Спосіб детекції аденозин-5′-трифосфату у водних розчинах

Реферат: Винахід належить до області органічної хімії, біохімії, флуоресцентної спектроскопії та фотоніки органічних молекул, а саме - синтезу та застосування біс-(3-гідроксі-4-оксо-4H-2хроменіл)бензенів (бісфлавонолів) як зондів концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах. Спосіб детекції аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах включає побудову калібрувальної кривої, вимірювання спектрів збудження зонду в розчинах з невідомою концентрацією АТФ, з нанесенням отриманих даних на калібрувальну криву. Новим є те, що зі UA 113471 C2 (12) UA 113471 C2 спектра збудження флуоресценції зонду в розчині АТФ невідомої концентрації отримують числові значення І1/І2 (де I1 - інтенсивність флуоресценції при збудженні на 360-450 нм, І2 - те ж при збудженні на 300-350 нм), отримані дані наносять на калібрувальну криву, побудовану шляхом вимірювання серії спектрів збудження флуоресценції похідного бісфлавонолу у розчинах із заданою концентрацією АТФ (СAТФ), обчислення параметрів І1/І2 та нанесення отриманих даних на графік у координатах І1/І2-СAТФ. Виконання способу детекції аденозин-5'трифосфату у водних розчинах за допомогою бісфлавонолів дозволяє реєструвати його мілімолярні концентрації, отримувати краще розділення смуг збудження флуоресценції зонда та його комплексу з АТФ та збільшити яскравість флуоресценції зонда. UA 113471 C2 Винахід належить до області органічної хімії, флуоресцентної спектроскопії та фотоніки органічних молекул, а саме - до синтезу та застосування як зонда концентрації аденозин-5'трифосфату (АТФ) бісфлавонолів загальної формули (1): O H O R1 O R2 O R1 O H O 5 10 15 20 25 30 35 R2 , (І) де R1, R2=H, C1-C6алкіл або C1-C6алкоксигрупа. Дані сполуки можуть бути використані як флуоресцентні зонди для визначення концентрації АТФ у водних розчинах за значень рН>6,5. АТФ є універсальним джерелом енергії та медіатором у багатьох біохімічних процесах. Флуоресцентні зонди широко використовуються для визначення концентрації аналітів у розчинах. Найбільш популярними є індикатори протонів (рН) та численних катіонів металів 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ + + (Са , Mg , Zn , Cd , Hg , Na , K тощо). В останній час ведуться інтенсивні розробки флуоресцентних індикаторів аніонів та складних органічних молекул, серед яких зонди АТФ займають чільне місце. Відомий спосіб визначення концентрації АТФ у розчині за допомогою ферменту люциферази у присутності молекулярного кисню (Leach F.R., J. Appl Biochem., 1981, 3, - С. 473478). Даний спосіб є незручним, тому що вимагає створення спеціальних умов для проведення аналізу. Зокрема, він не працює в анаеробних умовах, при низьких концентраціях кисню в 2+ системі, або ж за відсутності ферменту люциферази чи катіонів Mg . Відомий спосіб визначення АТФ за допомогою мічення люциферазою (US005837465A від 17.11.1998 p.). Варто зазначити, що такі способи є доволі складними і обмеженими у застосуванні, адже вони ідентифікують АТФ у комплексі з магнієм, за присутності ферменту люциферази та кисню. У US007422868B2 від 9.09.2008 р. та US007732128B2 від 8.06.2010 р. люциферазний метод було застосовано на клітинах. За найближчий аналог прийнято спосіб флуориметричного визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах за допомогою 4'-диметиламіно-3-гідроксифлавону (Ф) (UA75448 від 17.04.2006 p.). Відомо, що флавоноли (3-гідроксифлавони) є сполуками, параметри флуоресценції яких залежать від фізико-хімічних параметрів середовища, таких як діелектрична проникненість середовища, рН, донорність водневих зв'язків, в'язкість, іонна сила тощо. Характерною особливістю спектрів флуоресценції цих сполук є дві смуги випромінення в розчинах, що спричиняються ефектом внутрішньомолекулярного фотоперенесення протона (ВФП або ESIPT-ефект). У статтях Pivovarenko V.G., Vadzyuk O.B., Kosterin S.O., J. Fluorescence (2006) V. 16, P. 9-15 та Yushchenko D.A. і співавт, Analytical Biochemistry (2007) V. 369 P. 218-225 спосіб (UA75448 від 17.04.2006 p.) було успішно випробувано на водній суспензії мітохондрій. Недоліками даного способу є звужені межі детекції АТФ, мале співвідношення сигнал/шум, низька яскравість флуоресценції зонду та його комплексу з АТФ. CH3 N CH3 O O O H (Ф) 1 UA 113471 C2 5 10 15 20 В основу винаходу поставлена задача створити такий спосіб детекції аденозин-5'трифосфату у водних розчинах, в якому б за рахунок використання нових зондів для АТФ досягалася можливість розширення його меж детекції. Поставлена задача вирішена тим, що спосіб детекції аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах включає побудову калібрувальної кривої, вимірювання спектрів збудження зонду у розчинах з невідомою концентрацією АТФ та подальшим нанесенням отриманих даних на калібрувальну криву. В представленому методі, згідно з винаходом, зі спектра збудження флуоресценції зонду в розчині АТФ невідомої концентрації отримують числові значення І 1/І2 (де I1 - інтенсивність флуоресценції при збудженні на 360-450 нм, І2 те ж при збудженні на 300-350 нм), отримані дані наносять на калібрувальну криву, побудовану шляхом вимірювання серії спектрів збудження флуоресценції похідного бісфлавонолу (1) у розчинах із заданою концентрацією АТФ (СAТФ), обчислення параметрів I1/І2 та нанесення отриманих даних на графік у координатах І1/І2 - САТФ. Бісфлавоноли формули (1) у порівнянні з флавонолом (Ф) мають цілий ряд переваг у детекції АТФ. Так, при R1=H, R2=OCH3 бісфлавонол має вищу яскравість флуоресценції (у 3 рази - для вільного зонду та його комплексу з АТФ, Фіг. 1) та вдвічі краще розділення смуг -1 -1 збудження флуоресценції вільного зонду та його комплексу з АТФ (5500 см , замість 2800 см для флавонолу (Ф), Фіг. 1). Обидві риси покращують детекцію, збільшуючи співвідношення сигнал/шум. Бісфлавоноли мають значно вищу чутливість до АТФ і ширші межі детекції АТФ у -6 розчинах: для флавонолу (Ф) вони складають 100-3300·10 М концентрації АТФ, тоді як для -6 бісфлавонолу (R1=CH3, R2=H) межі детекції складають 7-10000·10 М АТФ. а для бісфлавонолу -6 (R1=H, R2=OCH3) - 13-3500·10 М АТФ Таблиця 1, (Фіг. 2). Таблиця 1 Межі чутливості бісфлавонолів та флавонолу (Ф) до АТФ у водних розчинах за інтенсометричним та ратіометричним методами вимірювань Назва 2,2'-(1,4-фенілен)біс(3-гідрокси-6-метил-4Н-хромен4-он), (формула 1, R1=CH3, R2=H) 2,2'-(1,4-фенілен)біс(3-гідрокси-7-метокси-4Нхромен-4-он) (формула 1, R1=H, R2=OCH3) 2,2'-(1,4-фенілен)біс(3-гідрокси-4Н-хромен-4-он) (формула 1, R1=R2=H, ) Флавонол (Ф) DR(I), μМ * DR(R), μМ 7-10000 2-1000 13-3500 3-800 15-3400 6-1300 100-3300 56-1800 * DR(I) - Межі вимірювань концентрації АТФ інтенсометричним методом. DR(R) - Межі вимірювання концентрації АТФ ратіометричним методом. 25 30 35 40 Як і у випадку флавонолу (Ф), визначення АТФ тут можливе двома методами: інтенсометричним і ратіометричним, з реєстрацією інтенсивності флуоресценції при збудженні на двох довжинах хвиль опромінення. Отже, бісфлавоноли мають у 7-14 разів кращу чутливість до АТФ і цим розширюють межу реєстрації мінімальної концентрації АТФ від 100 до 7 мікромолів на літр, при кращому співвідношенні сигнал/шум. Отже, застосування способу детекції аденозин-5'-трифосфату у водних розчинах за допомогою бісфлавонолів дозволяє реєструвати його мікромолярні концентрації, отримувати краще розділення смуг збудження флуоресценції зонда та його комплексу з АТФ та збільшити яскравість флуоресценції зонда. Винахід пояснюється графіками, на яких: Фіг. 1 - Спектри збудження флуоресценції бісфлавонолу (формула 1, R1=H, R2=OCH3) та флавонолу (Ф) у водному буфері рН=7.2 за відсутності АТФ та при концентрації АТФ, рівній 3 -6 мМ. Концентрація зонда: 2·10 М у кожному разі. Довжина хвилі флуоресценції λf1=470 та 550 нм відповідно. Фіг. 2 - Залежність співвідношення інтенсивностей флуоресценції І AТФ/І0 комплексу зонда з АТФ (ІAТФ) та вільного зонда (І0) для бісфлавонолу (формула 1, R1=H, R2=OCH3) та флавонолу Ф -6 у буфері рН=7.2 від концентрації АТФ. Концентрація зонда: 2·10 М у кожному разі. Фіг. 3 - Спектри збудження флуоресценції бісфлавонолу (формула 1, R1=H, R2=OCH3) у -6 водному буфері рН=7.2 при різних концентрація АТФ. Концентрація бісфлавонолу: 2·10 М. Довжина хвилі флуоресценції λf1=470 нм. 2 UA 113471 C2 5 10 15 20 Наступні приклади демонструють способи отримання бісфлавонолів та способи їх застосування для детекції АТФ. Приклад 1. Синтез (Е)-1-(2-гідроксифеніл)-3-4-[(Е)-3-(2-гідроксифеніл)-3-оксо-1пропеніл]феніл-2-пропен-1-ону (біс-халкон до Прикладу 2). Терефталевий альдегід і 2-гідрокси-4-метоксіацетофенон беруть у мольному співвідношенні 1:2 і розчиняють у ДМФА, виходячи із розрахунку 1 ммоль альдегіду на 2 мл ДМФА. Після максимально можливого розчинення реагентів, у суміш додають метилат натрію у кількості 5 ммоль на 1 ммоль альдегіду. Реакція проходить за 1,5-2 години при температурі, трохи нижчій температури кипіння ДМФА. Продукт після нейтралізації перекристалізовують з суміші етанолДМФА. Приклад 2. Синтез біс-(3-гідрокси-4-оксо-4Н-7-метокси-2-хроменіл)бензену (формула 1, R1=H, R2=OCH3). У суміші ДМФА-етанол у об'ємному співвідношенні 1:4 розчиняють біс-халкон у присутності 5-кратного мольного надлишку етилату натрію. Перекис водню (30 %) додається повільно протягом усього часу проходження реакції, але загальна його кількість не повинна перевищувати 2-кратний мольний надлишок відносно потрібної для реакції кількості. Проходження реакції контролюють хроматографічно, і зупиняють реакцію негайно після того, як у суміші зникає вихідний біс-халкон. Суміш виливають у воду та нейтралізують так, щоб значення рН після нейтралізації було біля 5. Перекристалізацію продукту проводять у суміші трифлуороцтової кислоти з хлороформом. Вихід 34 %. Чистота зразка: >95 %. Ттопл>350 °C. 1 Спектр ЯМР Н (400 МГц, ТМС - внутрішній стандарт, м.ч., розчинник: трифлуороцтова кислота): 8.33 (d, J=8, 2Н); 8.25 (м, 4Н); 7.33 (d, J=8, 2Н); 7.29 (s, 2H); 4.10 (s, 6H). O R2 O OH R1 HO + R1 R2 O O R1 OH R2 O O O HO R2 HO R1 O R1 R1 OH OH O O O O HO HO O CH O 3 O H3CO OCH3 O OH OH O O 2,2'-(1,4-фенілен)біс(3-гідрокси-6-метил-4Нхромен-4-он) 25 R1 O R2 R2 H3 C R2 2,2'-(1,4-фенілен)біс(3-гідрокси-7-метокси-4Нхромен-4-он) Приклад 3. Побудова калібрувальної кривої залежності співвідношення інтенсивності флуоресценції бісфлавонолу при збудженні на двох довжинах хвиль від концентрації АТФ у розчині. 3 UA 113471 C2 5 10 15 20 25 30 Усі спектри флуоресценції були зняті на спектрофлуориметрі " FluoroMax3" (Jobin Yvon) за температури 25 °C, з наступною цифровою обробкою результатів за допомогою програми Origin v 8.0. Усі спектри збудження флуоресценції були отримані при довжині хвилі флуоресценції λf1=470 нм. Калібрувальна крива будується шляхом реєстрації серії спектрів збудження флуоресценції бісфлавонолу у водних розчинах з відомою концентрацією АТФ (С AТФ) та наступним вимірюванням співвідношення інтенсивностей флуоресценції I1/І2 (де I1 інтенсивність флуоресценції при збудженні на 360-450 нм, І2 інтенсивність флуоресценції при збудженні на 300-350 нм), з наступним нанесенням отриманих пар даних на графік у координатах І 1/І2 – СAТФ. Калібрувальна крива, отримана за методикою, що описана в прикладі 3, зображена на Фіг. 2. -2 Для побудови калібрувальної кривої використовували водний розчин (1), що містить 1·10 -6 моль/л буферу Tris pH 7.2, та 5·10 моль/л бісфлавонолу (формула 1, R1=H, R2=OCH3), а також -2 -6 водний розчин (2), що містить 1·10 моль/л буферу Tris pH 7.2, 5·10 моль/л бісфлавонолу та -2 4·10 моль/л АТФ. Задану концентрацію АТФ у аналітичному розчині (3) отримували шляхом додавання до 1.5 мл розчину (1) розрахованої кількості розчину (2). Після цього розчин (3) переносили у флуориметричну кювету з метою подальшого отримання спектру збудження флуоресценції (Фіг. 3). Реєстрацію флуоресценції здійснювали на довжині хвилі 470 нм. Отримані числові дані співвідношення інтенсивностей флуоресценції при збудженні на 415 та 350 нм (I415/I350) від концентрації АТФ (САТФ) у розчині наносили на графік, який зображено на Фіг. 2. Приклад 4. Реєстрація спектру збудження флуоресценції розчину похідного бісфлавонолу загальної формули (І), при невідомій концентрації АТФ. Отримання зі спектра числових значень співвідношення інтенсивностей флуоресценції бісфлавонолу при збудженні на двох довжинах хвиль. Визначення за допомогою калібрувальної кривої вмісту АТФ у досліджуваних розчинах. Використовуючи розчини (1) та (2) (див. Приклад 3), приготували розчини А1, А2, A3, А4, та А5 з концентрацією АТФ 0.0000016 (С1), 0.000025 (С2), 0.00005 (С3), 0.00015 (С4) та 0.0003 моль/л (С5). Далі вимірювали спектри збудження флуоресценції при довжині хвилі емісії 470 нм. З отриманих спектрів обчислили співвідношення інтенсивностей емісії I415/I350 для розчинів А1 А5. На основі цих даних, використовуючи калібрувальну криву (Фіг. 2) визначили концентрацію АТФ (Х1 × 5) у розчинах (Таблиця 2). Таблиця 2 Номер розчину А1 А2 A3 А4 А5 Задана концентрація АТФ, Визначена концентрація Відношення I415/I350 моль/л АТФ, моль/л -6 -6 1.6·10 0.51 1.7·10 (Х1) -5 -5 2.5·10 0.89 2.62·10 (Х2) -5 -5 5.0·10 1.17 5.16·10 (Х3) -4 -4 1.5·10 1.77 1.48·10 (Х4) -4 -4 3.0·10 2.18 2.90·10 (Х5) ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 Спосіб детекції аденозин-5'-трифосфату (АТФ) у водних розчинах, який включає побудову калібрувальної кривої, вимірювання спектрів збудження зонду у розчинах з невідомою концентрацією АТФ, з подальшим нанесенням отриманих даних на калібрувальну криву, який відрізняється тим, що зі спектра збудження флуоресценції зонда в розчині АТФ невідомої концентрації отримують числові значення І1/I2 (де I1 - інтенсивність флуоресценції при збудженні на 360-450 нм, І2 - те ж при збудженні на 300-350 нм), отримані дані наносять на калібрувальну криву, побудовану шляхом вимірювання серії спектрів збудження флуоресценції похідного бісфлавонолу загальної формули (1): 4 UA 113471 C2 H O O R1 O R2 O R1 O O 5 R2 H , (1) де R1, R2=H, C1-C6алкіл або C1-C6алкоксигрупа, у розчинах із заданою концентрацією АТФ (СAТФ), обчислення параметрів І1/I2 та нанесення отриманих даних на графік у координатах І1/I2-САTФ. 5 UA 113471 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6