Спосіб диференціювання стовбурових клітин в кардіоміоцити

Реферат: Спосіб диференціювання стовбурових клітин в кардіоміоцити, який включає формування ембріоїдних тілець шляхом культивування стовбурових клітин в СО2-інкубаторі з додаванням середовища диференціювання; подальше культивування отриманих ембріоїдних тілець у середовищі диференціювання з додаванням циклоспорину, як індуктора диференціювання; подальше культивування ембріоїдних тілець у зміненому середовищі без додавання індуктора та підрахунок отриманих ембріоїдних тілець. Формування ембріоїдних тілець здійснюють шляхом культивування плюрипотентних стовбурових клітин, отриманих різними методами, в суспензійній культурі на шейкері із постійним горизонтальним перемішуванням. Додавання індуктора до диференційного середовища здійснюють не раніше четвертої доби формування ембріоїдних тілець і продовжують культивування протягом не менше 120 годин. Здійснюють подальше культивування ембріоїдних тілець у заміненому середовищі без додавання індуктора протягом не менше семи діб. UA 75876 U (12) UA 75876 U UA 75876 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі клітинної біології, біотехнології та медицини, і може бути використана в лабораторіях клітинного культивування та у кардіологічних відділеннях для лікування захворювань серця. Зокрема, стосується методів отримання кардіоміоцитів шляхом диференціювання клітин, закладених у ембріоїдні тільця, в клітини серця, із застосуванням циклоспорину як індуктора диференціювання, для подальшого застосування клітин серця для трансплантації та дослідження процесів регенерації серцевого м'яза. На сьогодні одним з найрозповсюдженіших методів отримання кардіоміоцитів є диференціювання в клітини серця ембріоїдних тілець (ЕТ) методом "висячої краплі". Так, у публікації Nishikawa S.-I., Jakt L.M., Er T. Embryonicstem-cell culture as a tool for developmental cell biology // Naturereviews. - 2007. - Vol. 8. - pp. 503-507, метод "висячої краплі" був названий стандартним методом диференціювання ЕСК людини та миші. У публікації Singla D. Embryonic stem cells in cardiac repair and regeneration // Antioxid Redox Signal-2009. - Vol. 11 (8). - PP. 1857-1863, зазначено, що ембріоїдні тільця це агрегати ЕСК, які найчастіше отримують методом "висячої краплі". Всередині ембріоїдного тільця можуть утворюватись клітини всіх трьох зародкових шарів, а також три основні типи клітин серця. Однак, в процесі диференціювання in vitro утворюється не більше 1-5 % кардіоміоцитів. До того ж, метод "висячої краплі" є трудомістким і не придатним для отримання кардіоміоцитів в великих кількостях, необхідних для подальшого застосування клітин серця для трансплантації. Відомо, що застосування факторів, що сприяють диференціюванню в кардіоміоцитарному напрямку (індукторів диференціювання) може збільшити кількість клітин серця в кожному окремому ембріоїдному тільці. Так, відомий спосіб диференціювання ембріональних стовбурових клітин (ЕСК) методом "висячої краплі", у якому використовували як індуктор циклоспорин (Sachinidis A. Identification of small signalling molecules promoting cardiac-spesific differentiation of mouse embryonic stem cell // Cellular Physiology and Biochemistry - 2006. - Vol. 18. - P. 303-314). Як відомо, циклоспорин це циклічний пептид, який застосовують як імуносупресант під час трансплантації шкіри, серця, нирок, кісткового мозку, легенів та інших органів. Він пригнічує розвиток клітинних реакцій щодо алотрансплантата, реакції гіперчутливості уповільненого типу, хворобу "трансплантат проти "хазяїна"" (ХТПХ) і залежне від Т-лімфоцитів утворення антитіл. Також циклоспорин впливає на внутрішньоклітинний кальцій який, запускаючи сигнальні каскади в цитозолі, впливає на процес диференціювання кардіоміоцитів з ЕСК. Комплекс утворений між циклоспорином А та циклофіліном А всередині клітини інгібує кальцій- та кальмодулін-залежну протеїн фосфатазу 2В. Важливою властивістю циклоспорину є його вплив на білки родини NF/AT, які регулюють утворення судин серця. Під час експериментів з трансплантацією очищених кардіоміоцитів в уражені серця мишей, було виявлено, що в експериментах, де застосовували циклоспорин для імуносупресії, кардіоміоцити краще виживали, і збільшувалась кількість клітин, що скорочуються. Тому, для цілей диференціювання в кардіоміоцитарному напрямку застосування саме циклоспорину, як індуктора, є виправданим та ефективним, як показали результати досліджень авторів публікації, і які були підтверджені дослідженнями авторів заявленої корисної моделі. Згідно з відомим способом, що вибраний авторами заявленого способу як прототип, сформовані висячі краплі, розміром 500 клітин у 20 л, розміщували на планшеті (або в чашках Петрі) і культивували в СО2-інкубаторі 2 дні з використанням середовища диференціювання. Циклоспорин додавали з третього дня формування ЕТ, протягом 48 годин. Після чого, здійснювали подальше культивування ЕТ без додавання індуктора протягом шести діб. Кількість утворених клітин серця визначали методом спектрофотометрії та флюоресцентної мікроскопії. Авторами цього методу було зазначено, що під час диференціювання з додаванням циклоспорину інтенсивність флюоресценції становила 140 % в порівнянні з умовами без його застосування. Кількість отриманих за таким способом ЕТ є обмеженою і складала: 96 на одну 96-лункову планшету або 120-150 на одну 10 см чашку Петрі. Тобто, спосіб стимуляції процесу диференціювання за допомогою циклоспорину, дозволив збільшити кількість клітин серця в кожному окремому ембріоїдному тільці. Однак отримана кількість клітин все одно є недостатньою, адже відомий спосіб також має обмеження в кількості утворених клітин. Окрім цього недоліку, такий спосіб, що оснований на методі "висячої краплі" також є трудомістким, та дещо обмеженим щодо можливостей його застосування. 1 UA 75876 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Так, у відповідності з цим способом, для диференціювання в кардіоміоцити використовували лише ембріональні стовбурові клітини (ЕСК). Дійсно, використання цих клітин для отримання кардіоміоцитів є цілком виправданим, оскільки їх важливою властивістю є плюрипотентність. В процесі диференціювання вони можуть дати початок клітинам будь-якого з трьох типів зародкових шарів. Однак, отримати ЕСК можна лише з ембріонів певного віку знищивши їх, і які під час трансплантації будуть сприйматись організмом як чужорідні клітини. Тому, проблема імуносумісності клітинних трансплантатів, отриманих відомим способом, не вирішується остаточно. Задачею корисної моделі є підвищення ефективності способу диференціювання стовбурових клітин в кардіоміоцити, щодо збільшення їх кількості, при одночасному спрощенні способу та розширенні можливостей його застосування. Зазначена задача вирішується тим, що спосіб диференціювання стовбурових клітин в кардіоміоцити, включає формування ембріоїдних тілець (ЕТ) шляхом культивування стовбурових клітин в СО2-інкубаторі з додаванням середовища диференціювання; подальше культивування отриманих ЕТ у середовищі диференціювання з додаванням циклоспорину, як індуктора диференціювання; подальше культивування ЕТ у зміненому середовищі без додавання індуктора та підрахунок отриманих ЕТ. Згідно з заявленою корисною моделлю, формування ЕТ здійснюють шляхом культивування плюрипотентних стовбурових клітин, отриманих різними методами, в суспензійній культурі на шейкері із постійним горизонтальним перемішуванням, а додавання індуктора до диференційного середовища здійснюють не раніше четвертої доби формування ЕТ і продовжують культивування протягом не менше 120 годин. Після чого, здійснюють подальше культивування ЕТ у заміненому середовищі без додавання індуктора протягом не менше семи діб. При цьому: -3 - циклоспорин додають у середовище диференціювання у співвідношенні 10 : 1; - як плюрипотентні стовбурові клітини використовують отримані класичним методом ембріональні стовбурові клітини та/або отримані класичним методом індуковані стовбурові клітини, та/або індуковані стовбурові клітини, отримані за допомогою системи транспозонів; - кількість утворених клітин серця визначають методом їх виявлення під флюоресцентним мікроскопом і вимірювання методом проточної цитофлюорометрії. Тобто, згідно з заявленим способом, авторами використаний менш трудомісткий, на відміну від методу "висячої краплі", метод формування ЕТ шляхом культивування стовбурових клітин в суспензійній культурі на шейкері з постійним горизонтальним перемішуванням. При цьому виявилося, як показано нижче, що застосування циклоспорину як індуктора подальшого диференціювання таких ЕТ, дозволило отримати кількість кардіоміоцитів, яка в десятки разів перевищує їх максимальну кількість, яку можливо отримати методом "висячої краплі". Додатково виявилося, що заявлений період застосування циклоспорину та його концентрація відносно до середовища диференціювання, також сприяли підвищенню ефективності диференціювання щодо отримання кардіоміоцитів у великих кількостях. Додатково, проведені авторами заявленої корисної моделі дослідження, виявили, що заявлений спосіб ефективно сприяє диференціюванню в кардіоміоцити не тільки плюрипотентних ЕСК, а й індукованих плюрипотентних стовбурових клітин. Тобто, використання циклоспорину. як індуктора диференціювання, згідно з заявленим способом. Є ефективним незалежно від методу отримання плюрипотентних клітинних ліній, що значно поширює можливості застосування заявленого способу. Перевагою застосування у заявленому способі для підрахунку кількості утворених кардіоміоцитів методу проточної цитофлюорометрії, у порівнянні із методом спектрофотометрії у прототипі, є можливість визначити інтенсивність флюоресценції кожної окремої клітини і підрахувати їх кількість. Тоді, як за допомогою спектрофотометра можна виміряти інтенсивність флюоресценції всього об'єму речовини. Отже метод проточної цитофлюорометрії забезпечує точний підрахунок клітин, тобто, дає можливість з більшою точністю визначити кількість отриманих кардіоміоцитів, що також підвищує ефективність заявленого способу в цілому. Таким чином, зазначені ознаки заявленого способу отримання кардіоміоцитів є необхідними і достатніми для досягнення поставленої задачі корисної моделі. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Як стовбурові клітини, для можливості порівняльного аналізу ефективності заявленого способу, використовують декілька плюрипотентних клітинних ліній, отриманих різними методами: 2 UA 75876 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - лінія генетично модифікованих ембріональних плюрипотентних стовбурових клітин PІG44. отриманих із бластоцисти миші; - лінія генетично модифікованих індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (ІПСК) миші АТ25, отриманих класичним методом за допомогою індукції ретровірусами; - лінії індукованих плюрипотентних стовбурових клітин миші mTiPSC (клони 7 і 9), отриманих внаслідок репрограмування мишиних ембріональних фібробластів (МЕФ) лінії мишей c57B16/N за допомогою системи транспозонів. Лінії ІПСК миші АТ25 були отримані методом, розробленим Ш. Яманака і який вважається класичним і був вперше оприлюднений у статті К. Takahashi, S. Yamanaka "Induction of plurіpotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors" 2006, Cell, Vol. 126(4), P. 663-676. Дві лінії ІПСК - mTiPSCs (mTiPSCs-murine Transposon-induced pluripotent stem cells) клони 9 та 7 - були отримані за допомогою застосування сконструйованої на основі мобільних генетичних елементів системи Sleeping Beauty (розробники системи Z. Iviсs та S. Izsvac. MaxDelbruk Centre for Molecular Medicine. Berlin. Germany). Саме вона забезпечувала інтродукцію факторів плюрипотентності в геном мишиних ембріональних фібробластів. Ця система поєднує в собі ефективність вірусних систем і безпечність невірусних систем доставки генетичної інформації. Більш докладний опис методу отримання цих ліній не є предметом висвітлення в межах даної заявки, оскільки основною задачею заявленої корисної моделі є підтвердження універсальності способу шляхом вивчення ефективності диференціювання кардіоміоцитів декількох клітинних ліній, отриманих різними методами. Одноклітинну суспензію зазначених недиференційованих клітин ліній ЕСК або ІПСК в 6 розрахунку 1×10 клітин розливають в неадгезивні чашки Петрі (14 мл середовища диференціювання на 10 см чашку Петрі) і залишають для формування ембріоїдних тілець в СО2-інкубатор за температури 37 °C на шейкері з постійним горизонтальним переміщуванням на одну добу. Середовище диференціювання, яке використовують теж саме для всіх ліній клітин, складається із середовища ІМДМ (IMDM Iscove's modified Dulbecco's medium, Invitrogen, Germany), до якого додають 20 % фетальну бичачу сироватку, 1х незамінні амінокислоти, 50 М 2-меркаптоетанол. На другий день підраховують кількість ЕТ, що утворились, і розподіляють їх в нових чашках Петрі з розрахунку 2000 ЕТ на одну 10 см чашку Петрі та 14 мл середовища диференціювання, і залишають в СО2-інкубаторі на шейкері з постійним горизонтальним переміщуванням на три доби. На четверту добу формування ембріоїдних тілець додають циклоспорин в об'ємі 14 мкл циклоспорину, розведеного в ДМСО (диметилсульфоксид DMSO, Sigma, Germany), концентрацією 10 мМ, на 14 мл середовища диференціювання, і продовжують культивування впродовж 5 діб (120 годин). Період застосування циклоспорину як індуктора є принципово важливим для підвищення ефективності диференціювання, який приводить до збільшення кількості отриманих клітин серця. Для встановлення оптимального періоду, згідно із заявленим способом, були перевірені три схеми застосування циклоспорину (для всіх плюрипотентних клітинних ліній): - перша схема: за три дні до початку формування ЕТ і до третього дня формування; - друга: з першого дня формування ЕТ до третього дня формування ЕТ; - третя: з четвертого дня до 9-го дня культивування ЕТ. Під час застосування першої та другоїсхеми дослідів спостерігалося пригнічення диференціювання в кардіоміоцитарному напрямку. А застосування циклоспорину за третьою схемою майже вдвічі збільшувало кількість отриманих клітин серця. Під час додавання циклоспорину до ЕСК на дев'ятий день диференціювання утворювалось в 1,74 разу більше кардіоміоцитів в порівнянні з контролем, на 11-ий день диференціювання отримали в 1,5 разу більше кардіоміоцитів, а на 13-ий день різниця становила в 1,9 разу більше ніж за відсутності фактора. Додавання циклоспорину до ІПСК, отриманих класичним методом, також стимулювало утворення кардіоміоцитів, однак різниця в середньому була більшою лише в півтора разу. Так на 9-ий день диференціювання вона становила 1,5 разу, на 11-ий день - 1,64, а на 13-ий день 1,54. Максимальний рівень отриманих GFP+ клітин спостерігали на одинадцятий день і він становив 2,4 % в порівнянні з контрольним рівнем який становив 1,46 %. 3 UA 75876 U 5 10 15 Для ліній ІПСК, отриманих за допомогою транспозонів mTiPSC клона 7 різниця становила 1,33 на 11-ий день формування ЕТ. 1,79 на 13-ий день, 2,4 разу на 15-ий день. А для клона 9 відбувалось збільшення кількості кардіоміоцитів в 1,55 разу на 9 день культивування, в 2,47 разу на 11-ий день, в 2,47 разу на 13 день, і в 2,89 разу на 15-ий день культивування. Тобто додавання циклоспорину до середовища культивування на 4-ий день формування ЕТ та більш тривалий час перебування індуктора в середовищі диференціювання, згідно із заявленим способом, сприяв більш активному диференціюванню плюрипотентних клітин в клітини серця. На 9-ту добу, згідно із заявленим способом, змінюють середовище культивування (без додавання циклоспорину) і продовжують культивування протягом щонайменше 7-ми діб, здійснюючи підрахунок отриманих кардіоміоцитів, як правило, кожної другої доби. Експериментально, згідно із заявленим способом, підрахунок отриманих кардіоміоцитів здійснювали на 9-й, 11-й, 13-й, 15-й, 17-й добу культивування. Дані щодо підрахунку отриманих кардіоміоцитів у зазначені дні строку культивування всіх використаних, згідно з заявленим способом, плюрипотентних стовбурових клітин, зведені у нижченаведену таблицю: Таблиця Найменування клітинних ліній ЕСК PIG44 ІПСК АТ25 mTiPSC клон 7 mTiPSC кипи 9 20 25 30 35 Спосіб культивування Без додавання циклоспорину З додаванням циклоспорину Без додавання циклоспорину З додаванням циклоспорину Без додавання циклоспорину З додаванням циклоспорину Без додавання циклоспорину З додаванням циклоспорину День 9 Період культивування День 11 День 13 День 1 5 День 17 1,15 % 3,06 % 1,49 % 0,90 % 0,61 % 2,00 % 4,59 % 2,84 % 1,98 % 1,40 % 1,05 % 1,46 % 1,04 % 0,81 % 0,68 % 1,58 % 2,4 % 1,6 % 1,32 % 1,01 % 0,00 % 1,20 % 0,70 % 0,25 % 0,15 % 0,30 % 1,60 % 1.25 % 0,60 % 0,30 % 0,10 % 1,65 % 0,95 % 0,45 % 0,23 % 0,50 % 2,55 % 2,35 % 1,30 % 0,45 % Із наведених у таблиці даних очевидно, що максимальна кількість утворених кардіоміоцитів спостерігається переважно на 11-й день, потім їх кількість починає спадати. Проведені надалі вимірювання до 17-го дня культивування підтвердили, що ця тенденція зберігається. Тобто, максимально ефективним заявлений спосіб є саме у заявлений період культивування ЕТ у середовищі з додаванням індуктора, і подальшого їх культивування у живильному середовищі без нього. Кількість утворених клітин серця визначають методом проточної цитофлюорометрії та під флюорисцентним мікроскопом. Ідентифікувати кардіоміоцити у популяції всіх клітин можливо за зміною експресії генів, які відіграють важливу роль в процесах кардіогенезу, серед них МНС, сТnТ, GATA4 та 6, Nkx-2,5. Для того щоб візуалізувати наявність цих маркерів і спостерігати за прижиттєвим розвитком диференційованих кардіоміоцитів клітинні лінії ембріональних стовбурових клітин -PIG44 та індукованих плюрипотентних стовбурових клітин АТ25, генетично модифікують так, щоб разом з експресією вибраних генів відбувалась і експресія білка, наявність якого спостерігали під флюорисцентним мікроскопом і вимірювали методом проточної цитофлюорометрії. Як такий білок використовували зелений флюоресцентний протеїн eGFP. Для визначення ефективності впливу циклоспорину на процес диференціювання в лініях без генетичної модифікації (mTiPSCs клони 7 та 9) проводили підрахунок ЕТ, що скорочуються. Результати проведених досліджень, згідно з заявленим способом диференціювання стовбурових клітин, показали, що: - кількість GFP+ клітин, утворених з ембріональних стовбурових клітин під час застосування циклоспорину за заявленою схемою, була вдвічі більша ніж без нього; 4 UA 75876 U 5 10 15 20 25 30 35 - ефективність застосування даного методу для диференціювання лінії ІПСК миші АТ25 без додавання циклоспорину була найменшою. Додавання циклоспорину в півтора разу збільшило утворення GFP+ клітин в порівнянні з умовами без його застосування; - додавання циклоспорину в середовище диференціювання ліній ІПСК, отриманих за допомогою транспозонів, збільшувало кількість отриманих кардіоміоцитів в 1,9 разу для лінії mTiPSC клон 7 та в 2,2 разу для лінії mTiPSC клон 9 в порівнянні з культивуванням без додавання циклоспорину; - кількість ЕТ, отриманих з плюрипотентних стовбурових клітин шляхом їх культивування в СО2-інкубаторі з додаванням середовища диференціювання (у відповідності із заявленим способом), складала 15000 20000 на одну 10 см чашку Петрі, що в десятки разів перевищувало кількість ЕТ, отриманих з ембріональних стовбурових клітин методом "висячої краплі" (у відповідності із способом-прототипом), яка складала 120-150 ЕТ на одну 10 см чашку Петрі. Таким чином, отримані результати підтвердили перевагу заявленого способу диференціювання стовбурових клітин в кардіоміоцити за допомогою застосування циклоспорину, який полягає у забезпеченні можливості отримання значно більшої кількості клітин серця, у порівнянні із способом-прототипом, при одночасному зменшенні його трудомісткості. Отримані результати також підтвердили, що циклоспорин є ефективним індуктором процесу диференціювання стовбурових клітин, незалежно від способу отримання плюрипотентних клітинних ліній. Тобто, його дія як індуктора не є специфічною для лише одного типу плюрипотентних клітин - ЕСК, як показано у способі-прототипі. Можливість застосування циклоспорину також для стимуляції процесу диференціювання індукованих плюрипотентних стовбурових клітин, у відповідності із заявленим способом, дозволить отримувати аутологічні (власні клітини пацієнта) плюрипотентні стовбурові клітини, необхідні для трансплантації, які не викликатимуть імунної відповіді організму, і які під час трансплантації не будуть сприйматись організмом як чужорідні клітини. Крім того, ця стратегія може бути використана для створення ліній стовбурових клітин, які могли би бути унікальним джерелом при дослідженні генетичних механізмів розвитку захворювання, дії препаратів та біології регенераційного процесу. В свою чергу запропонований спосіб диференціювання плюрипотентних клітин в кардіоміоцити дозволить забезпечити не лише необхідну для трансплантації кількість клітин, а й надасть можливість провести дослідження на тваринних моделях, які дадуть відповіді на такі важливі питання як пошук оптимального шляху доставки кардіоміоцитів, визначення оптимальної кількості клітин, необхідних для трансплантації, перевірити чи відбувається інтеграція клітин в серцевий м'яз і чи будуть вони скорочуватись в унісон зі здоровими міокардіоцитами, чи не будуть спричиняти аритмії, якщо кардіоміоцити потраплять в інший орган, то чи не будуть вони спричиняти там пошкодження. Це в свою чергу вдосконалить дослідження процесів регенерації та репарації серцевого м'яза і сприятиме застосуванню методів регенеративної медицини в клінічній практиці для лікування захворювань серця. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 55 60 1. Спосіб диференціювання стовбурових клітин в кардіоміоцити, який включає формування ембріоїдних тілець шляхом культивування стовбурових клітин в СО2-інкубаторі з додаванням середовища диференціювання; подальше культивування отриманих ембріоїдних тілець у середовищі диференціювання з додаванням циклоспорину як індуктора диференціювання; подальше культивування ембріоїдних тілець у зміненому середовищі без додавання індуктора та підрахунок отриманих ембріоїдних тілець, який відрізняється тим, що формування ембріоїдних тілець здійснюють шляхом культивування плюрипотентних стовбурових клітин, отриманих різними методами, в суспензійній культурі на шейкері із постійним горизонтальним перемішуванням, а додавання індуктора до диференційного середовища здійснюють не раніше четвертої доби формування ембріоїдних тілець і продовжують культивування протягом не менше 120 годин, після чого здійснюють подальше культивування ембріоїдних тілець у заміненому середовищі без додавання індуктора протягом не менше семи діб. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що циклоспорин додають у середовище -3 диференціювання у співвідношенні 10 :1. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що як плюрипотентні стовбурові клітини використовують отримані класичним методом ембріональні стовбурові клітини та/або отримані класичним методом індуковані стовбурові клітини, та/або індуковані стовбурові клітини, отримані за допомогою системи транспозонів. 5 UA 75876 U 4. Спосіб за одним з пп. 1-3, який відрізняється тим, що кількість утворених клітин серця визначають методом їх виявлення під флюоресцентним мікроскопом і вимірювання методом проточної цитофлюорометрії. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6