Злитий білок, який складається з мишачого або олюдненого моноклонального антитіла мав425 або його фрагменту, який спрямовано проти пухлинної клітини, спосіб його отримання, фармацевтична композиція

1 Слитый белок, состоящий из мышиного или очеловеченного моноклонального антитела МаЬ425 или его фрагмента, направленного против опухолевой клетки, несущей антигенную детерминанту рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), и биологически активного цитокина, слитого с указанным антителом или фрагментом антитела, и обладающего цитотоксической способностью к специфическому лизису опухолевой клетки 2 Слитый белок по п 1, отличающийся тем, что цитокин выбран из группы TNF a, IL-2, IL-4 и IL-7 3 Слитый белок по одному из пп 1-2, отличающийся тем, что антителом является P(ab')2фрагмент, в основном содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела, СН1-домен константной области, и соответствующую легкую цепь 4 Слитый белок по одному из пп 1-2, отличающийся тем, что антителом является фрагмент антитела, в основном содержащий вариабельную область тяжелой цепи, СНІ- и СН2- домены кон стантной области, и соответствующую легкую цепь 5 Слитый белок по одному из пп 1-2, отличающийся тем, что антитело в основном содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, СН1-, СН2- и СНЗ- домены константной области, и соответствующую легкую цепь 6 Слитый белок по одному из пп 1-5, отличающийся тем, что выбран из группы Mab 425-CH1TNFa, Mab 425-CH2-TNFa, Mab 425-CH3-TNFa, Mab 425-CH1-IL2, Mab 425-CH2-IL2 и МаЬ 425CH3-IL2 7 Способ получения слитого белка по одному из пп 1-6 путем слияния ДНК-последовательностей, кодирующих антитело или фрагмент антитела, и биологически активного цитокина друг с другом, встраивания полученной конструкции в экспрессирующий вектор, которым трансформируют хозяйский организм, культивирования хозяйских клеток в питательном растворе и экспрессии слитого белка 8 Способ по п 7, осуществляемый путем слияния ДНК-последовательностей, кодирующих антитело или фрагменты антитела, и биологически активного цитокина на одноцепочечной ДНК с использованием олигонуклеотида, комплементарного ДНКпоследовательности, необходимой для слияния 9 Способ по п 7 или 8, для экспрессии слитого белка "антитело-СН1" в Е coh, используемой в качестве хозяина 10 Способ по п 7 или 8 для экспрессии слитых белков "антитела-СН2" или "антитела-СНЗ" в эукариотическом хозяине 11 Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один из слитых белков по пп 1 -6 и физиологически приемлемый носитель Настоящее изобретение относится к новым слитым белкам, которые включают в себя опухолеассоциированный и направленный против клетки-мишени элемент, предпочтительно моноклональное антитело или его фрагмент, распознающие молекулу, экспрессирующуюся преимущественно на опухолевых клетках человека, например, такую, как рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), и биологически активный лиганд, например, такой как фактор роста и/или фактор дифференцировки Полученный гибридный белок может быть использован для доставки биологически активного лиганда к специфическим клеткам-мишеням или тканям-мишеням Новые иммунокон Зоя о 00 00 00 41888 ъюгаты могут быть использованы для лечения опухолевых заболеваний Для лечения раковых заболеваний было разработано множество различных терапевтических методов В последние годы были проведены клинические испытания с использованием моноклональных антител, которые обладают способностью к специфическому или преимущественному распознаванию молекул клеточной поверхности, экспрессируемых на злокачественных клетках Целью описанной методики является индукция антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент опосредованной цитотоксичности (CDC) для удаления опухолевых клеток Второй способ, разработанный за последнее время, заключается в цитокин-опосредованной активации иммунного ответа Такая цитокин-индуцированная противоопухолевая активность может быть опосредована 1) прямым цитотоксическим/цитостатическим воздействием цитотоксина на рост опухоли, 2) "опухоль-антиген" - неспецифическими механизмами, такими, как LAK-активность, или моноцит/макрофаг - опосредованная цитотоксичность, 3) "опухоль-антиген" - специфическими иммунными реакциями, опосредованными CD4 и СО8-положительными Т-клетками В этом случае, системный иммунитет против опухолей наблюдался на моделях животных К сожалению, токсичность цитокинов, таких, как IL-2 или TNFa, не позволяет широко использовать их для системного внедрения (Rubin, Cancer Invest , 1 1 , 460-472, 1990, Balkwill Nature 361 206207, 1993) Для обеспечения достаточной концентрации цитокинов в месте локализации опухоли, их необходимо вводить в довольно высоких дозах, и эти дозы, как правило, превышают предельно допустимые дозы Отсюда очевидно, что негативный эффект применения цитокинов обусловлен, в основном, их системным введением, однако возможность использования цитокинов при лечении опухолей не вызывает сомнений На моделях животных было проиллюстрировано, что присутствие in situ цитокина, обусловленное либо внутриопухолевой инъекцией, либо секрецией трансфецированных опухолевых клеток, может приводить к регрессии опухоли (Носк и др , PNAS, 90 2774-2778, 1993, Colombo и др, Cancer Res 52 4853-4857, 1992, Mcbnde и др , Cancer Res 52 3931-3937, 1992, Террег и др , Science, 257 548-551, 1992, Mullen и др Cancer Res 52 6020-6024, 1992, Blankenstem и др, J Exp Med 173 1047-1052, 1991, Gansbacher и др , J Exp Med 172 12171224, 1990) В этих системах, цитокины не ослабляют опухолевую пролиферацию, но активируют быструю и сильную антиопухолевую реакцию Поэтому, физическая комбинация эффекторной молекулы и элемента, направленного против мишени, должна способствовать снижению периферического количества биологически активного лиганда и увеличению его количества внутри опухоли Кроме того, эти молекулы могут быть также направлены на одиночные опухолевые клетки или микро-метастазы Указанный биологически активный лиганд, обеспечивающий антитело-направленную достав ку конъюгата к клеткам-мишеням, должен индуцировать деструкцию клетки-мишени либо непосредственно, либо посредством создания условий, летальных для клетки-мишени Таким биологически активным лигандом может быть цитокин, например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFN, TNFa или CSF Было показано, что эти цитокины обладают либо непосредственным противоопухолевым действием, либо способностью активировать защитные механизмы хозяина (Mire-Sluis, TIBTECH 11 74-77, 1993, Colombo и др , Cancer Res 52 4853-4857, 1992, Thomas & Balkwill, Pharmac Ther 52 307 Например, IL-2 является, как предполагают, центральным медиатором иммунного ответа Было показано, что IL-2 стимулирует пролиферацию Т-клеток и NK-клеток (природных киллеров), а также индуцирует лимфокин-активированные клеткикиллеры (LAK) IL-2 индуцирует пролиферацию-Тлимфоцитов, вызывающих инфильтрацию опухоли Кроме того, IL-2 усиливают цитотоксичность Тклеток и моноцитов IL-2 индуцируют каскад цитокинов, секретируемых Т-клетками, NK-клетками и моноцитами, что способствует дополнительному потенцированию иммунной реакции TNFa находит широкое применение в опухолевой терапии, главным образом, благодаря своей непосредственной цитотоксичности в отношении некоторых опухолевых клеток, и способности индуцировать геморрагический регресс опухоли Помимо этого, TNFa способствует усилению иммунного ответа, поскольку он является костимулирующим фактором пролиферации Т-клеток, и индуцирует экспрессию антигенов ГКС класса I и класса II, а также секрецию TNFa IFN и IL-1 макрофагами IL-4 был первоначально описан как фактор роста В-клеток В последующих исследованиях было показано, что IL-4 стимулирует антиген-специфические цитотоксические Т-клетки, и оказывает специфическое воздействие на Т-клетки, подобные LAK клеткам, а не на NK-клетки, подобные LAK клеткам IL-4 ингибирует рост клеток меланомы человека, и усиливает экспрессию их ГКС класса I и класса II Факт индуцирования макрофаг-опосредованного противоопухолевого действия IL-4 остается пока спорным IL-7 представляет собой фактор роста преВ-клеток, а также периферических CD4- и CD8-noложительных Т-клеток IL-7 непосредственно увеличивает цитотоксичность СО8-положительной субпопуляции Т-клеток Помимо этого, IL-7 способствует продуцированию IL-1, IL-6 и TNFa периферическими моноцитами In vitro, противоопухолевая активность моноцитов/макрофагов может быть стимулирована вышеуказанным фактором IL-7, и возможно опосредована цитокинами, такими, как TNFa Эпидермальный фактор роста (EGF) представляет собой полипептидный гормон, который является митогенным для эпидермальных и эпителиальных клеток При взаимодействии EGF с чувствительными клетками, он связывается с мембранными рецепторами (EGFP) EGFP представляет собой трансмембранный гликопротеин (около 170 кДа), и является генным продуктом c-evb-B протоонкогена 41888 Было обнаружено, что мышиное моноклональное антитело МАЬ 425, продуцируемое против клеточной линии карциномы А431 человека (АТСС CPI 1555), связывается с эпитопом полипептида на внешнем домене EGFP Как было установлено, это антитело ингибирует связывание EGF, опосредует in vitro-цитотоксичность по отношению к опухолям, и подавляет опухолевый рост in vitro клеточных линий, происходящих от эпидермальной и колоректальной карциномы (Rodeck и др , Cancer Res 47, 3692) Гуманизированные и химерные варианты МАЬ 425 описаны в WO 92/15683 В литературе были описаны иммуноконъюгаты "антитело-цитокин" в различных комбинациях, предназначенные для направленной доставки активных белков к тканям-мишеням IL-2 был объединен со специфическим антителом против карциномы человека L6 (Fell и др, 1991, J Immunol 146 2446-2452, EP-OS-0439095), или с антителом против ганглиозида GD2 (Gillies и др , 1992, PNAS 89 1428-1432, WO 92/08495) Были также генерированы иммуноконъюгаты, состоящие из антиданзилового антитела и IGFI, и обеспечивающие направленную доставку гормонов к тканям-мишеням (Shin & Morrison 1990, PNAS 87 5322-5326, WO 91/14438) Таким образом, целью настоящего изобретения является продуцирование антител или их фрагментов, содержащих (1) эпитоп, направленный против EGFP - антигена на поверхности опухолевой клетки, и (2) биологически активный лиганд, обладающий высокой степенью способности индуцировать цитотоксичность, и тем самым, интенсифицировать противоопухолевый эффект in situ Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, включающим в себя часть моноклонального антитела, или, по крайней мере, его сайт распознавания антигена, либо полное моноклональное антитело, и биологически активный лиганд Конструкции, кодирующие указанные иммуноконъюгаты, получают с использованием техники рекомбинантных ДНК Эти иммуноконъюгаты содержат вариабельную область тяжелой цепи антитела и СН1-домен константной области (антителоСН1-конъюгат), или СН1- и СН2-домены константной области (антитело-СН2-конъюгат), или СН1-, СН2-, и СНЗ-домены контактной области (антитело-СНЗ-конъюгат), связанные с биологически активным лигандом Кроме того, могут быть генерированы иммуноконъюгаты, которые содержат соответствующую легкую цепь, и которые направлены на антиген-несущие клетки и способны обеспечивать доставку активного лиганда к конкретному участку организма (рис 1а-с) С помощью иммуноконъюгатов настоящего изобретения могут быть обнаружены и подвергнуты успешному лечению такие опухоли, как меланома, глиома и карцинома В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является получение иммуноконъюгата, состоящего из (1) моноклонального антитела или его фрагмента, направленного против опухолевой клетки, несущей антигенную детерминанту (эпитоп) рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), и (2) биологически активный лиганд, предпочтительно, цитокин, который сцеплен с указанным антителом или его фрагментом, и обладает цитотоксической способностью специфически лизировать опухолевую клетку in situ, или индуцировать опухолеспецифический иммунный ответ В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, цитокины выбирают из TNFa , IL-2- IL-4 и IL-7 В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, антитело или его фрагмент происходит от мышиного, гуманизированного или химерного МАЬ 425 В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, иммуноконъюгатами являются МАЬ 425-CH1-INF, МАЬ 425-CH2-INF, и МАЬ 425-CH3-INF, МАЬ 425-СН1IL2 и МАЬ 425-CH2-IL2, МАЬ 425-CH3-IL-7, МАЬ 425-CH2-IL-7 и МАЬ 425-CH3-IL-7 Кроме того, целью настоящего изобретения является разработка способа получения иммуноконъюгата, определенного выше и в нижеприведенной формуле изобретения, который осуществляют с использованием организма-хозяина, и который заключается в том, что получают гибридную конструкцию, содержащую ДНК-последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент, и биологически активный лиганд, полученную конструкцию вставляют в экспрессирующий вектор, которым трансформируют указанный хозяйский организм, хозяйские клетки культивируют в питательном растворе, и гибридный белок экспресс и ру ют В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется технология, в которой ДНК-последовательности, кодирующие антитело или его фрагмент, и биологически активный лиганд, сливают на одноцепочечной ДНК с использованием олигонуклеотида, комплементарного ДНК-последовательности нужной для слияния Кроме того, целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей, по крайней мере, один иммуноконъюгат, определенный выше и в формуле изобретения, и физиологически приемлемый носитель И наконец, еще одной целью настоящего изобретения является использование иммуноконъюгатов, определенных выше и в формуле изобретения, для изготовления противоопухолевого средства Было обнаружено, что в случае использования иммуноконъюгатов "антитело-СН2" и "антитело-СНЗ", например, таких, как МАЬ 425-CH2-TNFa и МАЬ 425-CH3-TNFa , наблюдается особенно высокая степень индукции клеточной цитотоксичности по сравнению с неконъюгированными TNFa Этот факт, вероятно, обусловлен сочетанием связывающих свойств, индуцирования А СС (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности) константными областями моноклонального антитела, и активности цитокинов Преимущество конъюгатов "антитело-СН1" настоящего изобретения заключается в небольшом размере их молекулы, а также в их способности экспрессироваться в прокариотах Малый размер молекулы облегчает проникновение конъюгата в ткани (опухоль) 41888 Кроме того, иммуноконъюгаты настоящего изобретения обнаруживают хорошую способность к связыванию и пролиферации по сравнению с моноклональным антителом (предпочтительно МАЬ 425) как таковым или его фрагментами Материалы и методы Моноклональные антитела МАЬ 425 представляет собой мышиное моноклональное антитело lgG1, продуцируемое против клеточной линии карциномы А431 человека (АТСС CPL 1555) МАЬ 425 связывается с полипептидным эпитопом внешнего домена EGF-peцептора человека и конкурирует за связывание с EGF Было обнаружено, что МАЬ 425 опосредует опухолевую цитотоксичность in vitro, и подавляет in vitro рост клеток эпидермальной и колоректальной карциномы (Rodeck и др , 1987, Cancer Res 47 3692) Гуманизированные и химерные варианты МАЬ 425 были описаны в WO 92/15683 Цитокины Цитокин-кодирующие кДНК поставлялись от фирмы British Biotechnology Limited (Herrmann Biermann GMBH, Ban Nauheim FRG чел IL-2 BBG30, чел IL-4 BBG15, чел IL-7 BBG 43, чел TNF BBG 18) В коммерчески доступных кДНК отсутствует сигнальная последовательность, необходимая для выделения белка Цитокин-кодирующие кДНК могут быть генерированы из мРНК, выделенной из цитокин-продуцируемых клеток Векторы pUC19 является одним из серии родственных мультикопийных Е coli-плазмидных векторов клонирования, и содержит части рВР322 и М13 mp19 pUC19 содержит индуцибельный 1 асбактериальный промотор-оператор, и расположенный за ним множественный клонирующий сайт (Yamsch-Perron и др , Gene 33 103-109, 1985) Векторы pUC являются коммерчески доступными (например, New England Biolabs) Фазмидные векторы pBlueserpt KS/SK + и KS/SK- происходит от pUC19 Эти векторы являются коммерчески доступными (Stratagene) Эукариотический экспрессирующий вектор pHCMV (G і L-Lies и др , 1983, Cell 33 717) содержит сайт инициации репликации обезьяньего вируса 40 (SV 40) и область промотора и энхансера цитомегаловируса человека Указанная область промотора/энхансера расположена за сайтом мультиклонирования (mcS) для введения экспрессируемых генов В этом векторе, для генерирования гибридного белка с тяжелой цепью МАЬ 425, были объединены химерная форма вариабельной области тяжелой цепи МАЬ 425 и области Су / ASac II, сцепленная с эффекторной молекулой в конце домена СН1, СН2 или СНЗ, соответственно Гибридная цепь Ig может быть включена в иммуноконъюгат путем ее объединения с соответствующей легкой цепью, в результате чего образуется моновалентная область связывания с антигеном, которая может быть затем использована для продуцирования дивалентного иммуноконъюгата, специфического для антигена-мишени (рис 1) Конструкции с тяжелой и легкой цепью могут быть введены в тот же самый или в разные векторы Вектор для экспрессии в прокариотах получают на основе вектора pSW1 (Ward и др , Nature 341 544-546, 1989), который происходит от вектора pUC19 pSW1 содержит последовательность, кодирующую лидерный пептид бактериального ре1В-гена от Erwmia carotovra (Lei и др , J Bact 169 4379-4383, 1987) Чужеродные ДНК могут быть введены с сохранением рамки считывания ниже лидерной последовательности ре1В для регулирования экспрессии белка в периплазме Краткое описание рисунков и Таблиц Таблица 1 РСР-праймеры, используемые для генерирования МАЬ 425-цитокин-гибридных белков (эукариотическая экспрессия) * Обратный праймер, гибридизирующийся с -векторами (Stratagene) SK+/- и KS+/- (коммерческий продукт), ** Этот праймер гибридизируется с константной областью Cgl, включая уникальный Sacllсайт, *** Обратный праймер, гибридизирующийся с векторами, происходящими из М13 (коммерческий продукт) Таблица 2 PCR-праймеры, используемые для генерирования МАЬ 425-цитокин-гибридных белков (прокариотическая экспрессия) Рис 1 Модель иммуноконъюгатов "антитело-цитокин" С = цитокин, VH = вариабельная область тяжелой цепи, VL = вариабельная область легкой цепи, СН = константная область тяжелой цепи, CL = константная область легкой цепи (а) конъюгат "антитело-СН1", (Ь) конъюгат "антитело-СН2", (с) конъюгат "антитело-СНЗ" Рис 2 Связывание иммуноконъюгатов с EGF-рецегтгором (EGFR) в EGFR-специфическом ELISA-анализе Супернатанты кратковременно трансфицированных клеток COS-7 анализировали на содержание иммуноконъюгата Вертикальная ось % оптической плотности при 490 нм, горизонтальная ось разведение супернатанта (log 2) МАЬ 425 CH1-TNFa (заштрихованные (cilled) кружочки), МАЬ 425 CH2-TNFa (заштрихованные квадраты), МАЬ 425 СНЗ-TNFa (заштрихованные треугольники), МАЬ 425 - контроль (заштрихованные ромбы), МАЬ 425 FAb-контроль (перевернутый заштрихованный треугольник), МАЬ 425 F (аЬ')г в своей первоначальной форме (очищенный белок) (заштрихованный шестиугольник) Рис ЗА IL-2-активность иммуноконъюгата "МАЬ 425-CH1-IL-2", экспрессированного в клетках COS-7 Клетки CTLL-2 использовали в качестве индикаторной клеточной линии Пролиферативная активность серийно разведенного COS-супернатанта, содержащего МАЬ 425-CH1-IL-2, показана на левой панели (заштрихованные кружки) В качестве контроля использовали COS-супернатант, содержащий МАЬ 425 Fab-контроль (незаштрихованные кружки) Пролиферативный ответ клеток CTLL-2 на активацию рекомбинантным коммерческим IL-2-белком или без IL-2 (КО) показан на правой панели Рис ЗВ IL-2-активность иммуноконъюгата "МАЬ 425-CH1-IL-2", экспрессированного в Е coh Клетки CTLL-2 использовали в качестве индикаторной клеточной линии Пролиферативная активность серийно разведенного иммуноконъюга 41888 та MAb 425-CH1-IL-2, экспрессированного в Е сої і, аффинноочищенного на идиотипической колонке против МАЬ 425, показана на левой панели (заштрихованные треугольники) В качестве контроля использовали COS-супернатант, содержащий МАЬ 425-CH1-IL-2 (зачерненные (closed) кружки) Буфер для диализа - зачерненные квадраты Для того, чтобы убедиться, что буфер не влияет на IL-2-активность, буфер для диализа титровали в присутствии постоянной концентрации IL-2 (1 ед /мл) (заштрихованные перевернутые треугольники) Пролиферативный ответ клеток CTLL 2 на активацию коммерческим рекомбинантным белком с IL-2 или при отсутствии IL-2 (КО) показан на правой панели Рис ЗС Индуцирование TIL-пролиферации с помощью иммуноконъюгата MAb 425-CH1-IL-2 Лимфоциты, вызывающие инфильтрацию меланомы, культивировали в отсутствие (КО) или в присутствии серийно разведенных COS-супернатантов, содержащих иммуноконъюгат 425-CH1-IL2 (левая панель) Пролиферативный ответ TIL на активацию рекомбинантным коммерческим IL-2 показан на правой панели Рис 4 Индуцирование HPBL-пролиферации с помощью иммуноконъюгата MAb 425-IL-4 РНА-активированные HPBL культивировали в присутствии серийно разведенных COS-супернатантов, содержащих MAb 425-CH2-IL-4 (зачерненные кружочки), MAb 425-CH3-IL-4 (зачерненные треугольники) - гибридные белки Супернатанты, содержащие МАЬ 425 (зачерненные квадраты), IL4 (зачерненный ромб), и векторный контроль (зачерненный перечеркнутый треугольник), использовали в качестве контроля Пролиферативный ответ HPBL на активацию рекомбинантным коммерческим IL-4 и при отсутствии фактора роста (КО) показан на правой панели Рис 5 Цитотоксичность иммуноконъюгата MAb 425-TNFa по отношению к клеткам WEH1 164 Клеточную линию TNFa-чувствительной мышиной фибросаркомы WEH1 164 культивировали 48 часов в присутствии серийно разведенных COS-супернатантов (левая панель), содержащих 425-СН1-Т1ЧРа-иммуноконъюгат (заштрихованные квадраты) или 425-СН2-Т1ЧРа-иммуноконъюгат (заштрихованные треугольники), или МАЬ 425 FAb-контроль (заштрихованные кружки) Ингибирование роста индикаторных клеток, индуцированного коммерческим рекомбинантным TNFa человека, проиллюстрировано на правой панели Рис 6 Цитолиз опухолевых клеток лимфоцитами периферической крови, опосредованный MAb 425-TNFa -иммуноконъюгатом Неактивированные лимфоциты периферической крови (РВМС) использовали в качестве эффекторных клеток, и культивировали вместе с аллогенными EGF-R-положительными 51Сг-мечеными клетками-мишенями С8161 в отношении эффектор/мишень = 30 1 Процент специфического лизиса вычисляли после 18-часового совместного культивирования в отсутствие или в присутствии серийно разведенных COS-супернатантов, содержащих иммуноконъюгат MAb 425-CH3TNFa (заштрихованные столбцы) Рекомбинантный TNFa (Genzym) был экспрессирован в Е coh как 36 кДа-димер (точечные столбцы) Другие микроорганизмы, клеточные линии, плазмиды, промоторы, маркеры резистентное™, сайты инициации репликации, рестрикционные сайты или другие фрагменты векторов, которые упоминаются в настоящем описании, являются коммерчески доступными, либо они могут быть продуцированы стандартными методами Если это не оговорено особо, то все указанные элементы могут быть использованы лишь в иллюстративных целях, и в основном, не относятся к настоящему изобретению, причем они могут быть заменены другими подходящими элементами и биологическими материалами, соответственно Способы, относящиеся к настоящему изобретению подробно описаны ниже Другие способы, которые являются стандартными и достаточно хорошо известными специалистам, и которые упоминаются в настоящем описании, более подробно описываются в цитируемых работах, патентных заявках и в специальной литературе (см , например, "Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow, Lane Spring Harbor, 1988) Экспрессия гибридных белков в эукариотических клетках Конструирование экспрессирующих векторов для эукариотической экспрессии FAb 425-цитокин-гибридного белка Слияние МАЬ 425 и цитокинов с использованием техники выпетливания Генерирование TNFa-конструкций S a d 1 /Xba1 -фрагмент S a d 1 -Су1 -клона вставляли в вектор Bluescnpt SK+, содержащий цитокин-кодирующие последовательности, такие, как TNFa-кДНК TNFa-кДНК вводили между сайтами Smal и EcoRI Эту конструкцию получали в виде одноцепочечной ДНК путем добавления соответствующего фага-хелпера Домен СН2 или СНЗ сливали с сохранением рамки считывания к 5'-концу TNFa кодирующей последовательности Олигонуклеотиды 5'CGAAGATGATCTGACCAT TTTGGCTTTGGAGATGGT З1 TNF I cg1 CH2 51 CGAAGATGATCTGACCAT TTTACCCGGAGACAGGGA 31 TNF | cg1 CH3 являются гомологичными З'-концу СН2-домена и СНЗ-домена, соответственно, и 5'-концу TNFa-кодирующей последовательности Одноцепочечные ДНК-последовательности соединяли друг с другом посредством олигонуклеотида, а нежелательные последовательности, расположенные между ними, из конструкции удаляли Олигонуклеотиды имели противоположную ориентацию, поскольку верхнюю цепь продуцировали как одноцепочечную ДНК К полученной ДНК достраивали вторую цепь с помощью секвеназы-полимеразы Этот фермент 41888 не подвержен ошибкам, как ДНК-полимераза Amphtag, а поэтому была определена лишь ДНКпоследовательность области соединения выделенных клонов Клоны с правильной последовательностью были лигированы с последовательностями, необходимыми для генерирования полного МАЬ 425-гибридного белка, и клонированы в вектор pHCMV для экспрессии в эукариотических клетках Генерирование IL-4-конструкций Для генерирования указанных конструкций, полный ASac11-cy1-moH вставляли в Bluescnpt KS+ в качестве KpnL/Sall-фрагмента IL-4 клонировали как Hind IH/EcoRI-фрагмент в тот же самый вектор Генерирование гибрида осуществляли так же, как и для TNF- конструкций, но с использованием следующих олигонуклеотидов 51 GATATCGCACTTCTCCAT TTTGGCTTTGGAGATGGT З1 IL-4 I eg 1 СН2- домен 51 GATATCGCACTTGTGCAT TTTACCCGGAGACAGGGA З1 IL-4 I eg 1 СНЗ-домен для слияния с СН2- и СНЗ-доменом, соответственно Клоны с правильной последовательностью объединяли с последовательностями, необходимыми для генерирования полного mAb 425-гибридного белка, и клонировали в вектор рНСМ для экспрессии в эукариотических клетках Получение гибрида "МАЬ 425-цитокины" с помощью РСР-технологии ДНК-пол имераза Amphtag подвержена ошибкам, и во избежании возможных ошибок, были определены последовательности вышеуказанных фрагментов, амплифицированных с помощью РСР-технологии Праймеры, использованные в этих экспериментах, систематизированы в Таблице 1 Генерирование СН1-гибридных белков Плазмиды pUH5 содержит последовательности фрагмента Fab 425 тяжелой цепи для прокариотической экспрессии и N-концевой ре1В-лидерной последовательности, происходящей из Erwmia carotovora (Lei и др, J Bact 169 4379-4383, 1987), и обеспечивающей секрецию белка HindiH/Notl-фрагмент субклонировали в вектор Bluescnpt KS+ Цитокины IL-4 и IL-7 были амплифицированы с помощью РСР-технологии и введены в рестрикционные 5' Ncol и 3' ВатН1-сайты, соответственно IL-2 и TNFa уже содержали 5' ВатН1 и 3' ВатН1-сайты рестрикции Все цитокины были клонированы в качестве Нсо1/ВатН1фрагментов показали СН1-домена В этих конструкциях, последовательности цитокинов были введены без сохранения рамки считывания Поэтому, между Sail- и Ncol-сайтами рестрикции был введен адаптор (51 TCGACAAGAAAG З1) В полученных конструкциях, тяжелая цепь и цитокин были экспрессированы как гибридный белок с одной дополнительной аминокислотой (Ala), введенной последовательностью адаптора Dra111 /BamH1-фрагменты были клонированы в экспрессирующей вектор рНСМ, содержащий полный кДНК-клон тяжелой цепи МАЬ 425 В этой конструкции, реІВ-лидерная последовательность была заменена на лидерную последовательность кДНК тяжелой цепи МАЬ 425 ков Генерирование СН2- и СНЗ-гибридных бел Sacll-c yl-ДНК была амплифицирована с помощью PCR-технологии в двух отдельных реакциях с использованием СН2-3'-концевых праймеров, которые перекрывались (с сохранением рамки считывания) с 5'-концом соответствующего ци токина, такого, как IL-2 и IL-7 IL-2 и IL-7-кДНК-клоны были также амплифицированы с помощью PCR Для облегчения субклонирования в ЭК+-вектор, а затем в экспрессирующий вектор pHCMV, в IL-2-конструкцию (у З'-конца) были введены уникальные Notl- и Sail-сайты, а в IL-7-конструкцию был введен уникальный Xotl-сайт Генерирование гибрида IL-2- и IL-7-PCR-npoflyKTOB с полной ДЗасІІ-суІ-областью осуществляли путем PCR-peкомбинации Полученный BamHI/Natl-фрагмент ASacll- с yl-CH2-IL-2 субклонировали в SK+, содержащий вариабельную область тяжелой цепи mAb 425 Sacll/Xbal-фрагмент ASall-CH-2-IL-7 субклонировали в вектор SK+, содержащий вариабельную область тяжелой цепи mAb 425 и Sall-cyl-область до Sail-сайта В результате этой процедуры были генерированы полные mAb 425-CH2-IL-2 и IL-7-гибридные гены, соответственно Аналогичным образом был генерирован полный mAb 425СНЗ-11_-2-гибридный ген за тем лишь исключением, что ASall-cyl был амплифицирован из уникального Sacll-сайта в качестве 5'-конца Sail / Pstl-фрагмент mAb 425-CH2-IL-2 в SK+, содержащем СН2-11_-2-гибрид, затем заменяли Sacll/Pstlфрагментом, содержащим СНЗ-11_-2-гибрид После этого полные mAb 425-гибридные гены клонировали в вектор pHCMV для экспрессии в эукариотических клетках Экспрессия иммуноконъюгатов Введение векторных конструкций в хозяйские клетки для экспрессии моновалентного иммуноконъюгата, содержащего лишь СН1-домен, или дивалентных иммуноконъюгатов, содержащих СН2- и СН2- плюс СНЗ-домены, может быть осуществлено путем электропорации, методами с использованием DEAE-декстрана, кальцийфосфата, липофектина, или путем слияния протопластов При этом, может быть использован любой тип клетки-хозяина, при условии, что рекомбинантные ДНК-последовательности, кодирующие иммуноконъюгат и соответствующую легкую цепь, правильно транскрибируются в мРНК в клетках этого типа Такими клетками-хозяевами могут быть клетки мышиной миеломы, которые не продуцируют иммуноглобулин, например, Sp2/O-AG14 (АТСС CPL 1581), P3X63Ag8 653 (ATCC CPL 1580), или клетки хомячка, такие, как СНО-К1 (АТСС CCL 61), или CHO/dhF- (ATCC CPL 9096), или ВНК-21 (АТСС CCL 10) Для кратковременной экспрессии могут быть использованы COS-I (АТСС CPL 1650) или COS-7 (ATCC CPL 1651) 41888 гатов Кратковременная экспрессия иммуноконъю Экспрессирующий вектор pHCMV содержит сайт инициации репликации обезьяньего вируса 40 (SV40) Клеточная линия COS-7 происходит от обезьяньей клеточной линии CV-I, которая была трансформирована вирусом SV40, не содержащим точки инициации репликации Поэтому, для улучшения продуцирования иммуноконъюгатов, амплифицировали плазмиды, содержащие точку инициации репликации вируса SV40 Через 72 часа, супернатанты собирали и анализировали на связывание с EGF-рецептором и на концентрацию цитокина Постоянная экспрессия иммуноконъюгатов Векторы, содержащие рекомбинантные конструкции, и предназначенные для экспрессии иммуноконъюгатов, вводили в соответствующие клетки-хозяева Конструкции, содержащие тяжелую и легкую цепи могут быть введены в тот же самый вектор или в разные векторы В последнем случае, оба вектора могут нести идентичные селективные маркеры, такие, как резистентность к неомицину, или dhFr, либо два различных селективных маркера для отбора на присутствие этих векторов Отбор на dhFr-маркер может быть осуществлен лишь в dhFr-отрицательных клеточных линиях, таких, как CHO/dhFr Клоны анализировали на экспрессию иммуноконъюгатов с помощью EGFP-специфического анализа ELISA Отобранные клоны подвергали дополнительной очистке путем клонирования методом серийных разведений Конструирование векторов для экспрессии МАЬ 425-СН1-цитокин-гибридного белка в прокариотах ДНК-последовательности, кодирующие легкую цепь МАЬ 425 и Fd-фрагмент тяжелой цепи, вводили в сайт множественного клонирования вектора pSWI Перед последовательностью, кодирующей зрелую легкую цепь, и последовательностью, кодирующей зрелую тяжелую цепь, находился лидерный пептид реІВ-бактериального гена Последовательность, кодирующая тяжелую цепь, содержала З'ІЧсоІ-сайт Цитокин-кодирующие кДНК были модифицированы посредством PCR для введения рестрикционных Ncol (5'-конец) и Not (31конец)-сайтов Гены цитокина сливали с сохранением рамки считывания непосредственно с СН1доменом тяжелой цепи Праймеры, используемые в этих экспериментах, систематизированы в Таблице 2 Эти векторы способны к эффективной экспрессии функциональных Fao-цитокин-гибридных белков в Е coli Белок-гидрид, содержащий легкую и тяжелую цепь и цитокин, локализован на дицистронной мРНК, находящейся под контролем индуцибельного Іас-промотора (Skerra и Pluckthun Science 242 1038-104,1988) Поэтому, экспрессия Fab-гибридного белка может быть индуцирована в соответствии с требуемыми условиями культивирования Трансляция обоих белков с дицистронной мРНК способствует синтезу равных количеств Fd-IL-2-гибридного белка и легкой цепи, повышая, тем самым, вероятность правильной сборки функциональных Fab-гибридных белков Эти два полипептида выделяются в периплазму Е coli, где происходит укладка, образование дисульфидных связей и сборка функционального FAB 425 СН1гибридного белка При продолжительном культивировании бактерий, белки выделяются в культуральную среду Экспрессия МАЬ 425-СН1 -IL-2-гибридного белка в Е coli и его очистка Штаммы Е coli, подходящие для экспрессии белка, трансформировали экспрессирующими плазмидами Клетки культивировали до уровня оптической плотности ОП580 - 0,5, и индуцировали с использованием IPTG (1 мМ) Эти клетки культивировали в течение ночи, после чего супернатанты и клетки собирали Супернатанты наносили антиидиотипическую колонку против МАЬ 425 Эту колонку промывали забуференным фосфатом 0,5 М NaCI, и связанные белки элюировали 100 мМ глицина 0,5 М NaCI, pH 2,5 Элюат сразу нейтрализовали 2,5 М -Трисом, рН 8 Фракции, содержащие МАЬ 425-CH1-IL-2, объединяли, концентрировали и диализовали против PBS Связывающие свойства МАЬ 425-иммуноконъюгатов Способность МАЬ 425 к связыванию определяли с помощью EGF-рецептор-специфического ELISA-анализа В общих чертах, эту процедуру проводили следующим образом планшеты для микротитрования покрывали (4°С, в течение ночи) очищенные EGF-рецептором, и промывали для удаления несвязанного белка Затем планшеты инкубировали с супернатантами, содержащими гибридный белок, или с супернатантами, содержащими неконъюгированные МАЬ, или Fab-фрагменты, или белки в очищенной форме Планшеты промывали и инкубировали с козьими античеловечьими IgG и IgM (тяжелая и легкая цепь), конъюгированными с пероксидазой Затем добавляли субстрат, и путем измерения при 450 нм (рис 2) определяли количество связанного EGFR-специфического белка Концентрацию цитокина определяли с помощью коммерческого набора для ELISA, специфического для каждого цитокина, в соответствии с инструкциями изготовителей (данные не проводятся) ки Пролиферация лейкоцитов Опухолеспецифические эффекторные клет Одноядерные лейкоциты периферической крови и опухолеинфильтрующие лимфоциты (TIL), полученные от пациентов, страдающих меланомой, культивировали вместе с облученными (3OGy) аутологичными опухолевыми клетками в среде RPMI 1640 ( 1 % пенициллин/стрептомицин, 1% глутамин, 20 мМ Hepes, 50 мМ р-меркаптоэтанола, 10% околоплодной сыворотки теленка, 20 ед /мл IL-2, 20 ед /мл IL-4) Иммунореактивные клетки были слегка стимулированы аутологичными опухолевыми клетками Оценка пролиферации Цитокин-опосредованная пролиферация может быть определена с помощью а) соответствующих индикаторных клеточных линий В случае IL-2, может быть использована IL-2-зависимая мышиная клеточная линия CTLL-2 (АЕСС TIB 241) (рис ЗА) или другие IL-2 зависимые клеточные линии, 41888 о) in vitro - развивающихся опухолеинфильтрующих лимфоцитов (рис ЗВ), с) свежевыделенных одноядерных клеток, предварительно обработанных РНА-М (sigma) В этом случае, эксперимент проводили с МАЬ 425IL-4-гибридными белками (рис 4) Свежевыделенные лейкоциты периферической крови человека, полученные от здоровых доноров или от пациентов с меланомой, либо TIL, полученные от пациентов с меланомой, культивировали in vitro (см выше) Для оценки гибридных белков, лимфоциты культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования при плотности 1 х 105 клеток на лунку в конечном объеме 200 мкл Затем клетки инкубировали с супернатантами, содержащими гибридный белок, или с супернатантами, содержащими неконъюгированные МАЬ, или с супернатантами, содержащими неконъюгированные цитокины, или белки в очищенной форме Через 72 часа, клетки подвергали импульсному мечению с использованием 0,5 мкКи 3Н-тимидина Введение радиоактивной метки определяли после ночного инкубирования путем р-счета подложки в жидком сцинтилляторе Результаты выражали как среднее число импульсов в минуту Определение цитотоксичности МАЬ 425TNFa -иммуноконъюгатов Определение TNFa -опосредованной цитотоксичности Известно, что TNFa обладает прямой цитотоксичностью в отношении некоторых клеток, включая, ряд опухолевых клеток Непосредственное цитотоксическое действие TNFa может быть определено с использованием мышиных фибробластов L 929 (АТСС CCL I), или WEHI 164 (АТСС CPL 1751), или других TNFa-чувствительных клеточных линий, описанных в литературе (Flick & Gifford 1984, J Immunol Meth 68 167) Нарис 4, цитотоксическое действие МАЬ 425 CH1-TNFa и МАЬ 425 CH2-TNFa проиллюстрировано на клетках WEHI 164, используемых в качестве индикаторной клеточной линии Определение TNFa-индуцированной цитотоксичности В качестве клеток-мишеней для цитолиза, опосредованного аллогенными опухолеинфильтрирующими лимфоцитами или свежевыделенными лимфоцитами периферической крови человека, полученными от пациентов с меланомой или от здоровых доноров, могут быть использованы EGF-рецептор-положительные клеточные линии, такие, как в высокой степени инвазивная и спонтанно метастатическая EGFR-положительная клеточная линия С8161 (Welch и др, 1991, Int J Cancer 47 227, и работы, цитированные выше) Условия культивирования опухолевых клеток и TIL были описаны ранее (Shimizu и др , 1991, Cancer Res 51 6153) In vitro-анализ на цитотоксичность осуществляли с использованием 1Сг-меченных опухолевых клеток-мишеней Эти клетки-мишени подвергали мечению в течение 1 часа с использованием 51Сг (100 мкКи/107 клеток), а затем промывали в три стадии для удаления избыточного 51Сг После этого, клетки-мишени (2 х 103 клеток на лунку) инкубировали вместе с эффекторными клетками в 96-луночных планшетах для микротитрования в присутствии супернатантов, содержащих слитый белок, ими супернатантов, содержащих неконъюгированные МАЬ, или супернатантов, содержащих неконъюгированные цитокины (контроль), или белков в очищенной форме Супернатанты или очищенные белки серийно разводили в культуральной среде, и анализировали в трех дубликатах Планшеты инкубировали в течение 4 часов при 37°С в атмосфере 10% СОг Затем клетки удаляли путем центрифугирования, а радиоактивность в супернатантах оценивали с помощью у-счетчика Процент специфического 51Сг-высобождения вычисляли по следующей формуле % специфического Сг-высвобождения = 100 х (Экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение) (Максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение) Терапевтическое использование иммуноконъюгатов Иммуноконъюгаты настоящего изобретения могут быть введены человеку для проведения терапии Поэтому, целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, которые, в качестве активного ингредиента, содержат, по крайней мере, один слитый белок, определенный выше или в формуле изобретения, в сочетании с одним или несколькими фармацевтическими приемлемыми носителями, наполнителями или разбавителями Иммуноконъюгаты настоящего изобретения, в основном, вводят путем внутривенной инъекции или другими парентеральными способами Дозы вводимых иммуноконъюгатов должны быть достаточными для получения желаемого эффекта подавления опухоли и лизиса опухолевых клеток Диапазон вводимых доз зависит от возраста, состояния здоровья, пола и степени тяжести заболе вания пациента, и может варьироваться от 0,1 мг/кг до 200 мг/кг, а предпочтительно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг на одну или несколько доз в день, которые могут быть введены в течение одного или нескольких дней Препараты для парентерального введения могут быть изготовлены в виде стерильных водных или безводных растворов, суспензий и эмульсий Примерами безводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие, как оливковое масло, инъецируемые органические сложные эфиры, такие, как этилолеат, и другие растворители, которые обычно используются специалистами в этих целях Иммуноконъюгаты настоящего изобретения могут быть введены в композиции, содержащие физиологически приемлемый носитель Примерами таких носителей являются физиологический раствор PBS, раствор Рингера, или лактат-содер 41888 жащий раствор Рингера В указанных фармацевтических препаратах могут также присутствовать консерванты, и другие добавки, такие, как антибиотики, антиоксиданты, и хелатообразующие агенты Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть использованы для лечения любых видов опухолей, включая меланомы, глиомы, и карциномы, а также опухоли крови, и твердые опухоли Таблица 1 Праймеры PCR, используемые для получения слитых белков МАЬ 25-цитокин Конструкт. Праймер ДНК-последовательность праймера 5і TATAGCGGCCGCGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATG 3і cyl 5' primer** 5і CAAGACAAAGCCGCGGGAG 3і 5і ACTTGAAGTAGGTGCCATTTTACCCGGAGACAGGGAG 3і cytokme 5' primer 5і ATGGCACCTACTTCAAGT 31 cytokme 3' primer 5і CTTCTTCTAGACACTGCAG 3і cytokme 5' primer 5і ATCACCATGGTAATGCACAAGTGCGATATCACC 3і cytokme 3' primer*** 5і CAGGAAACAGCTATGAC 3і cytokme 5' primer 5і CTTACCTGCCATGGATTG 3і cytokme 3' primer 5і CAGAATTCGGATCCTTATCAGTG 3і cyl 5' primer* 5і AACAGCTATGACCATG 3і cyl 3' primer 5і TTCGATATCACAATCCATTTTGGCTTTGGAGATGGT 3і cytokme 5' primer 5і ATGGATTGTGATATCGAA 3і cytokme 3' primer CH2-IL-7 51 ATGGCACCTACTTCAAGT 3і cyl 3' primer CH1-IL-7 51 ACTTGAAGTAGGTGCCATTTTGGCTTTGGAGATGGT 3і cytokme 3' primer CH1-IL-4 5'AACAGCTATGACCATG З1 cytokme 5' primer СНЗ IL-2 cyl 5' primer* cyl 3' primer CH2-IL-2 5і TAATTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGC 3і Таблица 2 Праймеры PCR, используемые для получения слитых белков FAb 425-цитокин (экспрессия в прокариотах) Конструкт. Праймер ДНК-последовательность праймера CH1-IL-7 5 CTTACCTGCCATGGCACCT 3і 51 TGGTAGCGGCCGCTTATCAAGTTAGTGTTGA 3і cytokme 5' primer 5і ATCACCATGGTAATGCACAAGTGCGATATCACC 3і cytokme 3' primer CH1-IL-4 cytokme 5' primer cytokme 3' primer CH1-IL-2 1 5і GGTAGCGGCCGCTTATCAGCTCGAACACTT 3і cytokme 5' primer 5і CTTACCTGCCATGGATTG 31 cytokme 3' primer 5і TGGTAGCGGCCCCTTATCAGTGTTCTTTAGT 3і 41888 (a) (Ь) (с) Фиг. 1 Фиг. 2 10 41888 A УЛ 140000 120000 100000 CCp! E 80000 60000 40000 20000 0 140000 / - • - • • щ « У о—о—о—о—о—о—о—о J I L 1280640320 160 80 40 20 10 _J I , • /\ КО 1 1 I 1 I 0.2 0.30.6 1.3 2.5 S.010-0 1 г I 1 1 1 1 Г 120000 100000 80000 60000 40000 20000 *У 0 10000 50000 30CD /Л ЮЗО \ J iOO )00 і і I 30 L 'О KQ J , , I, , I , , , I ОЇ С 3 0t tЗ I Іі іО I 40000 30000 о КО 640320160 80 40 20 JO ФИГ. 3 КО 1.6 3.1 Ь.Ь ! 2.SE5-0 50 \ 0 0 Ю О 41888 200000 150000 Ь о и 100000 h 50000 0 КО З 13 Б 25 50 100 2 0 0 200000 150000 Ь и и 100000 h 50000 Ь О КО 1/128 1/6-* 1/32 1/16 1/8 Фиг. 4 12 1/4 1/2 41888 450000 400000 350000 300000 250000 E jj 200000 150000 100000 50000 0 1/5t2 1/23Є 1/128 1/в« 450000 400000 350000 300000 E 250000 S" 200000 150000 100000 50000 0 25 Фиг. 5 13 50 100 41888 90 т 80 70 -60 -50 -40 -ЗО -20 10 + О 1.5 0,75 0.38 0.17 0085 TNFa