Композиція для підвищення біосумісності імплантатів та клітин для трансплантації з організмом реципієнта та спосіб її приготування

Реферат: Винахід належить до медицини та ветеринарії і може бути використаний при трансплантації клітин, а також імплантації різних речовин і пристроїв органічної і неорганічної природи. Композиція для підвищення біосумісництва імплантатів та клітин для трансплантації з організмом реципієнта містить альбумін сироватки крові реципієнта, а також додатково містить UA 104738 C2 (12) UA 104738 C2 амінокислоти, фосфор і іони магнію, натрію, калію й хлору. Спосіб одержання композиції включає змішування компонентів з наступним центрифугуванням, згідно з яким вміст альбуміну забезпечують введенням сироватки крові реципієнта, що термічно оброблена при температурі 94-95 °С протягом 1-2 хвилин. UA 104738 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Винахід належить до медицини та ветеринарії і може бути використаний при трансплантації клітин, а також імплантації різних речовин і пристроїв органічної і неорганічної природи в організм реципієнта. Відомі речовини, які використовуються для надання біосумісності імплантату з організмом реципієнта шляхом хіміотерапевтичного втручання в імунну систему реципієнта, значною мірою діють на неспецифічній основі. Прикладом таких речовин можуть бути рапаміцин, циклоспорин, антагоністи лімфоцитів та інші препарати, які належать до циклоспоринового ряду [1]. Недоліком у використанні наведених речовин є те, що імуносупресорна терапія спрямована на руйнування власного імунітету реципієнта і може викликати розвиток злоякісних захворювань. Зниження активності імунної системи сприяє збільшенню випадків інфекційних захворювань і прискоренню розвитку атеросклерозу. Частина реципієнтів гине від цих ускладнень, а не від неспроможного трансплантата. Хворі, зокрема з пересадженим серцем, гинуть від ішемічної хвороби серця. Відома композиція, яка використовується для надання біосумісності імплантату з організмом реципієнта, містить попередньо оброблену сироватку крові реципієнта, аденозин трифосфат натрію, дигідрофосфат калію, гідрофосфат натрію, а також білки теплового шоку [2]. Недоліком використання наведеної композиції є те, що завдяки температурній обробці вихідної сироватки при температурі 40-60 °С протягом 20-45 хвилин з наступним розведенням імуноглобуліни, які входять в склад сироватки, все ще можуть бути активними та розпізнавати специфічні детермінанти на поверхні матеріалу. У цьому випадку їх адсорбція на поверхні матиме більшу швидкість за адсорбцію альбуміну сироватки. Завдяки вказаній специфічній адсорбції імуноглобулінів на поверхні матеріалу будуть введені в дію захисні механізми організму проти екзогенного матеріалу. Нагрівання сироватки при температурі 40-60 °С протягом 20-45 хвилин може привести до полімеризації молекул альбуміну, що суттєво може позначитись при обробці імплантата. Найбільш близькою композицією, яка використовується за тим же призначенням, що і заявлена, є композиція, яка містить альбумін сироватки крові, дигідрофосфат натрію або гідрофосфат калію та розчин натрію хлориду при такому співвідношенні компонентів, мас %: альбумін сироватки крові 0,1-6,0 дигідрофосфат натрію 0,10-0,20 хлорид натрію 0,7-1,0 гідрофосфат калію 0,10-0,20 решта вода [3]. Зазначена композиція вибрана як прототип. До причин, що перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату при використанні відомої композиції, належить те, що до її складу входять в певній концентрації активні високомолекулярні білки (понад 100 000 дальтон) сироватки крові. До таких білків належать імуноглобуліни класу G. В організмі вони відповідають за розпізнавання шкідливих речовин. У сироватці крові реципієнта можуть бути специфічні до матеріалу поверхні імуноглобуліни G, які при контакті з поверхнею можуть запускати захисний ланцюг процесу відторгнення імплантата. Крім того нагрівання альбуміну 20-45 хвилин при температурі 40-60 °С може привести до агрегації його молекул. У такому стані альбумін не утворює на поверхні однорідну плівку з незворотно адсорбованого білка і не виконує в повному обсязі захисної ролі. Крім того композиція-прототип збалансована тільки за складом електролітів. Для коректного використання її для обробки імплантата бажано підтримувати відповідну осмолярність з метою також запобігти утворенню агрегатів та, в разі застосування в клітинній терапії, попередити їх набрякання або лізис. Як було показано в експериментах на великій кількості тварин у 10-12 % випадках все ще спостерігається реакція організму на імплантат. Хоча реакція є значно нижчою, ніж у випадках необробленого імплантата. Імуногістохімічний аналіз препаратів у місці встановлення обробленого композицією імплантата показав присутність у тканинах лімфоцитів. Це свідчить про те, що інкубація вихідної сироватки у вказаному інтервалі температур та часу призводить до полімеризації молекул альбуміну внаслідок чого вони втрачають свою властивість утворювати на поверхні імплантата тонку екрануючу плівку. Також це засвідчує, що ні температурний режим інкубації, ні розведення вихідної сироватки не виключає здатності імуноглобулінів класу G адсорбуватися на поверхні імплантата і таким чином запускати реакцію розпізнавання чужорідного тіла організмом реципієнта. Для забезпечення повноцінної дії адаптуючої композиції бажано виділяти альбумін з сироватки крові реципієнта ех tempore перед обробкою імплантата. Але всі існуючі методики фракціювання білків крові значно ускладнюють отримання 1 UA 104738 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 запропонованої композиції та підвищують вірогідність внесення до неї патогенної мікрофлори на стадії приготування. В основу винаходу поставлена задача забезпечити шляхом підбору якісного та кількісного складу композиції знизити реакцію відторгнення імплантата та сприяти відновленню клітин, що були ушкоджені під час хірургічного втручання. Поставлена задача вирішується тим, що композиція для підвищення біосумісності імплантатів та клітин для трансплантації з організмом реципієнта, що містить альбумін сироватки крові реципієнта, а також додатково містить амінокислоти, фосфор і іони магнію, натрію, калію й хлору при наступному співвідношенні компонентів, г: альбумін сироватки крові реципієнта 0,1-9,9 альфа-кетоглутарова кислота 0,01-0,0176 гістидин 1-1,793 гістидину гідрохлориду моногідрат 0,2-2,377 калію гідроксид, калію хлорид 0,05-0,0671 кальцію хлориду дигідрат 0,0001-0,00022 магнію хлориду гексагідрат 0,08-0,08132 манітол 0,5-5,547 натрію хлорид 0,8-8,087 триптофан 0,04-0,0408, води решта до 1 літра, з осмолярністю 280-310 мосм/л. Спосіб приготування композиції для підвищення біосумісності імплантатів та клітин для трансплантації з організмом реципієнта, включає змішування компонентів з наступним центрифугуванням, а перед змішуванням компонентів здійснюють термічну обробку сироватки крові реципієнта при температурі 94-95 °С протягом 1-2 хвилин. Відповідно до заявленого способу приготування зазначеної композиції здійснюють термічну обробку сироватки крові, змішування компонентів з наступним центрифугуванням протягом 2-15 хвилин при 1000-2500 об./хв. При цьому використовують надосадову рідину для приготування композиції для обробки поверхні імплантатів. Винахід, що заявляється, дозволяє здійснити модифікацію поверхні імплантата композицією, що впливає на донорський трансплантат/імплантат органічної або неорганічної природи, після чого останній розглядається організмом як «свій» певними компонентами імунної системи реципієнта. Запропонована композиція підвищує біосумісність імплантатів і сприяє їхньому приживленню в організмі реципієнта. Зазначена композиція модифікує зовнішню і внутрішню поверхню імплантата і захищає клітини донора, гальмує процес відторгнення імплантата за рахунок зменшення можливості нагромадження вільних радикалів, які можуть привести до мутагенних змін у клітинах, підтримує рН, необхідне для здійснення фізіологічних процесів. Композиція забезпечує зупинення рекрутингу лімфоцитів і макрофагів поверхнею імплантатів, які активно беруть участь у процесах запалення і утворення фіброзної тканини навколо імплантата. Композиція, що заявляється, може бути використана при проведенні клітинної терапії, у процесі проведення плазмо-, лімфо- і гемосорбції, а також при імплантації протезів, кавафільтрів, стентів, мікросхем та чипів тощо, і дозволяє запобігти формуванню навколо імплантата контрактурної капсули. Зазначена композиція може бути приготовлена шляхом додавання до альбуміну сироватки крові реципієнта компонентів у попередньо простерилізованому розчині хлориду натрію з концентрацією 0,9 % у воді при кімнатній температурі. Для приготування композиції використовують готовий препарат Кустодіол, що містить альфа-кетоглутарову кислоту 0,176 г, гістидин 27,93 г, гістидин гідрохлорид моногідрат 3,77 г, калію гідроксид, калію хлорид 0,671 г, кальцію хлориду дигідрат 0,0022 г, магнію хлориду гексагідрат 0,8132 г, манітол 5,47 г, натрію хлорид 0,87 г, триптофан 0,408 г, води - решта до 1 літра, з осмолярністю - 310 мосм/л. 2 UA 104738 C2 5 10 15 20 25 Підготовка імплантатів до контакту із тканинами організму реципієнта передбачає їхню обробку протягом 5-10 хвилин композицією, що заявляється, з метою ослаблення реакції тканин реципієнта на екзогенний матеріал при температурі 20-25 °С. Зазначений винахід може бути продемонстровано прикладами конкретного виконання (без способу). Приклад 1 У досліді вивчали вплив запропонованої композиції на біосумісність імплантата з реципієнтом. Оцінку здійснювали шляхом визначення площі фіброзної тканини навколо імплантата на стандартизованих зрізах в умовних одиницях. Зменшення або відсутність фіброзної тканини навколо імплантата свідчило про зменшення подразнення, а також про більшу спорідненість імплантата з організмом реципієнта. Для досліджень використали самців кролів породи «Сірий Велетень» вагою 3,0-3,5 кг у віці 0,5-2,0 року. Їм було імплантовано Z-подібні стенти, виготовлені із дроту неіржавіючої сталі (марки 316 L) діаметром 0,18 мм. 70 тварин оброблені композицією, що заявляється. Обробку імплантатів здійснювали відповідно до способу, що заявляється, ex tempore перед введенням кролям у черевний відділ аорти. Операції виконувалися під внутрішньовенним наркозом розчину гексиналу. Досліджували реакцію стінки аорти кролів на імплантацію стентів після обробки композицією, що заявляється (12 тварин). У контрольній групі перебували кролі, яким уводили імплантати без попередньої обробки композицією (12 тварин) і оброблені композицією, взятою за прототип (12 тварин). Як варіант норми використовували кролів, яким не вводили імплантати (10 тварин). Тварин утримували протягом 8 тижнів після операції у звичайних умовах. Після закінчення експерименту тварин виводили з нього шляхом введення летальної дози гексиналу. Для вивчення гістологічних препаратів судин були проведені гістохімічні аналізи. Препарати забарвлювали гематоксиліном і еозином, і за методикою Ван Гізона. Морфометрія проводилась на мікроскопі фірми «Olympus» при збільшенні X 20, окуляр X 10, по програмі, автоматично. Оцінювали товщину неоінтими на стандартизованих зрізах в умовних одиницях. Отримані результати обробляли за допомогою методів непараметричної статистики. Середні цифрові значення вимірів в 4 групах тварин з вірогідністю р