Плазмідний експресуючий вектор ррр-28, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е. coli злитного білка цитомегаловірусу

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка цитомегаловіруса І в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до цитомегаловіруса в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Keith К Stanley and Paul Luslo., Construction of a new family of high efflclenty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins. // EMBO Journel vol 3, N 6, pp. 1429-1434). ЦІ вектори походять від crolacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фа гу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. coll элитного білка оболонки цитомегаловіруса. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка цитомегаловіруса. Для цього була створена рекомбінантна плазмида рРР28, яка містить наступні Інсерційні фрагменти ДНК: фрагменту ген у Сrо, розміром 51 п.о,, фрагмент Lad, розміром 114 п.о., фрагмент LacZ, розміром 1050 п.о. І фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білка цитомегаловіруса розміром 3696 п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. call, штам Рор-2136. Рекомбінантні клони Е. coll нарощували І тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білків цитомегаловіруса. Плазмида рРР-28 кодує гібридний білок молекулярною масою 139 кД (1231 амінокислота). Штам-продуцент гібридного білка (ITG-628) одержували трансформацією клітин Е. coll Pop 2136 плазмидою рРР-28. Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють Інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти І мінеральні солі в амонійній 1 нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібрідного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll ITG-628 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою рРР-28.