Спосіб обробки рослин селекційно цінних форм огірка

Реферат: Спосіб обробки рослин селекційно цінних форм огірка композиційним препаратом, що містить ді-(N-оксид 2-метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду та калію йодистого в ефективній кількості. UA 98411 C2 (12) UA 98411 C2 UA 98411 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Сучасні вимоги ринку диктують необхідність розширення сортименту сортів і гібридів огірка, придатних як для свіжого споживання, так і різних видів переробки. Останнім часом у вітчизняних селекційних установах набули поширення розробки по створенню потрійних гібридів огірка ніжинського сортотипу, які за своїми господарсько цінними ознаками мають універсальне призначення [1]. Одним з батьківських компонентів потрійних гібридів є двостатевоквіткові складні материнські форми (СМФ), які отримують від гібридизації гіноційної лінії з гермафродитним аналогом або з гермафродитноквітковою формою. Складна материнська форма містить майже 100 % фенотипово жіночих рослин, тому є перспективним вихідним матеріалом для гібридної селекції огірка за будь-яким напрямком використання [2, 3]. Якщо для генетичної стабілізації цих форм використовувати традиційний метод інбридингу, то тривалість цього процесу може сягати 5-6 років. Для подолання цієї проблеми доцільно використовувати сучасні біотехнологічні методи експериментальної гаплоїдії, які дозволяють за значно скороченим часом, протягом одного року, одержувати генетично стабільні СМФ огірка шляхом переводу їх на рівень диплоїдних гомозигот. Зокрема, метод культури ізольованих пиляків in vitro дозволяє отримувати дигаплоїди шляхом андрогенезу, Цей метод значно підвищує ефективність селекції і дозволяє у скорочені строки проводити аналіз ознак, які детерміновані домінантними та рецесивним генами [4]. На теперішній час методом андрогенезу одержані гомозиготні лінії у багатьох сільськогосподарських рослин. В Японії і Китаї були виведені нові лінії тютюну, рису, пшениці [4]. У країнах СНД у Росії шляхом андрогенезу одержано лінії капусти білоголової [5] і моркви [6], в Україні - ячменю [7] і картоплі [8]. В умовах біотехнологічних лабораторій гомозиготні лінії огірка на основі дигаплоїдів є можливість створювати протягом одного року. Експериментальний андрогенез в культурі пиляків - це комплекс процесів, пов'язаний з переходом розвитку пилкового зерна з гаметофітного на спорофітний напрямок розвитку. Суть цього генетичного явища полягає в тому, що частина молодих мікроспор у культурі in vitro виявляється не здатною до нормального перетворення у зрілий пилок, а редиференціюється, багатократно ділиться і утворює або калюс, або ембріоїди. У гаплоїдному калюсі є можливість індукувати утворення de novo бруньок або вторинних ембріоїдів, з яких у подальшому можна отримувати гаплоїдні рослини. У більшості культурних видів рослин частота появи природних гаплоїдів є настільки низькою, що вони не можуть бути використані практично. Тому здійснюються спроби одержати гаплоїди, застосовуючи методи біотехнології: культуру пиляків, незапліднених зав’язей (яйцеклітин), ізольованих ембріоїдів; елімінацію хромосом та технологію гена - ініціатора гаплоїдії [4-8]. Численними дослідженнями на інших видах рослин було доведено, що суттєвий вплив на індукцію андрогенезу в культурі ізольованих пиляків in vitro має генотип вихідної рослини, умови його вирощування, режими передобробки пиляків та умови їх культивування [4-9]. Іншим суттєвим заходом, здатним підвищити вихід проембріональних новоутворень в культурі пиляків in vitro є використання різних стресових факторів на рослини-донори. Зокрема, попередня їх обробка надмірно високими дозами фітогормональних регуляторів може ініціювати зміни ендогормонального статусу і спонукати, тим самим, опосередкований перехід до аномального розвитку мікроспор, як передумови до їх подальшої редиференціації після введення ізольованих пиляків в культуру in vitro. Для оптимізації вищевказаного елемента методики індукції андрогенезу в культурі пиляків огірка in vitro доцільне використання нових, ще раніше не досліджених, регуляторів росту для обробки донорних рослин. Зокрема, у проведених раніше біотехнологічних дослідженнях на овочевих видах рослин високу регуляторну активність виявили речовини з ряду піридинів [1011]. Раніше, цей клас сполук у дослідах по андрогенезу огірка ще не вивчався. Враховуючи вищенаведену проблематику досліджень завданням даного винаходу є експериментальна перевірка регуляторних властивостей сполук, похідних піридину на здатність змінювати напрямком розвитку мікроспор за умов обробки цими речовинами донорних рослин - СМФ огірка. Для проведення біотестів було відібрано наступні речовини: Приклад. 1. Результати біотестів запропонованих біологічно активних сполук у дослідах по обробці рослин селекційно-цінних форм огірка, з яких відбиралися пиляки для культивування in vitro. Приготування рослинного матеріалу і методика проведення біотестів. Як об'єкти досліджень у біотестах були задіяні наступні СМФ огірка -К-50295, К-50296, К53212, К-53428, К-53451 з розсадника гібридизації лабораторії селекції гарбузових рослин Інституту овочівництва і баштанництва Національної аграрної академії наук. 1 UA 98411 C2 5 10 15 20 25 З метою посилення відгуку до андрогенезу в культурі пиляків in vitro в 2007 році був проведений дослід по попередній обробці донорних рослин огірка високими концентраціями регуляторів росту з метою посилення реакції щодо зміни у мікроспор шлях розвитку з гаметофітного (нормального) на спорофітний (аномальний). Відібрані генотипи огірка обробляли наступними водними розчинами регуляторів росту - НОК (нафтилоцтова кислота, еталон № 1), 2,4-Д (еталон № 2), а також композиційним препаратом, який представляє суміш ді-(N-окис 2-метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду та калію йодистого у співвідношенні 1:1 і концентрації 100 мг/л. Першу обробку проводили після висадки розсади огірка у ґрунт на початку травня в умовах скляної теплиці у фазі 3-5 справжніх листків і в подальшому обробку повторювали через кожні 10 діб. Контроль - обробка водою. Перед введенням в культуру пиляків спочатку з дослідних рослин огірка відбиралися бутони розміром 5 мм, які потім в асептичних умовах ламінарного боксу поверхнево обробляли шляхом поступового занурення у 70 % розчин етанолу на 30 сек., а потім на 20 хв. у побутовий засіб для стерилізації "Domestos". Після процедури стерилізації бутони промивали трьома порціями стерильної дистильованої води. З простерилізованих бутонів під бінокуляром виділяли пиляки і висаджували на індукційне живильне середовище Келлера (Keller), яке, згідно з літературними даними, було придатним для одержання гаплоїдних ембріоїдів в культурі пиляків ріпаку і капусти білоголової [5] (табл. 1). За біологією, рослини огірка мають 5 пиляків у чоловічій квітці, 4 з них попарно зрощені. Пиляки висаджували на агаризовані середовища об'ємом 5-6 мл у скляні бюкси розміром 23 см і закривали стерильною фольгою. У кожен бюкс висаджували по 15-20 пиляків від 3-4 бутонів. Повторність висадження пиляків кожного генотипу для окремого варіанту досліду 6-8 кратна (120-160 пиляків). Пиляки культивували в темряві протягом 40 діб в умовах темряви для ініціації дедиференційованого поділу мікроспор, згідно запропонованих методичних рекомендацій [5]. Спостереження за рослинними об'єктами проводили через кожні 15 діб, а статистичні обрахунки - через 30-45 діб. Таблиця 1 Мінеральний і органічний склад живильного середовища Келлера для культивування пиляків огірка. Компонент: Макроелементи: KNO3 (NH4)2SO4 MgSO47H2O СаСl22Н2О NaH2PO4H2O Вміст, мг/л Компонент: Вміст, мг/л Мікроелементи: 10 MnSOH2O Н3ВО3 10 2 ZnSO44H2O KI 0,75 0,25 NaMoO42H2O 0,025 CuSO45H2O 0,025 CoCl6H2O Вітаміни та інші біологічно активні речовини: Мезоінозит 100 PP 1 B6 1 B1 10 Глютамін 800 Серин 100 2500 134 250 750 150 Fe-FDTA Fe-EDTA 40 Джерела вуглеводного живлення: Сахароза 130000 Регулятори росту (контроль): 2,4-Д 0,2 Кінетин 0,2 Примітка. * - Пиляки культивувалися на варіантах агаризованого живильного середовища. 30 35 Результати біот естів. У процесі виконання біотестів було виявлено різну інтенсивність росту андрогенного калюсу на поверхні культивованих пиляків залежно від генотипу огірка та виду випробуваної речовини. У таблиці 2 наведено зведені дані по проведених біотестах. Як засвідчили одержані результати, негативною дією на ріст і формування репродуктивних органів позначилася попередня обробка рослин регулятором 2,4-Д практично у всіх відібраних селекційно цінних форм огірка. Відносно контролю (обробка рослин водою), дія 2,4-Д призводила до зменшення інтенсивності морфогенетичних процесів в культурі пиляків in vitro на 33-61 % у генотипів К-50295, К-50296, К53212, а у генотипів К-53451 і К-53428 спостерігалася повна відсутність ростових процесів. 2 UA 98411 C2 5 10 Серед еталонних регуляторів високі морфогенетичні потенції у культивованих пиляків виявив регулятор ауксинової дії - НОК. При його застосуванні в культурі пиляків відмічено суттєве збільшення формоутворюючих процесів, а саме частота формування калюсу зростала на 126335 %. Серед значної кількості препаратів, які були використанні для посилення морфогенетичних процесів був відібраний найбільш перспективний композиційнийпрепарат, який являє собою суміш ді-(N-окис 2-метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду та калію йодистого у співвідношенні 1:1, застосування якого для обробки донорних рослин частота формування калюсу у культурі пиляків зростала на 71-418 % відносно контролю (табл. 2) Використання НОК, та відібраного нами заявлюваного препарату для передобробки донорних рослин огірка сприяло ініціації андрогенезу в культурі пиляків генотипу К-53451 з частотою формування зон росту андрогенного калюсу на рівні 2,34-4,01. Тоді як при звичайному культивуванні без передобробки донорних рослин випробуваними речовинами, пиляки огірка цього генотипу не утворювали калюс. 3 UA 98411 C2 Таблиця 2 Рівень морфогенезу в культурі пиляків огірка in vitro залежно від передобробки донорних рослин випробуваними біологічно активними речовинами. Селекційноцінні форми Біологічно № п/п огірка (номер речовина каталогу) 1 1. 2 К-50295 2. К-50296 3. 4. 5 К-53212 К-53451* К-53428 Всього активна висаджено пиляків, зразків 3 Обробка водою (контроль) НОК (еталон 1) 2,4Д (еталон 2) Заявлюваний препарат Обробка водою (контроль) НОК (еталон 1) 2,4Д (еталон 2) Заявлюваний препарат Обробка водою (контроль) НОК (еталон 1) 2,4Д (еталон 2) Заявлюваний препарат Обробка водою (контроль) НОК (еталон 1) 2,4Д (еталон 2) Заявлюваний препарат Обробка водою (контроль) НОК (еталон 1) 2,4Д (еталон 2) Заявлюваний препарат 4 60 10 3,84 60 80 16,7 1,56 +335 -59 75 17,82 +364 75 3,12 60 70 7,44 1,23 +138 -61 80 7,84 +151 70 1,52 80 75 5,04 1,02 +232 -33 80 7,88 +418 80 0 90 90 2,34 0 0 80 4,01 +71 80 2,61 80 75 5,90 0 +126 0 90 10,04 +285 5,75 0,37 Середнє HIP0,05 % 5 Приріст статистичного Частота показника "Частота формування формування калюсу калюсу проембріонального проембріонального походження, %. походження" відносно контролю, % 5 6 *Примітка. - у цьому варіанті досліду порівняння ефективності дії випробуваних речовин проводилося відносно еталонного регулятору - НОК. Висновки, щодо застосування випробуваних біологічно активних сполук. Встановлено, що суттєвий вплив на індукцію росту проембріонального калюсу в культурі пиляків огірка in vitro має попередня обробка донорних росли регуляторами росту. Використання для цієї мети НОК та заявляемого препарату дозволяє значно посилити процес андрогенетичних новоутворень в культурі пиляків огірка in vitro. Джерела інформації: 1. Плужнікова Л. Є, Солодовнік Л. Д. Створення потрійного гібрида огірка для відкритого ґрунту // Овочівництво і баштанництво. - 2009. - Вип. 55. - С. 260-264. 4 UA 98411 C2 5 10 15 20 25 2. Ткаченко Н. Н. Селекционная работа с гибридами огурцов нового поколения// Тр. Крымской ОСС ВИР. - 1968. - Т. 4. - С. 3-14. 3. Мещеров Э. Т. Основные задачи селекции и новые методы семеноводства гетерозисных гибридов огурцов// Методы ускорения селекции овощных культур. - Л.: Колос. - 1975. - С. 70-78. 4. Тырнов B. C. Гаплоидия у растений: научное и прикладное значение. - М.:Наука. - 1998. 53 с. 5. Семова Н. Ю. Разработка лабораторной технологии получения андрогенных растений белокочанной капусты с использованием культуры пыльников: Автореф. дис. ... канд. б. наук: 03.00.23 / ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур РАН. - М., 1992. - 17 с. 6. Poliakov A. V., Ilchenko О. V. Production of andro- and gynogenic plants of carrot (Daucus carota L.) // Сб. научных трудов междунар. научно-практич. конф. «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур». - Москва, 22-25 марта 2004. - М., 2004. - С. 146150 7. Білинсъка О. В. Застосування культури пиляків in vitro для створення. вихідного матеріалу в селекції голозерного ячменю // Селекція і насінництво. - 2002. - Вип. 86. - С. 164-172. 8. Маруненко К. М. Условия, способствующие развитию микроспор по спорофитному пути и получение гаплоидов в культуре пыльников картофеля: Автореф. дис. ... канд. б. наук: 03.00.12 / Институт картофелеводства УААН. - Немешаево, 1986. - 24 с. 9. Круглова Н. Н. и др. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов // Успехи соврем. биол. - 1999. - Т. 119. - Вып. 6. - С. 567-577. 10. Ніколаевсъка А. О., Іващенко Я. М., Караванов Ю. В. Застосування нового стимулятора препарату № 31 при вирощуванні помідорів і огірків // Овочівництво і баштанництво. - 1973. Вип. 16. - С. 16-25. 11. Пономаренко С. П., Николаенко Т. К., Троян В. М., Яворская В. К, Паладина Т. А., Боровиков Ю. Я. Регуляторы роста на основе n-окисов производных пиридина. Физикохимические свойства и механизм действия // Регуляторы роста растений. - К.: РДЭНТП, 1992. С. 28-52. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 Спосіб обробки рослин селекційно цінних форм огірка, який відрізняється тим, що обробку здійснюють композиційним препаратом, що містить ді-(N-оксид 2-метилпіридин)цинк(ІІ)хлориду та калію йодистого в ефективній кількості. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5