Фармацевтична композиція з антипухлинною активністю

1. Фармацевтическая композиция с антиопухолевой активностью, содержащая 8-карбамоил-3-метилимидазо[5,1-d]-1,2,3,5-тетразин-4-(ЗН)-он и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит ингибитор О6-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы в соотношении от 1 : 1 до 1 : 20.000. 2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что ингибитор выбран из группы, включающей О6-алкилгуанины, О6-алкенилгуанины, О6-арилгуанины и О6-бензилированные гуанины, гуанозины и 2'-деоксигуанозины. 3. Фармацевтическая композиция по п. 2, отличающаяся тем, что ингибитор представляет собой О6-бензилгуанин. Ю (13) 29466 (11) UA путем использования ингибиторов АТазы, например, О6-бензилгуанина (далее: БГ), можно повысить токсичность темозоломида, например, в клеточной линии MAWI, до 300-кратной величины, если его используют в нижеуказанных дозах согласно настоящему изобретению, что позволяет использовать темозоломид для хемотерапии видов рака в человеке, которые до сих пор не были чувствительными в отношении такой терапии или лишь в незначительной степени. В ряде опухолевых клеточных линий человека токсичность темозоломида после воздействия в течение одного часа взаимосвязана с их содержанием АТазы. Таким образом, метилирование темозоломидом положения О6 гуанина в ДНК приводит к цитотоксичному повреждению. Чувствительность раковых клеток человека к темозоломиду можно определять путём исследования их относительного производства АТазы. При этом клетка, производящая большое количество АТазы, является менее чувствительной к темозоломиду, чем клетка, производящая минимальное количество АТазы. Путём предварительной обработки клеток одной дозой БГ можно достичь небольшого повышения (менее чем в 4 раза) токсичности темозоломида. В опытах на колониях выявилось, что человеческие фибробласты, трансфецированные к ДНК АТазы, после предварительной обработки с (19) Изобретение относится к области обработки раковых клеток человека с использованием производного тетразинона, в частности к фармацевтической композиции с антиопухолевой активностью. Известно применять темозоломид, представляющий собой 8-карбамоил-З-метилимидазо[5,1-d]-1,2,3,5-тетразин-4-(ЗН)-он, в качестве антиопухолевого активного вещества (см. Newlands и др., J. Cancer, 65, стр. 287, 1992 г.). Задача изобретения заключается в повышении антиопухолевой активности темозоломида. Указанная задача решается предлагаемой фармацевтической композицией с антиопухолевой активностью, содержащей темозоломид и дополнительно ингибитор О6-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы в отношении от 1 : 1 до 1 : 20 000, а также, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель. Предлагаемую композицию получают путем смешивания темозоломида и указанного ингибитора в указанном соотношении по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем. Согласно изобретению токсичность темозоломида можно значительно повысить путем его использования в сочетании с усилителем, представляющим собой ингибитор О6-алкилгуанин-ДНКалкилтрансферазы (далее: АТаза). В частности, C2 ______________________________ 29466 использованием БГ являются более устойчивыми к воздействию темозоломида, чем контрольные трансфецированные фибробласты, несмотря на удаление АТазы. Невероятно, что причина этого заключается в разном транспорте темозоломида. Данное явление может быть признаком ресинтеза АТазы рhАТ-фибробластами для снижения действия предварительной обработки ингибитором. Однако в клеточной линии MAWI неожиданно наблюдалась значительная потенциация токсичности темозоломида (примерно до 300-кратной величины) путём обработки с использованием БГ в течение пяти дней. Подобная степень повышения наблюдалась в клетках MCF-7, которые также содержат большое количество АТазы, но лишь небольшое действие показали клетки U373, содержащие небольшое количество АТазы. На основе исследований клеточных линий MAWI и MCF-7 можно полагать, что при длительном наличии ингибитора АТазы в растущей степени повреждается ДНК. Дачу ингибитора АТазы предпочтительно повторяют в течение нескольких или многих дней, и предпочтительно её осуществляют перед дачей темозоломида. Дозы можно дать в течение 1, 2, 3, 4 или 5 дней, причём предпочтительно терапию осуществляют в течение 4 или 5 дней. Кроме того, предпочтительно темозоломид дают пациенту повторно в течение нескольких дней, и перед дачей каждой дозы темозоломида дают ингибирующее АТазу количество ингибитора АТазы, чем достигается выраженное повышение токсичности темозоломида в отношении раковых клеток человека, например, примерно в 300 раз в случае клеточной линии MAWI. Согласно дальнейшему предпочительному варианту изобретения ингибитор АТазы дают в количестве, достаточном для сенсибилизации опухоли и живом организме, не вызывая нежелаемой сенсибилизации здоровой ткани, когда ингибитор АТазы используют вместе с темозоломидом. Количество ингибитора АТазы, даваемое в рамках настоящего изобретения, колеблется в зависимости от эффективного количества, требуемого для обработки опухолевых клеток. Пригодной дозой является доза, приводящая к концентрации ингибитора АТазы в обрабатываемых опухолевых клетках, вызывающей исчезновение активности АТазы, при этом доза может составлять, например, примерно 1 - 2000 мг на кг веса тела, предпочтительно примерно 10 - 800 мг на кг веса тела, если ингибитор дают перед хемотерапией. В качестве опухолей, для обработки которых темозоломид особенно пригоден, можно назвать карциномы, меланомы, саркомы, лимфомы и лейкозы, в частности, астроцитомы, глиомы, злокачественные меланомы, фунгоидную гранулёму, саркому Юингс, хронический лимфоцитный лейкоз, а также опухоли в лёгких и в груди. Особенно сильное повышение активности темозоломида путём использования ингибитора АТазы наблюдают в опухолевых клетках в груди, в клетках астроцитом, и в опухолях в толстой и прямой кишках. Обычно доза темозоломида составляет 0,1 200, предпочтительно 1 - 20 мг на кг веса тела в день, или, в отношении поверхности тела, пример но 40 - 400, предпочтительно примерно 150 - 300 мг на м2 в день. Степень потенциации ингибитором АТазы зависит от количества АТазы, обычно имеющегося в раковых клетках конкретного типа. Активность темозоломида в отношении раковых клеток, содержащих большее количество АТазы, потенцируется сильнее путём предварительной дачи ингибитора АТазы, чем в отношении клеток, содержащих меньшее количество АТазы. В рамках настоящего изобретения пригодны ингибиторы АТазы, которые обладают такой активностью, например, О6-алкилгуанины как, например, О6-метилгуанин, алкенилгуанины как, например, О6-аллилгуанин, О6-арилгуанины как, например, О6-бензилгуанин, и О6-бензилированные гуанин, гуанозин и 2'-дeoкcигyaнoзин. Для использования в рамках настоящего изобретения в частности пригоден О6-бензилгуанин. В конкретном случае доза ингибитора АТазы зависит от количества АТазы, обычно имеющегося в подлежащих обработке раковых клетках, возраста и состояния пациента и используемого ингибитора АТазы. Темозоломид особенно предпочительно дают в виде повторных доз в последовательных днях, причём эффекта сильной потенциации согласно изобретению достигают при предпочтительном режиме, согласно которому ингибирующую АТазу дозу ингибитора АТазы дают перед дачей каждой дозы темозоломида, или одновременно с ней. Предпочтительно в качестве ингибитора АТазы используют О6-бензилгуанин, который дают вместе с темозоломидом, причём последний дают в количестве 150 - 300 мг/м2 в день в четырёх или пяти дозах в течение четырёх или пяти дней (общая доза - 750 - 1500 мг/м2). Предпочтительно каждую дозу ингибитора АТазы дают 2-8 часов перед дачей очередной дозы темозоломида, чем достигают наиболее сильной потенциации токсичности темозоломида, что приводит к наиболее эффективной обработке опухоли пациента. Особенно предпочтительно такую обработку повторяют по истечении примерно четырёх недель. Альтернативный режим дачи темозоломида вместе с О6-бензилгуанином представляет собой непрерывный режим, причём оба активных вещества дают ежедневно в течение четырёх или больше дней. Такую комбинированную терапию можно продлить непрерывно по мере необходимости, до уменьшения опухоли. Кроме того, путём исследований производства АТазы в конкретной раковой клетке можно определять потенциацию токсичности темозоломида в данной клетке. Согласно предпочтительному варианту изобретения содержание АТазы в определённой клеточной линии определяют, например, путём метода, описанного Lee и др. (Cancer Res., 51, стр. 619, 1991 г.), и исследуют возможную чувствительность к темозоломиду. На основе такого исследования затем можно найти пригодное соотношение темозоломида и ингибитора АТазы, которое дают в рамках соответствующего режима. Предлагаемая фармацевтическая композиция может иметься в виде обычного жидкого или 2 29466 твёрдого препарата, который содержит по меньшей мере один инертный фармацевтически приемлемый носитель. В качестве твёрдых препаратов можно назвать, например, порошки, таблетки, поддающиеся диспергированию грануляты, капсулы, в том числе крахмальные капсулы, и суппозитории. Порошки и таблетки могут содержать примерно 5 - 70 % активного вещества. Пригодные твёрдые носители известны. В качестве таких носителей можно назвать, например, карбонат и стеарат магния, тальк, сахар и лактозу. Таблетки, порошки, крахмальные и прочие капсулы могут содержать по одной дозе активного вещества, и они пригодны для оральной дачи. Для получения суппозиториев сперва расплавляют воск с низкой точкой плавления, например, смесь глицеридов жирных кислот или какаовое масло, а затем в нём гомогенно диспергируют активное вещество путём размешивания. Расплавленную гомогенную смесь разливают в формы обычного размера, дают охлаждаться, причём препарат застывает. В качестве жидких препаратов можно назвать, например, растворы, суспензии и эмульсии как, например, растворы в воде или смеси воды и пропиленгликоля, пригодные для парентеральной инъекции. Также пригодны твёрдые препараты, предназначенные для перевода в жидкий препарат непосредственно перед дачей, в частности, оральной или парентеральной дачей. Твёрдые препараты можно переводить в растворы, суспензии или эмульсии. Предлагаемые соединения можно также дать трансдермально, причём в качестве препаратов, пригодных для трансдермальной дачи, можно назвать кремы, лосьоны, аэрозоли и эмульсии, которые также можно использовать в известных стандартных трансдермальных пластырях или трансдермальных пластырях продлённого действия. Предпочтительно фармацевтическая композиция имеется в виде дозировочных единиц. Каждая дозировочная единица включает отдельные дозы препарата, содержащие пригодное количество активного вещества, например, эффективное количество, обеспечивающее достижение желаемого эффекта. Количество активного вещества в отдельной дозе может составлять примерно 0,1 - 1000 мг, предпочтительно примерно 1 - 500 мг в зависимости от конкретного случая применения. Конкретную применяемую дозу можно варьировать в зависимости от пациента и серьёзности его состояния. Специалист в состоянии определять пригодную дозу в конкретном случае. При желании общую суточную дозу можно дать в виде нескольких отдельных доз. Темозоломид можно дать путём известных методов, описанных, например, Wassermann и др. (Cancer, 36, стр. 1258-1268, 1975г.). В случаях, где подходит оральная дача, предпочитают оральную дачу в количестве 40 - 400 мг/м2 в сутки, в частности 150 - 300 мг/м2, в 1 - 5 дозах, в частности, 45 дозах, предпочтительно в течение 4-5 последовательных дней. Для непрерывной терапии пригодна внутривенная дача 25 - 250 мг/м2 в сутки. Оральная дача пригодна в рамках схемы повторной дачи. Как уже указывалось, ингибитор АТазы можно дать или отдельно перед темозоломидом, или же одновременно с ним. В тех случаях, где желательна одновременная дача, ингибитор АТазы и темозоломид могут применяться в объединённом виде для облегчения дачи. При этом пригодны вышеприведённые препараты, причём предпочитают препараты, предназначенные для оральной или внутривенной дачи. Темозоломид и ингибитор АТазы можно включать в один набор, в котором темозоломид и ингибитор АТазы имеются в виде отдельных препаратов для дачи определённым путём, при этом приложены указания по применению содержащихся в наборе препаратов. Например, набор с препаратами, предназначенными для оральной дачи, содержит пригодный для оральной дачи препарат темозоломида, и, отдельно, пригодный для оральной дачи препарат ингибитора АТазы. Врач будет в состоянии варьировать размер дозы в рамках хемотерапии на конкретном пациенте. В нижеследующих примерах приведены несколько из возможных препаратов предлагаемой фармацевтической композиции, которые можно дать или отдельно, или одновременно. Пример 1 Предназначенный для оральной дачи препарат мг на капсулу Темозоломид 100 Лактоза 213 Микрокристаллическая целлюлоза 30 Лаурилсульфат натрия 20 Кукурузный крахмал 25 Стеарат магния 2 Размешивают темозоломид, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, лаурилсульфат натрия и кукурузный крахмал, полученную смесь пропускают через сито No 80, добавляют стеарат магния, повторно размешивают и подают в составные желатиновые капсулы пригодного размера. Пример 2 Предназначенный для оральной дачи препарат мг на капсулу О6-бензилгуанин 100 Лактоза 213 Микрокристаллическая целлюлоза 30 Лаурилсульфат натрия 20 Кукурузный крахмал 25 Стеарат магния 2 Размешивают О6-бензилгуанин, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, лауриловый сульфат натрия и кукурузный крахмал, полученную смесь пропускают через сито No 80, добавляют стеарат магния, повторно размешивают и подают в составные желатиновые капсулы пригодного размера. Пример 3 Предназначенный для оральной дачи препарат 3 29466 мг на капсулу Темозоломид 100 О6-бензилгуанин 100 Лактоза 213 Микрокристаллическая целлюлоза 30 Лаурилсульфат натрия 20 Кукурузный крахмал 25 Стеарат магния 2 Размешивают темозоломид, О6-бензилгуанин, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, лаурилсульфат натрия и кукурузный крахмал, полученную смесь пропускают через сито No 80, добавляют стеарат магния, повторно размешивают и подают в составные желатиновые капсулы пригодного размера. Пример 4 Предназначенный для внутривенной дачи препарат мг на мл Темозоломид 100 Бисульфит натрия 3,2 Динатриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты 0,1 Вода для инъекции до 1 мл Пример 5 Предназначенный для внутривенной дачи препарат мг на мл Темозоломид 100 О6-бензилгуанин 100 Бисульфит натрия 3,2 Динатриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты 0,1 Вода для инъекции до 1 мл Положительный эффект иллюстрируется нижеследующим примером. Пример 6 Материал и метод Используют культурную среду, продаваемую фирмой ICN Biochemicals Ltd. (г. High Wycombe, Объединённое Королевство), и фетальную телячью сыворотку фирмы Gibco Ltd. (г. Paisley, Объединённое Королевство). О6-бензилгуанин (БГ) поставил др. R. С. Moschel (NCIFrederick Cancer Research & Development Center, г. Frederick, Мэрилэнд, США). Темозоломид производили May and Baker Ltd. (г. Dagenham, Объединённое Королевство), и его хранили в качестве раствора в диметилсульфоксиде при температуре -70оС. Все остальные химические вещества произведены фирмой Sigma Chemical Co. Ltd. (г. Poole, Объединённое Королевство). Исследования по цитотоксичности Клеточные линии выращивали обычным методом в качестве монослоёв в буферной среде ДМЕМ,содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки, 25 ммоль HEPES, глутамин и пенициллин/стрептомицин. Цитотоксичность исследовали в свободной от HEPES среде в атмосфере 5 % двуокиси углерода. В 96 плитки, снабжённые углублениями, подали по 750 - 1000 клеток на углубление, инкубировали в течение ночи, в течение двух часов обрабатывали с 33 мкмоль БГ или без него. Затем в течение часа в той же среде добави ли темозоломид, причём конечная концентрация диметилсульфоксида не превышала 1 %. Клетки выращивали в течение 7 дальнейших дней в свежей среде, после чего содержание протеина определяли с помощью анализа согласно Skehan и др. (J. Natl. Cancer Inst., 82, стр. 1107, 1990 г.). Исследования роста выявили, что во время опыта клетки находились в фазе логарифмического роста. В рамках схемы повторной дачи темозоломида клетки обрабатывали последовательно в течение 24 часов в день, каждый день используя свежую среду. Опыты осуществляли по меньшей мере по два раза. В минимальной поддерживающей среде выращивали трансфецированные кДНК АТазы клетки человека соответственно контрольные клетки ХР (клетки xeroderma pigmentosa) [см. Fan и др., Nucleic Acid Res., 18, стр. 5723, 1990 г.], и в углубления плиток подали по 1000 клеткам. Инкубировали в течение трёх часов, затем добавляли темозоломид, свежерастворённый в минимальной поддерживающей среде, и плитки инкубировали в течение пяти дней. Клетки, которые переживали, исследовали путём опыта по Morten и др. (Carcinogenesis, 13, стр. 483, 1992 г.). В опытах с использованием БГ трижды подали по 300 клеток в углубления плиток, и оставили связываться в течение пяти часов. Затем три часа перед обработкой темозоломидом, свежеразбавленным в минимальной поддерживающей среде, содержащей 10 мкмоль БТ, добавили БГ (10 мкмоль в минимальной поддерживающей среде). По истечении семи дней колонии анализировали известными приёмами и подвергали считыванию. Опыт с использованием О6 -алкилгуанинДНК-трансферазы Данный опыт осуществляли согласно методу, описанному Lee и др. (Cancer Res., 51, стр. 619,1991 г.). При этом разные количества клеточных экстрактов при температуре 37°С в течение 2 часов инкубировали вместе с ДНК, содержащей О6 - метилгуанин, маркированный [3Н] в метильной группе, в 300 мкл буфера 1, содержащего 1 мг на мл бычьего сывороточного альбумина. После инкубации последовательно быстро добавляли бычий сывороточный альбумин (100 мкл раствора 10 мг на мл буфера 1) и надхлорную кислоту (100 мкл 4м. раствора). Добавляют ещё 2 мл 1м. надхлорной кислоты, и полученную смесь нагревают при температуре 75°С в течение 40 минут для превращения ДНК в растворимый в кислоте материал. Протеин, содержащий метилированную АТазу, затем собирают путём центрифугирования и промывают 4 мл 1м. надхлорной кислоты, после чего повторно суспендируют в 300 мкл 0,01м. гидроокиси натрия, растворяют в 3 мл водной сцинтиляционной среды (марки Ecosint Aфирмы National Diagnostics) и подвергают считыванию. Содержание протеина в клетках определяли с помощью набора BioRad с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина. Активность АТазы выражали в фмоль переведённого в протеин метила на мг общего содержания протеина в экстракте. Поглощение клетками маркированного [14С] темозоломида 8-карбамоил-3-[14С]метилимидазо [5,1-d]-1,2,3,5-тетразин-4-(3Н)-он (специфическая 4 29466 активность 26,3 мкюри/ммоль) было поставлено др. John Slack (Aston Molecules Ltd., г. Birmingham, Объединённое Королевство). Клеточные суспензии, содержащие клетки в концентрации 5 х 106 на мл, уравновешивали при температуре 4°С и обрабатывали с использованием 200 мкмоль маркированного лекарства. 106 клеток пипеткой подали в пробирки Эппендорфа и центрифугировали вместе с 250 мкл смеси силиконовых масел в соотношении 4 : 1 (торговый продукт "Three- in-One" фирмы Dow Corning). Водный слой аэрировали, и масляный слой осто рожно промывали с использованием 300 мкл соляного раствора. После центрифугирования аэрировали оба слоя, содержащий клетки остаток растворяли в пригодном солюбилизаторе, например, торговом продукте Protosol, представляющем собой гидроокись четвертичного аммония в толуоле, и подают в сцинтилляционные пробирки, содержащие Optiphase, представляющий собой 95 - 99 %-ный диизопропилнафталин. Результаты опытов по определению цитотоксичности Результаты приведены ниже в таблице 1. Таблица 1 Цитотоксичность отдельной дозы Темозоломид Клеточная линия Грудь ZR-75-1 MCF-7 Астроцитома U87MG U373 Толстая кишка/ прямая кишка LS174T LOVO MAWI ХР линии pZip phAT KT50 [-БГ] мкмоль АТаза КТ50 [+БГ] мкмоль Соотношение (фмоль на мг протеина) 32 325 23 171 1,4 1,9