки він впливає як на кількість клітин, так і на продуктивність. Постійне або періодичне підживлення виконується за умов нестатку поживних речовин. Хоча й інші види живлення успішно використовувались у HCDC в Е.соli, нещодавно були розроблені й більш складні способи з системами зворотного контролю. Швидкість живлення поєднується з іншими фізичними параметрами, такими як DO (розчинний кисень), рН, утворювана теплота та швидкість утворення СО2 (CER). DO-stat метод живлення оснований на факті, що DO в культурі підвищується різко, коли субстрат закінчується. Клітини не здатні рости швидко, оскільки кількість поживних речовин зменшується й клітини використовують менше кисню. Таким чином, в методі DO-stat концентрація субстрату підтримується в бажаних межах автоматичним додаванням поживних речовин, коли DO сягає вищезгаданого встановленого значення. Іншою альтернативою є те, що pH-stat метод оснований на факті, що рН середовища змінюється, коли головне джерело вуглецю зменшується. Коли джерело вуглецю закінчується, рН починає рости здебільшого як результат підвищення концентрацій іонів амонію екскретованих / секретованих клітинами. Аналіз системи подачі поживного середовища починається з характеристики зондування та методу визначення. Метою є визначення насичення в диханні, перевіряючи DO та реакцію рН на зміни у швидкості подачі. Як тільки живлення починається й Е.соli входить у лог-фазу, поживні речовини поглинаються більше або менше в експоненційній манері. Однак, швидкість подачі живлення має контролюватися так, щоб вона не перевищувала потреби в живленні або швидкості поглинання поживних речовин. Це здійснюється шляхом підтримки рН та DO біля їх встановлених значень. Зменшення рН та DO єознакою передозування субстрату. Підвищення значень рН та DO вказують, що джерело вуглецю 12 або один із субстратів закінчується і, таким чином, потрібне підживлення. Якщо підвищення подачі/швидкості живлення недостатнє для утворення будь-якої значної відповіді, тобто зменшення DO або збільшення швидкості перемішування, це є явною ознакою того, що якийсь інший фактор, такий як MgSO4, KH2PO4, або слідові елементи почали закінчуватись і мають бути доданими періодично в таких випадках. Додавання супроводжується швидкою зміною у вищезгаданих показниках. Е.соli здатна використовува ти ацетат як джерело вуглецю, коли глюкоза або будь-яке інше головне джерело вуглецю відсутнє. Поглинання ацетату характеризується розходженням зі встановленими значеннями для зменшення значень рН і з'являється циклічний тип поглинання кисню, доки встановлене значення рН поступово не відновлюється в культурі. У цей момент відновлюється постачання живлення. DO-stat метод швидше реагує на закінчення поживних речовин, ніж рН-stat метод. Коли складні субстрати використовують разом із вуглеводневими субстратами, зміна в DO не є настільки очевидною, доки клітини продовжують використовува ти складні субстрати. Спосіб живлення, який використовували в цих експериментах, складався з комбінації pH-stat плюс DO-stat методів. Спостерігання за обома параметрами одночасно дає кращий контроль над умовами росту вирощуваної культури. Використання цього способу подачі субстрату дало авторам змогу досягти OD 120, яке є більшим, ніж шестикратне підвищення OD, досягнуте у ферментерах, і більше, ніж 23-кратне з культур, які вирощують у колбах. Це є першим повідомленням про оптимізацію умов для підживлюваної HCDC для досягнення високого виходу ЗА в Е.соli. Ця робота є спробою одержати велику кількість нереакційного ЗА, який міг би слугува ти як перспективний кандидат на вакцину. Спосіб одержання ЗА, повідомлений у цьому винаході, використовує новий субстрат, який має переваги, та простий і легкий контроль за подачею живлення, який також може бути успішно застосований до інших експресійних систем рекомбінантного білка для досягнення високого виходу продукту. 13 80809 14