Спосіб одержання rdspa a1
Номер патенту: 62925
Опубліковано: 15.01.2004
Автори: Тан Мей П., Саундерс Керол, Пангор Ерно, МакКаман Майкл
Формула / Реферат
1. Способ очистки рекомбинантного активатора плазминогена слюны Desmodus rotundus (rDSPA α1) из биологической среды, включающий:
(a) нанесение среды на катионообменную смолу при рН от 4 до 7;
(b) промывание катионообменной смолы для удаления не принадлежащих к rDSPA α1 белков и небелковых загрязняющих примесей;
(c) селективную элюцию связанного rDSPA α1 с катионообменной смолы;
(d) нанесение элюента со стадии (с), содержащего rDSPA α1, на гидрофобно-взаимодействующую смолу при рН от 3 до 5;
(e) промывание гидрофобно-взаимодействующей смолы для удаления не принадлежащего к rDSPA α1 белка и небелковых загрязняющих примесей;
(f) селективную элюцию связанного rDSPA α1 с гидрофобно-взаимодействующей смолы;
(g) нанесение элюента со стадии (f), содержащего rDSPA α1, на смолу для аффинной хроматографии при низком рН и низкой ионной силе;
(h) промывание смолы для аффинной хроматографии для удаления не принадлежащего к rDSPA α1 белка и небелковых загрязняющих примесей;
(і) селективную элюцию связанного rDSPA α1 со смолы для аффинной хроматографии с получением чистого rDSPA α1 в водном растворе.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологическая среда представляет собой кондиционированную среду.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что катионообменная смола на стадии (а) включает частицы силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитые полимеры полиметакрилата, дериватизированные карбоксильными или карбоксиалкильными группами.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что катионообменная смола включает матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанных с полиэтилениминсиланом, в котором аминогруппы полиэтилениминсилана дериватизированы карбоксильными группами.
5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (а) включают нанесение среды при рН от 4 до 7.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что элюцию rDSPA α1 на стадии (с) выполняют с использованием буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия и от 100 мМ до 500 мМ NaCl, или буфера эквивалентной ионной силы.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смола для гидрофобного взаимодействия на стадии (d) представляет собой незаряженную смолу, дериватизированную алкильными цепями из 1-10 углеродов в длину или арилалкильными группами.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что незаряженная смола включает частицы силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитый полимер полиметакрилата.
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что незаряженная смола включает полужесткие сферические гранулы, синтезированные сополимеризацией этиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированных бутильными группами.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (d) включают нанесение элюента со стадии (с) при рН от 3 до 5.
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (d) включают нанесение элюента со стадии (с) в 50 мМ фосфата натрия, 500 мМ NaCl, с рН, доведенным до 4 фосфорной кислотой, или в буфере эквивалентной ионной силы.
12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что элюцию на стадии (f) выполняют с использованием буфера, содержащего 20 мМ НСl и имеющего концентрацию этанола более чем 25%.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация этанола составляет 28,5 - 30%.
14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация этанола равна 29%.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что смола для аффинной хроматографии со стадии (g) включает поперечносшитый сополимер аллилдекстрана и Ν,Ν'-метиленбисакриламида в форме гранул с диаметром от 25 до 75 мкм.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что гранулы обладают способностью фракционировать глобулярные белки от 20000 до 8000000 кД.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что условия загрузки на стадии (g) включают нанесение элюента со стадии (f) при рН от 1 до 4.
18. Способ по п. 15, отличающийся тем, что элюцию на стадии (і) осуществляют с использованием буфера, содержащего 200 мМ глицина с рН от 3 до 6, или буфера эквивалентной ионной силы.
19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает концентрирование водного раствора rDSPA α1.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что дополнительно включает лиофилизацию концентрированного раствора rDSPA α1.
21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно включает концентрирование водного раствора rDSPA α1 и лиофилизацию концентрированного раствора rDSPA α1.
22. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
(a) нанесение среды при рН от 4 до 7 на катионообменную смолу, включающую частицы силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитые полимеры полиметакрилата, дериватизированные карбоксильными или карбоксиалкильными группами;
(b) промывание катионообменной смолы для удаления не принадлежащих к rDSPA α1 белков и небелковых загрязняющих примесей;
(c) селективную элюцию связанного rDSPA α1 с катионообменной смолы с использованием буфера, содержащего 50 мМ фосфата натрия и от 100 мМ до 500 мМ NaCl, или буфера эквивалентной ионной силы;
(d) нанесение элюента со стадии (с), содержащего rDSPA α1, при рН от 3 до 5 на гидрофобно-взаимодействуюшую смолу, включающую частицы силикагеля, поперечносшитую агарозу или поперечносшитые полимеры полиметакрилата;
(e) промывание гидрофобно-взаимодействующей смолы для удаления не принадлежащего к rDSPA α1 белка и небелковых загрязняющих примесей;
(f) селективную элюцию связанного rDSPA α1 с гидрофобно-взаимодействующей смолы буфером, содержащим 20 мМ HCl и имеющим концентрацию этанола более чем 25%;
(g) нанесение элюента со стадии (f), содержащего rDSPA α1, при рН от 1 до 4 на смолу для аффинной хроматографии, включающую поперечносшитый полимер аллилдекстрана и Ν, N′-метиленбисакриламида в форме гранул с диаметром от 25 до 75 мкм;
(h) промывание смолы для аффинной хроматографии для удаления не принадлежащего к rDSPA α1 белка и небелковых загрязняющих примесей;
(i) селективную элюцию связанного rDSPA α1 со смолы для аффинной хроматографии буфером, содержащим 200 мМ глицина, с рН от 3 до 6 или буфером эквивалентной ионной силы с получением чистого rDSPA α1 в водном растворе.
23. Способ выделения и очистки rDSPA α1 из биологической среды, включающий:
(a) нанесение среды при рН 5 на катионообменную смолу, включающую матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанных с полиэтилениминсиланом, в котором аминогруппы дериватизированы карбоксильными группами;
(b) промывание катионообменной смолы с рН 5 100 мМ NaOAc и 50 мМ фосфата натрия с рН 7,5 для удаления не принадлежащего к rDSPA α1 белка и небелковых загрязняющих примесей;
(c) элюцию связанного rDSPA α1 с катионообменной смолы буфером, содержащим 50 мМ фосфата натрия и 500 мМ хлорида натрия, с рН 7,5;
(d) нанесение элюента со стадии (с), содержащего rDSPA α1, при рН 4 на гидрофобно-взаимодействующую смолу, включающую полужесткие сферические гранулы, синтезированные путем сополимеризации этиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированных бутильными группами;
(e) промывание гидрофобно-взаимодействующей смолы 20 мМ НСl, а затем 20 мМ HCl, содержащим 19% EtOH, для удаления белка, не принадлежащего к rDSPA α1, и небелковых загрязняющих примесей;
(f) элюцию связанного rDSPA α1 с гидрофобно-взаимодействующей смолы буфером, содержащим 29% этанола и 20 мМ HCl, с рН 2,5;
(g) нанесение элюента со стадии (f), содержащего rDSPA α1, при рН 2,5 на смолу для аффинной хроматографии, включающую поперечносшитый полимер аллилдекстрана и Ν,Ν'-метиленбисакриламида, который фракционирует глобулярные белки от 20000 до 8000000 кД;
(h) промывание смолы для аффинной хроматографии 20 мМ НС1 для удаления белка, не принадлежащего к rDSPA α1, и небелковых загрязняющих примесей;
(і) элюцию связанного rDSPA α1 со смолы для аффинной хроматографии буфером, содержащим 200 мМ глицина, с рН от 4 до 5, с получением чистого rDSPA α1 в водном растворе.
Текст
Настоящее изобретение относится к способу выделения и очистки активатора a1 плазминогена слюны Desmondus rotundus (rDSPA a1)j к очищенному этим способом rDSPA a1, к фармацевтическим композициям", содержащим очищенный таким образом rDSPA a1, и к способам лечения, использующим очищенный таким образом rDSPA a1. Предпосылки изобретения Тромбозы возникают в результате образования кровяного сгустка в кровеносных сосудах. Кровяной сгусток различается при различных тромбозах, включая эмболии легких и артериальные тромбозы, к которым относится острый инфаркт миокарда. Эмболия легких и инфаркт миокарда являются опасными для жизни событиями, требующими немедленного медицинского вмешательства. Распространенная форма терапии таких артериальных и венозных тромбозов заключается в применении активаторов плазминогена для осуществления энзиматического тромболиза (Collen с соавт., Ann. Rev. Med., (1988), 39:405-423). Эти вещества, называемые тромболитиками, превращают плазминоген, неактивный профермент фибринолитической системы крови, в активный протеолитический фермент, плазмин. Плазмин, в свою очередь, растворяет волокнистый материал фибрин, который являетcя основным компонентом кровяного сгустка; это приводит к возобновлению работы этих закупоренных сосудов и восстановлению тока крови. Однако, поскольку плазмин является относительно неспецифической протеазой, он может также разрушать, посредством протеолиза, компоненты крови, необходимые для интактного гемостаза (например, фибриноген) и, таким образом, повышать риск кровотечения. Первые энзиматические тромболитики, стрептокиназа и урокиназа, представляют собой соединения, которые однократно введенные в кровообращение, системно превращают плазминоген в плазмин и индуцируют протеолиз во всем организме. Таким образом, тромболитические терапии, которые используют эти соединения, сопровождаются осложнениями, связанными с кровотечением. Были созданы, ранее не существовавшие," тромболитические терапии, основанные на соответствующем использовании активаторов плазминогена определенного тканевого типа, обычно именуемые как t-PA, но они также обладают рядом недостатков, в том числе, серьезными осложнениями при кров*отечениях, сравнительно часто случающимися при повторной окклюзии, неспособные быть одинаково эффективными, и подозреваемые в инактивации активаторов плазминогена ингибиторами, такими как ингибитор активатора плазминогена Типа 1 (PAI-1) (Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol. 14, No 1 (1988)). Совсем недавно из слюны и слюнных желез большого вампира (Desmondus rotundus) очистили белки активатора плазминогена (Опубликованная Европейская Патентная Заявка 0383417 (Baldus с соавт.), опубликованная Европейская Патентная Заявка 0352119 (Duong с соавт.)). Эти активаторы плазминогена (именуемые DSPA) представляют собой сериновые протеазы, которые катализируют соответствующее превращение плазминогена в плазмин, но они проявляют большую селективность в отношении фибринсвязанного плазминогена и, поэтому, могут быть ассоциированы с менее серьезным и частым кровотечением при использовании тромболитическои терапии. Кроме того, DSPA нелегко инактивируется плазменными ингибиторами, такими как РАI-1, и по этой причине могут быть ассоциированы с меньшей частотой повторной окклюзии. В слюне вампира можно обнаружить две высокомолекулярные формы DSPA (обозначаемые как a1 и a2), которые обе содержат несколько доменов, в том числе, протеазный домен, и которые обе обладают способностью энергично связываться с плазмино-геном в присутствии фибрина. С помощью рекомбинантной биотехнологии в культуре клеток млекопитающих получены соответствующие различные формы DSPA (Kratzschmer с соавт., беле (1991), 105:229-237; опубликованная Европейская Патентная Заявка 0 352 119 (Duong с соавт.)), и описаны ограниченно очищенные рекомбинантно полученные DSPA (rDSPA) (Witt с соавт. , Blood (1992), 79:1213-1217). Однако, не были описаны соответствующие выделение и очистка rDSPA в промышленном масштабе и степень чистоты, полагающаяся для фармацевтических препаратов. Настоящая заявка касается выделения и очистки рекомбинантного DSPA a1 (rDSPA a1) в промышленном масштабе. В настоящем изобретении описано получение достаточно чистого и стабильного rDSPA a1 для продажи и годного для клинического применения. В настоящем изобретении разработали способ соответствующего выделения и очистки rDSPA a1 в промышленном масштабе и получения продукта, который пригоден для клинического использования. В соответствии с этим, один аспект изобретения направлен на способ очистки rDSPA из биологической среды, причем указанный способ включает в себя нижеследующие стадии: (a) нанесение среды на катионообменную смолу в условиях загрузки, которые приводят к селективному связыванию rDSPA a1 с катионообменной смолой; (b) необязательно, промывание данной катионообменной смолы для удаления белков, не относящихся к rDSPA a1, и небелковых примесей; (c) селективная элюция с данной катионообменной смолы связавшегося rDSPA a1; (d) нанесение элюента со стадии (с), содержащего rDSPA a1, на гидрофобно-взаимодействуюшую смолу в условиях загрузки, которые приводят к селективному связыванию rDSPA a1 с данной гидрофобновзаимодействующей смолой; (e) необязательно, промывание данной гидрофобно взаимодействующей смолы для удаления белка, не принадлежащего rDSPA a1, и небелковых примесей; (f) селективная элюция с гидрофобно-взаимодействующей смолы связавшегося rDSPA a1; (g) нанесение элюента со стадии (f), содержащего соответствующий rDSPA a1, на смолу для хроматографии по сродству в условиях загрузки, которые приводят к селективному связыванию rDSPA a1 со смолой для хроматографии по сродству; (h) необязательно, промывание смолы для хроматографии по сродству для удаления белка, не принадлежащего к rDSPA a1, и небелковых примесей; (і) селективная злюция связавшегося rDSPA a1 из смолы для хроматографии по сродству для получения, в основном, по существу чистого rDSPA a1 в водном растворе. Другим аспектом настоящего изобретения является белок rDSPA a1, который выделили и очистили способом настоящего изобретения. Следующий аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей rDSPA a1, который выделили и очистили способом настоящего изобретений, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Другим аспектом настоящего изобретения является способ, использования rDSPA a1, выделенного и очищенного способом настоящего изобретения, для лечения артериальных и венозных тромбозов человека. Подробное описание настоящего изобретения Используемые в данном описании и формуле изобретения, если не оговорено иначе, нижеследующие термины обладают следующми указанными значениями: "Биологическая среда" относится к точному составу солей и питательных веществ, используемых для размножения клеток в культуре. "Кондиционная среда" относится к биологической среде, в которой выращивают клетки. По этой причине данная среда обладает определенными условиями для роста соответствующих клеток и содержит продукты, секретируемые в данную среду в течение клеточного роста. Они могут представлять собой продукты отхода, продуцируемые в течение роста, или белки, которые были синтезированы и секретированы в данную среду в течение роста данными клетками. "Катионообменная смола" относится к естественному или синтетическому веществу, обычно твердому, которое обладает способностью обменивать связанные ионы на ионы из данной окружающей жидкой среды. Катионообменная смола обладает постоянно функционирующими отрицательными ионами и обменивает положительные противоионы. Соответствующие якорные группы (компоненты активного обмена) в коммерчески доступных катионообменниках обычно представляют собой -С6Н5О-, -SO3-, -COO-, -РО- или –АSО3-. Слабые катионообменные смолы представляют собой смолы, в которых связывающая сила соответствующего катиона невысока, например катионы с карбоксильной или карбоксиалкильной функциями. Кроме того, слабые катионообменные смолы обычно, при кислом pH, диссоциируют не полностью. Конкретная катионообменная смола, используемая в настоящем изобретении, включает в себя матрицу из силикагелевых частиц, ковалентно связанных с полиэтилениминсиланом, в котором аминогруппы полиэтиленимина дериватизированы карбоксильными группами. Такая смола коммерчески доступна от J.Т.Baker под торговым названием Widepore CBX® Chromatography resin. Тидрофобно взаимодействующая смола" относится к естественному или синтетическому веществу, обычно твердому, которое содержит незаряженные группы, такие как метильная, этильная или другие алкильные группы. Эти группы образуют гидрофобные связи с группами в белковых составляющих, которые пропускают через смолу, и разделяют белки по соответствующей силе взаимодействия между данным белком и группами смолы. Конкретная гидрофобно взаимодействующая смола состоит из полужестких сферических гранул, синтезированных путем сополимеризации этиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированных бутильными группами. Такая смола коммерчески доступна от Toso-Haas под торговым названием Toyo-Pearl® 650М С4. "Смола для хроматографии по сродству" относится к естественному или синтетическому веществу, обычно твердому, которое используется для очистки белков. Данная смола разделяет белки на основании сродства, которое имеет место между группами данного белка и группами данной смолы. В настоящем изобретении смола, используемая в качестве смолы для аффинной хроматографии, обычно является смолой для разделения белков на основе их размера. Конкретная смола для аффинной хроматографии представляет собой сшитый сополимер из аллилдекстрана и Ν,Ν'-метиленбисакриламида в соответствующей форме гранул, которые обладают способностью фракционировать глобулярные белки между 20000 и 8000000кДа. Такая смола коммерчески доступна от Pharmacia под торговым названием Sephacryl® S-400. "Алкил" относится к неразветвленному или разветвленному моновалентному радикалу цепи, состоящему исключительно из углерода и водорода* без насыщения и имеющего от одного до восемнадцати углеродных атомов, предпочтительно, от одного до шести углеродных атомов, например, метила, этила, н-пропила, изопропила (1-метилэтил), н-бутила, трет-бутила (1,1-диметилэтил), втор-бутила (1-метилпропил), н-пентила, н-гексила и т.п. "Практически чистый", применительно к чистоте продукта rDSPA a1, после схемы очистки, детализированной в этой заявке, означает, что более, чем 80%, общего белка в конечном очищенном продукте представляет собой rDSPA a1, предпочтительно более, чем 90%, выделенного общего белка представляет собой rDSPA a1, и наиболее предпочтительно 98% выделенного общего белка представляет собой rDSPA a1. Содержание белка и его чистота основаны на обращенно-фазовой HPLC и анализе SDSΠΑΑΓ. "Белок, не принадлежащий rDSPA a1, и небелковые загрязняющие примеси" относятся ко всем материалам, иным чем rDSPA a1, обнаруженным в данной биологической среде, из которой очищали rDSPA a1. "Фармацевтически приемлемый наполнитель" относится к приемлемому носителю, и любое фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, суспендированное или включенное в данную фармацевтическую композицию, которое нетоксично и не оказывает вредного влияния на соответствующую биологическую активность данной фармацевтической композиции, должно быть, при необходимости, сопоставимо с физиологическими условиями. Подходящими наполнителями являются соединения, такие как маннитол, сукцинат, глицин или сывороточный альбумин. "Терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству rDSPA a1, которое при введение человеку, нуждающемуся в нем, является достаточным для эффективной терапии, как указано ниже, для заболевания-состояния, характеризуемого тромбозом. Количество соединения, которое составляет "терапевтически эффективное количество" будет варьироваться в зависимости от данного соединения, данного заболевания-состояния и его серьезности, но может быть определено традиционно любым специалистом в данной области знаний. "Лечение" или "терапия", используемые здесь," относятся к терапии болезни-состояния у человека, чья болезнь-состояние характеризуется тромбозом, и включает: (і) предупреждение возникновения данной болезни-состояния у человека, в частности, когда такой человек предрасположен к данному заболеванию-состоянию, но еще не диагностирован в качестве его обладателя; (іі) подавление данного заболевания-состояния, например, остановкой его развития; или (ііі) облегчение данного заболевания-состояния, например, обеспечением регрессии данного заболевания-состояния. "Необязательный” или "необязательно" означает, что соответствующие последовательно описываемые события или обстоятельства могут или не могут происходить, и что данное описание включает примеры, когда указанные события или обстоятельства происходят, и примеры, в которых они не происходят. Настоящее изобретение относится к способу выделения и очистки rDSPA a1 в промышленном масштабе и в форме, подходящей для использования в фармацевтических препаратах. rDSPA получали путем ферментации линии' клеток млекопитающего, способной секретирования rDSPA-продукт в культуральную среду. Кондиционную среду, например, среду, которую получают из биореактора, содержащую определенные клетки млекопитающего, собирали, и полученный rDSPA a1 отделяли от других белков и примесей серией хроматографических стадий, начинающихся с использования ионообменной смолы, с последующей селективной элюцией rDSPA из смолы. Эту rDSPA-фракцию, получаемую путем селективной элюции из катионообменной смолы, наносили затем на гидрофобно-взаимодеиствуюшую смолу, селективная элюция которой из данной матрицы обеспечивает второй уровень очистки. Эту элюированную rDSPA a1-фракцию наносили затем на смолу для аффинной хроматографии, где селективная элюция обеспечивает дальнейший уровень очистки. Этот выделенный очисткой rDSPA далее концентрировали с помощью традиционных методик, такой как ультрафильтрация, и затем лиофилизировали. Конкретное осуществление настоящего изобретения описывается ниже. А. Выделение и очистка 1. Культуральная среда и клеточные линии Культуральная среда включает основную среду, подходящую для роста клеток млекопитающих, такую как DMEM или Хэмса F12. Конкретная среда представляет собой среду Ε Вильямса (Williams, G.M. и Gunn, J.M., Exp. Cell Res., (1974) 89:139). Для соответствующей инокуляции ростовой фазы в данную основную среду, обыкновенно, добавляли источник серы, обычно бычью сыворотку (BS) или сыворотку новорожденного теленка (CS), представленную концентрацией в соответствующем диапазоне, от около 0,1% до 10%, по весу, обычно, представленную, около 1%-5%, по весу. Можно также добавлять другие ростовые факторы или буферы, такие как HEPES. В течение данной перфузируемой ростовой фазы концентрация данной сыворотки обычно поддерживается на одном и том же концентрационном уровне, обычно находящемся в диапазоне от около 3% до 8%, обыкновенно, находящемся около 5%. Клеточные линии, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают клеточные линии млекопитающих, способные к росту в суспензионной культуре и/или к росту на микроносителях. Конкретные клеточные линии, которые отвечают этим требованиям, включают линии клеток яичника китайского хомячка (ОНО), ВНК-клеток или НЕК293-клеточную линию (Kratzschmer с соавт., Gene, (1991) 116:281-284; Petri, Т., J. BioTechnology, (1995) 39:75-83). Особенно предпочтительной СНО-клеточной линией является DXB11, которая описана у Ulraub G. и Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4216-4220. Эти клетки кот-рансфицировали соответствующими экспрессирующими векторами pSVPAI1 и pUDHFR1, которые, соответственно, содержат кодирующие последовательности для rDSPA a1 и для мышиной дигидро-фолатредуктазы (Petri Т., там же). Полученную трансформированную линию клеток ОНО, используемую в настоящем изобретении, обозначили GD16 и депонировали в Американской Коллекции Типовых Культур, Rockville, Maryland (АТСС) и присвоили АТСС # CRL 12023. 2. Рост культуры и фаза образования продукта После инокуляции с помощью либо сливного мундштука или других частей биореактора для культивирования данную клеточную культуру выращивали до получения плотности обычно в диапазоне около (1-40)х10б клеток/мл. По достижении требуемой плотности клеток на гранулах-микроносителях начинали перфузию свежей средой с добавленной сывороткой. Альтернативно, клетки могли выращивать в суспензионной культуре. Обычно концентрация сыворотки в свежей среде находится в диапазоне от приблизительно 2% до 10% по весу, более типично в ряду от около 3% до 8% по весу, и, более обычно, составляет около 5% по весу. Вначале скорость перфузии находится в диапазоне от около 0,25 до 0,75 культуральных объемов в день, обычно около 0,5 культуральных объемов в день. С увеличением клеточного роста данную перфузи-онную скорость повышают до конечной скорости в диапазоне от около 1,5 до 2,5 культуральных объемов в день, обычно после периода от 2-х до 10 дней. Во время этого роста стерильные предварительно уравновешенные гранулы микроносителя добавляли в реактор для поддержания соотношения гранул микроносителя и плотности клеток в диапазоне от около 0,5 до 1,0 грамма гранул микроносителя на 109 клеток. Гранулымикроносители добавляли в реактор с использованием аспиратора через соответствующую трубку для образца. По достижении требуемого уровня клеточной плотности добавление соответствующей сыворотки к свежей культуральной среде уменьшали, обычно до концентрации в диапазоне от около 0,1 до 2,0% весовых, обычно - 1%. Культура в продукционной фазе требует внимания к множеству параметров ферментации: температуре, рН и определенному уровню растворенного кислорода, контролируемых ежедневно. Добавочная культуральная среда, сыворотка и щёлочь, необходимые для снабжения, в виде запасных емкостей исчерпывались. Образцы кондиционной среды, охарактеризованные в качестве среды, которая содержит продукт, анализировали традиционно, как минимум, каждые два дня, чтобы увериться в том, что продукция остается свободной от загрязняющих примесей. Соответствующая процедура отбора кондиционной среды из биореакторов минимизирует сбор урожая клеток при использовании сит с приблизительным диаметром пор 100-150 микрон. Суспензионные культуры используют проточный фильтр с перемешиванием для удержания клеток в данном биореакторе. Полученный урожай собирали в стерильные емкости и хранили до 38 дней перед дальнейшей обработкой. rDSPA a1, обнаруживаемый в биореакторном урожае, секретировался из соответствующих СНО-клеток в процессированной форме, которая обладает полной биологической активностью и готова для очистки. 3. Катионообменная хроматография После доведения рН до значения от 4 до 6, предпочтительно до около 5, данный rDSPA a1 в кондиционной среде наносили на катионообменную матрицу (обычно упакованную по соответствующей форме колонки) в условиях, выбранных для создания полного связывания rDSPA a1 с данной матрицей. Поскольку другие белки будут также связываться, соответствующая начальная стадия связывания создает первый уровень разделения для ряда ненужных или примесных белков и других соединений, таких как феноловый красный, неспособных в кондиционной среде связаться с матрицей и, поэтому протекающих через матрицу. Кроме того, rDSPA a1 очищали путем селективной элюции из матрицы, когда данную элюцию можно выполнить либо ступенчатой элюцией, либо линейной градиентной элюцией, увеличивая ионную силу данного буфера. В любом случае данный rDSPA a1 собирали для дальнейшей очистки, как описано ниже. Подходящие катионообменные матрицы включают широкое разнообразие смол, дериватизированных катионными функциональными группами, которые обладают способностью связывать rDSPA a1. Предпочтительными являются синтетические смолы, такие как смолы, которые включают частицы силикагеля, поперечно-сшитую агарозу или поперечно-сшитые полимеры полиметакрилата, дериватизированные катионными функциональными группами, такими как карбоксильная, карбоксиметильная, суль-фонильная, фосфорильная и т.п. Особенно пригодными являются относительно слабые смолы, такие как смолы, обладающие карбоксильной или карбоксиалкшшной функциями, такими как карбоксиметильная или карбоксиэтильная. Особенно предпочтительная смола включает матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанных с полиэтилениминсиланом, с аминогруппами данного полиэтилениминсилана, дериватизированного карбоксильными группами. Такая смола представляет собой Baker Widepore CBХÒ (с размером гранулы 45мм), которая коммерчески доступна от J.Т.Baker. Соответствующие условия связывания и элюции варьируются в зависимости от силы связывания катионной смолы. Для слабых катионных смол, такой как Baker Widepore CBX, связывание может быть эффективным при низкой ионной силе в слегка закис-ленных условиях, обычно при рН 4-7, предпочтительно, около рН 5. После промывания матрицы rDSPA a1 можно селективно элюировать, выдерживая матрицу в подвижной фазе, обладающей повышенной ионной силой, применяя либо линейную, либо ступенчатую элюцию. Для указанной Baker Widepore CBX смолы rDSPA a1 будет элюироваться при рН около 7,5 с солевой концентрацией между около 100мМ и 500мМ NaCl. Колонку можно затем выбить и регенерировать для последующего использования. Предпочтительно, что касается Baker Widepore CBX матрицы, смолу вначале уравновешивали буфером из 100мМ натрийа-цетата, рН 5. Буфер наносили на колонку при скорости потока от 0,2 до 2,0 колоночных объемов в минуту, до тех пор пока рН вытекающего потока не достигнет 5. Кондиционную среду, содержащую rDSPA a1, фильтровали через 1,2мкм фильтр и затем титровали до рН между 4 и 7, наиболее предпочтительно -5, используя ледяную уксусную кислоту. Эту среду наносили затем на колонку обычно с использованием механического насоса при скорости потока не более, чем 2,0 колоночных объема в минуту. Готовили фильтр для удаления макрочастиц, которые могут закупоривать матрикс данной колонки. Затем эту колоночную матрицу вновь уравновешивали уравновешивающим ацетатным буфером до значения рН, установленного на 5, что обычно требует от около 2 до 7 колоночных объемов. Промывочный буфер, содержащей 50мМ натрийфосфата, рН 7,5, наносили на колонку от около 0,1 до 0,2 колоночных объемов в минуту до достижения рН элюента значения 7,5. Затем из этой колонки элюировали rDSPA a1 с использованием элюирувдего буфера, содержащего 50мМ натрийфосфата, 500мМ натрийхлорида, рН 7,5. Элюирующий буфер пропускали до тех пор, пока белок более не обнаруживали в элюенте из колонки. Затем на эту колонку наносили десорбирующий буфер, содержащий 2,0Μ натрийацетата, рН 8, с целью регенерировать данную матрицу. Соответствующий буфер для хранения содержит 10% уксусной кислоты и 45% этанола. 4. Хроматография гидрофобного взаимодействия Фракцию rDSPA a1, собранную с катионообменной матрицы, затем наносили на матрицу для гидрофобного взаимодействия (обычно в форме соответствующей колонки) в условиях, позволяющих связываться данному rDSPA a1 с матрицей, обычно - высокой ионной силы и низкого рН. Затем rDSPA a1 селективно элюировали увеличивающейся концентрацией органического растворителя подвижной фазы, наносимого на данную колонку с использованием линейного или ступенчатого градиента. Элюируе-мую фракцию rDSPA a1 собирали для дальнейшей очистки. , Эта стадия снижает примесь ДНК в 100-1000 раз и инактивирует потенциальные вирусные примеси. Подходящие гидрофобно взаимодействующие матрицы включают широкое разнообразие незаряженных смол, обладающих ковалентно присоединенными гидрофобными группами, такими как пропильная, бутильная, октальная, фенильная и им подобные. Эти смолы могут представлять собой поперечно-сшитые органические полимеры, такие как стиролдивинилбензол, силикагель, агароза, полиметакрилат или любую одну из широкого множества других подходящих частиц-носителей. Особенно предпочтительная смола включает полужесткие сферические гранулы, синтезированные еополимеризацией этиленгликоля и полимеров метакри-латного типа, дериватизированных бутильными группами. Такая смола представляет собой Toyo-Pearl (40-90мкм-овые гранулы), которая коммерчески доступна от Toso-Haas. Связывание с гидрофобно взаимодействующей колонкой эффективно в условиях высокой ионной силы, обычно при кислом рН 3-5, более обычно, около 4. Практически весь белок, содержащийся во фракции rDSPA αϊ, который элюировали с катионообменной смолы, связывается в гидрофобно взаимодействующей колонке. Разнообразные белки могут быть селективно элюированы на основе их отличающихся сил гидрофобного взаимодействия с соответствующими гидрофобными группами на данной матрице, например, в порядке увеличения гидрофобности соответствующего белка. Элюцию можно осуществить ступенчатым или линейным градиентом обычно алкогольным элюентом, таким как этанол или изопропанол. Особенно предпочтительным алкоголем является этиловый спирт. Предпочтительно, что касается матрицы Toyo-Pearl 04, уравновешивание можно осуществить уравновешивающим буфером, содержащим 50мМ натрийацетата, 500мМ натрийхлорида, рН 4. Затем фракцию rDSPA a1 с ионообменной колонки титруют до рН 4 и наносят на 04-матрицу, а матрицу затем вновь уравновешивают вышеописанным уравновешивающим буфером. Колонку промывают последовательно двумя буферами следующим образом. В первой промывке (промывка 1) использовали, как минимум, два колоночных объема буфера, содержащего 20 мМ НСl. Промывание продолжали до получения вытекающего потока, не содержащего белка, что устанавливали по стабильной УФ-абсорбции. Данную матрицу вновь промывали (промывка 2) не менее, чем 10 колоночными объемами буфера, содержащего 19% этанола, 20мМ НСl, и промывание продолжали буфером, содержащим 20,5% этанола, 20мМ НСl, до тех пор, пока белок не прекращал элюироваться. Элюция rDSPA a1-продукта эффективна с использованием буфера, содержащего 29% этанола, 20мМ НСl, рН 2,5. После элюции продукта колонку промывали не менее, чем двумя колоночными объемами буфера, содержащего 100мМ NaOH. Данную матрицу хранили в первом промывочном буфере. 5.Аффинная хроматография Фракцию rDSPA a1, собранную с гидрофобно взаимодействующей смолы, наносили затем на аффинную матрицу (обычно в форме соответствующей колонки) в условиях, которые позволяют связываться rDSPA a1 с аффинной матрицей. До тех пор, пока rDSPA a1 остается связанным в колонке, примеси элюируют путем промывания колонки 2-3 колоночными объемами 20мМ НСl. Эта стадия облегчает обмен буфера с добавленным фармацевтическим препаратом и растворимость, а также помогает инактивировать/удалять потенциальные вирусные примеси; Предпочтительно, используют 2,5 колоночных объемов данного буфера. Затем этот rDSPA a1 селективно злюируют с использованием буфера, содержащего 200мМ глицина, свободное основание при рН между 4 и 5. Получаемую фракцию rDSPA a1 собирают для концентрирования. В настоящем изобретении соответствующие смолы* используемые в качестве аффинных смол, представляют собой смолы, которые обычно используются как смолы для эксклюзии по размеру. Подходящие аффинные матрицы включают смолы, включающие поперечно-сшитый полимер аллилдекстрана и Ν,Ν'-метиленбисак-риламида в форме гранул с диаметром между 25 и 75мкм. Особенно предпочтительной смолой является Sephacryl 400®, который коммерчески доступен от Pharmacia и обладает способностью фракционировать глобулярные белки между 20000 и 8000000кД. Связывание rDSPA a1 с аффинной смолой осуществляется в условиях низкой ионной силы и низкого рН. Практически весь rDSPA a1, собранный с гидрофобно взаимодействующей смолы, связывается в колонке. Связавшийся rDSPA a1 можно селективно злюировать путем повышения рН и/или ионной силы. Элюцию можно осуществить ступенчатым или линейным градиентом, обычно элюентом, содержащим 200мМ глицина, свободное основание. Предпочтительно* что касается матрицы Sephacryl S-400, уравновешивание можно осуществить буфером, содержащим 19% этанола, 20мМ НСl, до тех пор, пока рН в вытекающем потоке не останется неизменным. Матрицу нагружали полученной из указанной гидрофобно взаимодействующей колонки фракцией rDSPA a1, а затем промывали буфером, содержащим 20мМ НСl до получения неизменяющегося УФ-сигнала в вытекающем потоке. Элюция связанного rDSPA a1 эффективна с использованием буфера, содержащего 200мМ глицина. После элюции продукта колонку десорбировали не менее, чем двумя колоночными объемами буфера, содержащего 100мМ NaOH. После промывания матрицы, как минимум, двумя колоночными объемами соответствующего промывочного буфера (20мМ НСl) очищенную матрицу хранили в этом буфере. 6. Концентрирование Выделенный очисткой белок настоящего изобретения можно затем сконцентрировать обычно путем фильтрации или подобным образом, и можно, в конечном счете, лиофилизировать или иным образом ввести в стандартные фармацевтические препараты. Пригодные методы концентрирования и лиофилизации хорошо описаны в научной литературе. В. Приготовление лекарственного средства 1. Фармацевтические композиции Настоящее изобретение предлагает реагент с существенной терапевтической ценностью. rDSPA a1, который должен быть пригоден для лечения артериальных и венозных тромбозов, выделяли очисткой соответствующими описанными способами. Рекомбинантный DSPA a1, очищенный, как здесь описано, можно вводить пациенту. Этот реагент можно сочетать для терапевтического использования с другими ингредиентами, например, с фармацевтически приемлемыми традиционными носителями или разбавителями, вместе с физиологически безвредными стабилизаторами и наполнителями. Эти сочетания могут быть стерильно отфильтрованы и размещены в дозированные формы путем лиофилизации в дозируемых флаконах или сохранены в стабилизированных водных препаратах. Соответствующие количества реагента, необходимые для эффективной терапии, будут зависеть от многих различных факторов, включающих способы введения, физиологическое состояние конкретного пациента и другие вводимые медикаменты. Поэтому терапевтические дозы следует подбирать, чтобы обеспечить безопасность и эффективность. Обычно дозы, используемые 2л vitro, снабжены полезным руководством по пригодности соответствующих количеств для введения этих реагентов in situ. Тестирование на животном эффективных доз для терапии обеспечивает прогнозируемый критерий дозирования для человека. Каждое в отдельности соображение описано, например, у Gilman с соавт. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8 th Ed., Pergamon Press; и Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Perm. Здесь и ниже обсуждаются способы введения, например, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное или внутримышечное введение, чрезкожная диффузия и другие. Фармацевтически приемлемые носители будут включать воду, физраствор, буферы и другие описываемые соединения, например, в Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. На основании назначенных доз других активаторов плазминогена нужную тотальную дозу следует рассчитывать между 80 и 110 мг (Physicians' Desk Reference, 49th ed. (1995), Medical Economics Data Production Company, pp 1083-1085). Терапевтические препараты могут быть введены в любом удобном дозированном составе. Поскольку соответствующий активный ингредиент можно назначать сам по себе, предпочтительно представлять его в виде фармацевтического препарата. Препараты включают, как минимум, один активный ингредиент, указанный выше, вместе с одним или несколькими приемлемыми носителями. Каждый носитель должен быть одинаково приемлем, фармацевтически и физиологически, в смысле совместимости с другими ингредиентами и не навредить конкретному пациенту. Препарат включает компоненты, подходящие для перорального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и интрадермальное) введения. Соответствующие препараты могут быть удобно представлены в форме дозовой единицы и могут быть изготовлены любыми способами, хорошо известными специалистам аптечного дела. Смотрите, например, Gilman с соавт., там же, и Remington там же. Б итоге соответствующе предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в Кратком изложении существа изобретения,являются следующими: способ соответствующего выделения и очистки rDSPA a1 из биологической среды, отличающийся тем, что указанный способ включает следующие стадии: (a) нанесение среды при рН 5 на катионообменную смолу, включающую матрицу из частиц силикагеля, ковалентно связанных с полиэтилениминсиланом, в котором соответствующие аминогруппы дериватизированы карбоксильными группами, что приводит к селективному связыванию rDSPA a1 с данной катионооб-менной смолой; (b) промывание данной катионообменной смолы с рН 5 100мМ NaOAc и 50мМ NaPО4 с рН 7,5 для удаления белка не принадлежащего к rDSPA a1, и небелковых загрязняющих примесей; (c) элюция связанного rDSPA a1. с катионообменной смолы буфером, содержащим 50мМ натрийфосфата и 500мМ натрийхло-рида с рН 7,5; (d) нанесение элюента со стадии (с), содержащего данный rDSPA a1, при рН 4 на гидрофобновзаимодействующую смолу, включающую полужесткие сферические гранулы, синтезированные сополимеризацией этиленгликоля и полимеров метакрилатного типа, дериватизированных бутильными группами, что приводит к селективному связыванию rDSPA a1 с гидрофобно взаимодействующей смолой; (e) промывание гидрофобно взаимодействующей смолы 20мМ НСl, а затем 20мМ НСl, содержащей 19% EtOH для удаления белка, не принадлежащего к rDSPA a1 и небелковых загрязняющих примесей; (f) элюция связанного rDSPA a1 с гидрофобно взаимодействующей смолы буфером, содержащим 29% этанола и 20мМ хлористоводородной кислоты с рН 2,5; (g) нанесение элюента со стадии (f), содержащего данный rDSPA a1, при рН 2,5 на смолу для аффинной хроматографии, включающую поперечно-сшитый полимер аллилдекстрана и Ν,Ν'-метиленбисакриламида, который фракционирует глобулярные белки между 20000 и 8000000кД, что приводит к селективному связыванию rDSPA eel со смолой для аффинной хроматографии; (h) промывание этой смолы для аффинной хроматографии 20мМ НСl для удаления белка, непринадлежащего rDSPA a1, и небелковых загрязняющих примесей; (і) элюция связанного rDSPA a1 со смолы для аффинной хроматографии буфером, содержащим 200мМ глицина с рН между 4 и 5, для получения практически чистого rDSPA a1 в водном растворе. Нижеследующие конкретные препараты и примеры предлагаются в качестве руководства для практического применения настоящего изобретения и не подразумевают ограничения объема настоящего изобретения. Пример 1 Культура клеток, продуцирующая rDSPA a1 Оттаивали ампулу из DSPA Working Cell Bank и инокулиро-вали в роллерную бутыль с 5% сыворотки теленка в ростовой среде (WEC 5.0 среда, модифицированная по Williams). Через двухнедельный период эти клетки размещали в четыре роллерные бутыли, полученные клетки трипсинизировали из этих четырех роллерных бутылей и инокулировали в четыре 1 литровые вращающиеся колбы, каждая с 4x108 клеток віл ростовой среды. Спустя четыре дня полученные из этих четырех вращающихся колб культуры использовали для инокулирования 10 литрового биореактора. Дополнительный 1л ростовой среды добавляли в эту биореакторную культуру в день инокуляции. На следующий день это биореактор заполняли до 10л ростовой средой. Культивирование с добавлением и без добавления микрогранул-носителей осуществляли по этому протоколу. рН данной среды поддерживали на уровне 7,0-7,4, а уровень насыщения кислорода поддерживали постоянно с помощью барботажнои системы. Температуру поддерживали на уровне 34-39°С. Плотность клеток составляла в день инокуляции в биореакторе 8,1x105 клеток на мл, а спустя два дня клеточная плотность удваивалась, за время, когда скорость перфузии составила 0,5 культуральных объемов в день (cv/день). Скорость перфузии увеличивали по отношению к плотности клеток так, чтобы через девять дней после инокуляции данного биореактора указанная плотность достигала 6,2x10б клеток/мл, и перфузию увеличивали до 2 cv/день. Затем биореактор переключали на продукционную среду (1% сыворотки теленка в среде WEC 5.0) и двумя днями позже начали собирать урожай клеток и продолжили в течение 10 недель. В течение продукционной фазы средняя плотность клеток составляла 15x106 клеток на мл с приблизительной жизнеспособностью 75%. Продукция rDSPA a1 составляла, в среднем, 40мг rDSPA a1 на литр, а средняя удельная продуктивная скорость равнялась 6 пикограммам rDSPA a1 на клетку в день. Нарастание объемов ферментирования осуществляли путем перенесения половины данного содержимого из одного реактора в новый сосуд. Продуктивную среду, размещенную в обоих биореакторах, перфузировали при 2 cv/день и сразу же собирали полученный урожай клеток. Пример 2 Очистка rDSPA a1 1. Катионообменная хроматография (Колонка А). Урожай клеток данного биореактора хранили при температуре окружающей среды (15-25°С). Затем фильтровали через 0,45 микронный фильтр до загрузки на катионообменную колонку. Очистку полученного урожая клеток начинали со стадии колоночной хроматографии, использующей СВХ-смолу, изготовленную J.Т.Baker (Колонка А). Эта стадия существенно облегчает очистку данного белка. Буферы для Колонки А состоят из Буфера А1: уравновешивающий буфер (50мМ NaOAc, при рН 5,0), Буфера А2: промывочный буфер (50мМ NaPO4, pH 7,5), Буфера A3: элюируюший буфер (50мМ NaPO4, 500мМ NaCl, рН 7,5), Буфера А4: буфер для десорбции (2Μ NaAc, рН 8,0), и Буфера А5: буфер для хранения (45% EtOH, 10% НОАc). Нижеследующие рабочие параметры колонки свойственны колонке, набитой 6кг смолы и обладающей колоночными объемом 15л. Не более, чем 4,5г rDSPA a1 можно нагрузить на данную колонку на цикл хроматографирования. Данную колонку нагружали при скорости потока не более, чем 2л в минуту и не более, чем при 20psi (137,9кПа) колоночного давления. Технические условия колонки и следящее устройство проверяли перед каждым хроматографированием. Данный нагружаемый материал и хроматографические буферы дегазировали путем барботирования гелием перед использованием. Клетки, полученные в данном биореакторе, фильтровали с помощью 1,2мм фильтра, затем титровали до рН 5,00 (±0,10) с использованием ледяной уксусной кислоты. Перед загрузкой данную колонку уравновешивали не менее, чем 30 литрами буфера А1 до тех пор, пока рН в вытекающем потоке не составлял 5,00 (±0,20). Колонку однократно уравновешивали, на колонку нагружали полученный урожай клеток. Эту колонку вновь уравновешивали не менее, чем 80 литрами буфера А1. Данная колонка считается надлежащим образом уравновешенной, когда вытекающий поток имеет рН 5,00 (±0,20), и когда достигается стабильная нулевая УФ-линия. Колонку промывают не менее, чем 145 литрами буфера А2. Эта колонка является промытой надлежащим образом, когда вытекающий поток имеет рН 7,50 (±0,20), и когда достигается стабильная нулевая УФ-линия. Соответствующий продукт элюируют из данной колонки не менее, чем 30 литрами буфера A3 и собирают в отдельные сосуды. Элюция считается полной, когда достигается стабильная нулевая УФ-линия. После элюции продукта колонку десорбируют до стабильной нулевой УФ-линии с использованием не менее 30 литров буфера А4. Затем эту колонку обрабатывают начисто для повторного использования (не превышая 50 циклов использования). Продукт данной колонки А (или элюата) хранят при 2-8°С. Выход в среднем составил 93%, а степень чистоты (белка) из данного элюата в среднем составила 81%. 2. Хроматография гидрофобного взаимодействия (Колонка В). После хроматографирования на СВХсмоле данный rDSPA a1-продукт хроматографировали с использованием гидрофобно взаимодействующей смолы С4 (Toso-Haas) (Колонка В). Эта стадия способствует существенному удалению небелковых загрязняющих примесей и помогает также в соответствующем инактивиро-вании/удалении возможных вирусных загрязняющих примесей. Буферы для колонки В состоят из Буфера В1: уравновешивающий буфер (50MM NaOAc, 500мМ NaCl, рН 4,0), Буфера В2: буфер для промывки и хранения (20мМ НСl), Буфера В3: промывочный буфер (20мМ НСl, 19% EtOH), Буфера В4: промывочный буфер (20мМ НСl, 20,5% EtOH), Буфера В5: элюирующий буфер (20мМ НСl, 29,5% EtOH) и Буфера В6: буфер для десорбции (0,1 N NaOH). Нижеследующие рабочие параметры данной колонки являются подходящими для колоночного объема 15л. Не более, чем 9г rDSPA a1 можно нагрузить на данную колонку для одного цикла хроматографирования. Данную колонку нагружали при скорости потока не более, чем 2л/мин, и не более, чем при 15psi (103,425кПа) колоночного давления. Спецификации данной колонки и следящего устройства проверяли перед каждым циклом хроматографирования. Перед загрузкой данную колонку уравновешивали до тех пор, пока вытекающий поток не достигнет рН 4,00 (±0,20). Элюат из данной колонки титровали до рН 4,00 (±0,10) с использованием ледяной уксусной кислоты, дегазировали и нагружали. Эту колонку повторно уравновешивали не менее, чем 30 литрами Буфера В1 до тех пор, пока рН вытекающего потока не достигал рН 4,00 (±0,20) и стабильной нулевой УФлинии. Колонку промывали тремя буферами. Первую промывку осуществляли не менее, чем 45 литрами Буфера В2. Колонка является основательно промытой, когда вытекающий поток имеет рН 1,90 (±0,20), и когда достигается стабильная нулевая УФ-линия. Колонку промывали второй раз не менее, чем 145 литрами Буфера В3 до тех пор, пока не достигалась стабильная нулевая УФ-линия. Колонку промывали в третий раз не менее, чем 30 литрами Буфера Б4, и она является полностью промытой, когда достигается стабильная нулевая УФ-линия. rDSPA a1 элюировали с колонки не менее, чем 30 литрами Буфера В5 и собирали в отдельный сосуд. Элюцию продолжали до тех пор, пока не достигалась стабильная нулевая УФ-линия. Затем данную колонку обрабатывали начисто для повторного использования (не превышая 50 циклов использования). Продукт с колонки В (или из элюата) хранили при 2-8°С не более, чем 15 дней перед дальнейшим процессированием. Выход в среднем составил 91%, а полученная чистота (белка) из данного элюата составила в среднем 97%. 3. Хроматография по сродству (Колонка С). Продукт с колонки В хроматографировали затем с использованием Sephacryl S-400 (Pharmacia) (Колонка С). Эта стадия способствует обмену буфера и добавленного препарата, а также помогает в соответствующем инактивировании/удалении вирусных загрязняющих примесей. Буферы колонки С состоят из Буфера С1: уравновешивающий буфер (20мМ НСl, 19% EtOH), Буфера С2: промывочный буфер (20мМ НСl), Буфера С3: буфер для элюции и хранения (200мМ глицина, стерильно фильтрованного) и Буфера С4: десорбционный буфер (0,1 N NaOH). Нижеследующие рабочие параметры данной колонки являются подходящими для колоночного объема 10л. Не более, чем 20г rDSPA a1 можно нагрузить на данную колонку для одного цикла хроматографирования. Данную колонку нагружали при скорости потока не более, чем 0,5л/мин и не более, чем при 15psi (103,425кПа) колоночного давления. Элюаты, полученные из одной или нескольких колонок В, объединяли, затем разбавляли элюат одной частью Буфера С2 и двумя частями Буфера 5. Конечная концентрация этанола составляла приблизительно 19%. Перед загрузкой данную колонку уравновешивали не менее, чем 15 литрами Буфера С1, до тех пор, пока вытекающий из нее поток не имел рН 1,80 (±0,20). После загрузки данную колонку промывали не менее, чем 30 литрами Буфера С2. Колонка является основательно промытой, когда получаемый УФ-сигнал является стабильным. Продукт элюировали с колонки не менее, чем 20 литрами Буфера С3 и собирали в отдельный сосуд. Элюцию продолжали до тех пор, пока не достигали стабильной нулевой УФ-линии. После элюции продукта колонку десорбировали не менее, чем 12 литрами Буфера С4 хранили до повторного использования, не превышающего 20 циклов. Соответствуюпщй продукт (или элюат) с колонки С разбавляли Буфером С до концентрации < 1мг в мл и хранили для дальнейшего процессирования. Выход rDSPA a1 в среднем составил 97%, а чистота (белка) из данного элюата составила в среднем 98%. Стадии концентрирования и приготовления лекарственного препарата следовали за окончанием стадий очистки и осуществлялись на элюате аффинной колонки S-400, которую сохраняли не более, чем 70 дней. Элюаты колонки С объединяли и концентрировали при помощи спирально навивной (spiral wound) ультрафильтращонной мембраны, которая удаляет низкомолекулярные вещества (30000 дальтонная отсечка). Данный продукт собирали в апирогенную емкость в концентрации более, чем 8мг/мл. Добавляли маннитол до конечной концентрации 4%. Добавляли конечный рецептурный буфер (200мМ глицин, 4% маннитол (в/о)) для доведения массы рецептурного продукта до 7,5мг/мл. Затем полученный объем рецептурного продукта стерильно фильтровали, расфасовывали во флаконы и лиофилизировали.
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for production of rdspa a1
Назва патенту російськоюСпособ получения rdspa a1
МПК / Мітки
Мітки: одержання, rdspa, спосіб
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/8-62925-sposib-oderzhannya-rdspa-a1.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб одержання rdspa a1</a>
Попередній патент: Спосіб формування кукси дванадцятипалої кишки
Наступний патент: Спосіб лікування або профілактики інтерстиціального циститу та фармацевтична композиція, яка містить дулоксетин для його лікування
Випадковий патент: Мікроструктурний спосіб контролю якості м`ясної сировини у фаршах для пельменів