Спосіб одержання й очищення поксвірусів з інфікованих клітин

1. Спосіб виділення поксвірусу з інфікованих клітин, що включає стадію гомогенізації інфікованих клітин при високому тиску для одержання гомогенату, що містить поксвірус. 2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що поксвірус вибрано з групи, яка включає orthopoxviruses, avipoxviruses, suipoxviruses та capripoxviruses. 3. Спосіб за будь-яким з пп.1, 2, який відрізняється тим, що поксвірус вибрано з групи, яка включає вірус коров'ячої віспи, вірус віспи кіз, вірус віспи овець, вірус віспи канарок та вірус віспи свійської птиці. 4. Спосіб за п.3, який відрізняється тим, що вірусом коров'ячої віспи є штам Elstree або модифікований штам вірусу коров'ячої віспи Анкара (MVA), зокрема MVA-BN із депозитним номером ЕСАСС V00083008. 5. Спосіб за будь-яким з пп.1-4, який відрізняється тим, що поксвірус є рекомбінантним поксвірусом. 6. Спосіб за будь-яким з пп.1-5, який відрізняється тим, що гомогенізацію при високому тиску виконують шляхом введення інфікованих клітин в камеру високого тиску, збільшенням тиску в камері й виведенням інфікованих клітин через сопло. 2 (19) 1 3 77735 Даний винахід відноситься до способу одержання поксвірусів, зокрема модифікованого вірусу коров'ячої віспи Анкара (MVA), з інфікованих клітин. Згідно даного винаходу інфіковані клітини піддаються гомогенізації високим тиском для одержання вірусовмісного гомогенату. Вірусовмісний гомогенат може бути підданий принаймні одній стадії очищення для одержання фракції збагаченої на поксвірус. Винахід також відноситься до вірусовмісної фракції та вірусовмісного гомогенату одержаного методом згідно даного винаходу. Poxviridae являє собою велике сімейство ДНКвірусів, котрі реплікуються в цитоплазмі клітин хребетних та безхребетних. Сімейство Poxviridae може бути поділене на підсімейства Chordopoxvirinae (поксвіруси хребетних) та Entomopoxvirinae (поксвіруси комах). Chordopoxvirinae налічує декілька поксвірусів тварин (класифіковані в декілька родів) які мають велике економічне значення, такі як поксвіруси верблюда, поксвіруси вівці, козячі поксвіруси, авіпоксвіруси або поксвіруси птахів. Існ ують ослаблені вакцини з живими або інактивованими вірусами для вакцинації свійських тварин від овечих або козячих поксвірусів. Для вакцинації птахів були розроблені рекомбінантні вакцини в яких пташиний поксвірус використано як вектор. Оскільки пташиний поксвірус інфікує людські клітини, можна передбачати те, що він може бути використаний як вектор для експресії гетерологічних генів у людей і викликати відповідні імунні відповіді. Поксвіруси птахів, які містять в своєму геномі гени ВІЛу описані в патентах US 5,736,368 та US 6,051,410. У людей вірус віспи, член роду Orthopoxvirus, був найбільш важливим поксвірусом. Вірус коров'ячої віспи, також член родини Poxviridae, використовувався як жива вакцина для імунізації від віспи. Успішна всесвітня вакцинація вірусом коров'ячої віспи досягла кульмінації у викоріненні вірусу віспи [The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication; History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980]. Після цієї заяви ВОЗ, вакцинація була припинена на багато років за виключенням людей із високим ризиком інфікування поксвірусом (наприклад, лабораторні працівники). Програми вакцинації знову набули актуальності з огляду на ризик використання вірусу віспи у біологічній війні або з біотерористами. Останнім часом, вірус коров'ячої віспи також був використаний для створення вірусних векторів для експресії рекомбінантних векторів та потенційно для використання як рекомбінантні живі вакцини [Mackett, M., Smith, G. L. and Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79,7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. and Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2,383-407]. Це було пов'язано з тим, що за допомогою методу рекомбінації ДНК в геном вірусу коров'ячої віспи були введені послідовності ДНК (гени), які кодують чужорідні антигени. Якщо ген інтегровано в ділянку вірусної ДНК, котра не є життєво важливою для життєвого циклу вірусу, може так статися, що новопродуковані рекомбінантні віруси коров'ячої віспи будуть інфек 4 ційними, що каже про їхню здатність інфікувати інші клітини й таким чином експресувати інтегровану послідовність ДНК [патентні заявки ЕР 83286 та 110385]. Рекомбінантні віруси коров'ячої віспи одержані таким чином, можуть бути використані з одного боку як живі вакцини для профілактики інфекційних захворювань, з іншого боку, для виготовлення гетерологічних протеїнів в еукаріотичних клітинах. Використання вірусу коров'ячої віспи як вектора для створення рекомбінантних живих вакцин було під впливом заходів безпеки та регулювання. Більшість рекомбінантних вірусів коров'ячої віспи, описаних в літературі засновані на Західному Резервному штамі вірусу коров'ячої віспи. Відомо, що цей штам має високу нейровірулентність й, таким чином, мало придатний для використання на людях і тваринах [Morita etal., Vaccine 5,65-70 [1987]]. З іншого боку, модифікований вірус коров'ячої віспи Анкара (MVA) є відомим як виключно безпечний. MVA був одержаний довготривалими послідовними пасажами штаму Анкара вірусу коров'ячої віспи (CVA) на курячих ембріофібробластах [для огляду див. Ма уr, A.,Hochstein-Mintzel, V. та Stickl, Η. [1975] Infection 3,6-14; СН568,392]. Зразками штамів вірусу MVA, які депоновано у відповідності із вимогами Будапештської угоди є штами MVA 572, MVA 575 та MVA-BN, які депоновано в Європейській Колекції Тваринних Клітинних Культур (ЕСАСС), Салісбері (UK) під депозитними номерами ЕСАСС V94012707, ЕСАСС V00120707 та ЕСАСС V00083008, відповідно. MVA є відомим своїми значною ослабленістю що визначається його низькою вірулентністю або інфекційністю при збереженні гарної імуногенності. Вірус MVA був досліджений для визначення змін в геномі порівняно зі штамом CVA природного типу. Було визначено шість основних делецій в геномній ДНК (делеції І, II, III, IV, V, та VI) які разом мають 31000 пар основ [Meyer, Η., Sutter, G. and Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72,1031-1038]. Одержаний вірус MVA стає жорстко обмеженим за клітиною-хазяїном до клітин птахів. Також, MVA характеризується своєю надзвичайною ослабленістю. При тестуванні на різноманітних тваринних моделях було доведено його вірулентність лише у імунопригнічених тварин. Більш важливим є те, що відмінні якості штаму MVA було показано при широких клінічних випробуваннях [Ma yr et al., Zbl. Bakt. Hyg. l, Abt. Org. В 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99,2386-2392 [1974]]. Під час цих досліджень на більш ніж 120тис. людей, включаючи пацієнтів високого ризику, не було виявлено жодних побічних ефектів пов'язаних із використанням вакцини MVA. Вже створений та використовується в клінічних дослідженнях рекомбінантний MVA, придатний для використання як вакцина. У WO 98/13500 описується рекомбінантний MVA, який містить й здатний експресувати одну чи більше ДНК послідовностей, що кодують антигени вірусу тропічної лихоманки. Чужорідні послідовності ДНК були рекомбіновані у вірусн у ДНК у сайт делеції, що природно трапляється в геномі MVA. Перед використанням поксвірусів або рекомбінантних поксвірусів для вакцинації необхідно 5 77735 6 очистити вірус до певної міри для відповідності комбінантних Saccharomyces cerevisiae [Milburn регуляторним вимогам. Традиційний шлях для andDunnill (1994) Biotechnology and Bioengineering очищення поксвірусів, зокрема MVA та рекомбіна44,736-744] та для продукування й очищення адентного MVA, є наступним: на першій стадії культиновірусних векторів [US 6194191]. ВПЧ й аденовівують клітини сприйнятливі до інфекції відповідруси є безоболонковими та більш малими й просним поксвірусом. У випадку MVA сприйнятливими тішими вірусами, котрі, таким чином, схожі на клітинами є такі як фібробласти курячого ембріону. клітинні протеїнові структури. От чому, не є дивСприйнятливі клітини інфікують поксвірусом і ним, що гомогенізація високим тиском, котра є культивують на протязі часу, достатнього для гепридатною для виділення протеїнів з клітин також нерування вірусного продукту. Потім клітини замоможе використовуватися для виділення аденовірожують й розморожують для того, щоб відділити русів ВПЧ з еукаріотичних клітин. В протилежність клітини з культуральної вірусної поверхні та для цьому, внутрішньоклітинні зрілі віріони поксвірусу часткового руйнування клітин. Суміш інтактних та мають дуже складну структур у, котра, між іншим, зруйнованих клітин відцентрифуговується. Для включає ліпідну мембрану [IMV, див. нижче, див. одержання гомогенату використовується ультраFields et al., Fields Virology, 1996, Lippincott-Raven звук. Вірус виділяють з гомогенату центрифугуpublishers, Philadelphia, USA, ISBN 0-7817-0253-4, ванням на сахарозній підкладці [Joklik WK. "The chapter 83, pages 2654-5]. Морфологія й фізичні purification of four strains of poxvirus" Virology 1962; властивості поксвірусу IMV у деяких аспектах дуже 18: 9-18]. Ключовою стадією в цьому процесі є сильно схожа до морфології й фізичних властивогомогенізація із застосуванням ультразвуку стей клітини ніж до безоболонкових вірусів. От [Hedstrom, К. G. and Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. чому, було очікуваним, що умови для руйнування 1969 137: 421-430; Stickl, H., Korb, W. and клітин гомогенізацією високим тиском також приHochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), зведуть до руйнування поксвірусів. Таким чином, 215,38-50]. В промислових процесах було б бажанеочікуваним результатом стало те, що гомогеніним, щоб усі стадії процесу були б легко контрозація високим тиском руйнує клітини але лишає льованими й відтворюваними. Однак, недолікомнеушкодженими достатню кількість поксвірусів, які використання ультразвуку для гомогенізації вірусв подальшому можуть бути очищені. Іншими слоно-клітинної суспензії є те, що ультразвукова ставами, не можна було припустити, що гомогенізація дія є складною для ідентичного відтворення, склависоким тиском могла застосовуватися як метод дною для пристосування та складним є також одержання поксвірусів з інфікованих клітин. Дійсмасштабувати лабораторний процес у промислоно, відомим методом для одержання поксвірусів з вий. інфікованих клітин є використання ультразвуку для Отже, суттю винаходу є створення методу гомогенізації, котрий є більш м'яким шляхом гомоодержання поксвірусів, зокрема вірусів коров'ячої генізації. віспи, такого як штам MVA, з клітин інфікованих На відміну від способів одержання, котрі викопоксвірусом, при якому гомогенізація інфікованих ристовують ультразвук, є спосіб за даним винахоклітин є відтворюваною, легко контрольованою й дом, що дозволяє відтворювано гомогенізувати дозволяє перейти від масштабів лабораторії до інфіковані клітини; спосіб є легко контрольованим і масштабів промисловості. його легко розвинути від лабораторних до промиДаний винахід відноситься до способу одерслових масштабів. жання поксвірусів, зокрема вірусу коров'ячої віспи, В контексті даного винаходу термін "поксвірус" такого як штам Elstree чи модифікований вірус відноситься до будь-яких вірусів, що належать до коров'ячої віспи Ankara (MVA), з інфікованих кліродини Poxviridae. Спосіб згідно даного винаходу тин. Спосіб, згідно даного винаходу, спрямований переважно проводиться із представниками на одержання поксвірусу з інфікованих клітин та Poxviridae підсімейства chordopoxvirinae, більш включає стадію обробки інфікованих клітин гомопереважно родів orthopoxvirus, avipoxvirus, генізацією високим тиском для одержання поксвіcapripoxvirus та suipoxvirus. Найбільш переважно, рус-вмісного гомогенізату. винахід стосується способу одержання й очищенБуло неочікуваним те, що інтактні й інфіковані ня поксвірусів з групи, яка складається з вірусу поксвіруси можуть бути одержані способом згідно коров'ячої віспи, козячого поксвірусу, овечого поданого винаходу. Гомогенізація високим тиском є ксвірусу, канарейкового поксвірусу та пташиного загально застосовною для руйнування клітинних й поксвірусу. Зокрема бажаним є вірус коров'ячої субклітинних стр уктур для виділення протеїнів чи віспи. Прикладами штамів коров'ячої віспи, виколіпідів з еукаріотичних чи прокаріотичних клітин. В ристаними в способі за даним винаходом є штами US 3983008 описується спосіб екстрагування коElstree, Wyeth, Copenhagen, Temple of Heaven, рисних компонентів з мікробних клітин за допомоNYCBH, Western Reserve. Винахід не є обмеженим гою гомогенізації високим тиском. Екстраговані до цих спеціально зазначених штамів вір усу короречовини були дріжджовими протеїнами, бактерів'ячої віспи, але може бути застосований з будьальними ферментами й дріжджовими ліпідами. В яким штамом вірусу коров'ячої віспи. Переважним DE 19918619 описується використання гомогеніприкладом вірусу коров'ячої віспи є модифіковазації високим тиском для виділення HbsAg з дріжний штам вірусу коров'ячої віспи Ankara (MVA). джових клітин. В US 4255521 описується спосіб Типовим штамом MVA є MVA 575, котрий був деекстрагування глюкозної ізомерази з клітин мікропонований в Європейській Колекції Тваринних Кліорганізмів за вивільненням високим тиском. Гомотинних Культур із депозитним номером ECACC генізація високим тиском також використовувалася V00120707. Більш переважним є MVA-BN або його для виділення вірусоподібних часток (ВПЧ) з репохідні. MVA-BN було описано в WO 02/42480 7 77735 8 [РСТ/ЕР01/13628]. Вказана міжнародна заявка чатковим матеріалом для способу за даним винарозкриває біологічні тести, які дозволяють визнаходом еукаріотичні клітини інфікують відповідним чити чи є штам MVA штамом MVA-BN чи його попоксвірусом. Еукаріотичні клітини є клітинами, що хідним й способи одержання MVA-BN або його є сприйнятливими до інфікування відповідним попохідних. Зміст цієї заявки є включеним до теперіксвірусом і дозволяють реплікацію й вироблення шньої заявки через посилання. MVA-BN депоноваінфекційного вірусу. Такі клітини є відомими для но в Європейській Колекції Тваринних Клітинних всіх поксвірусів особам досвідченим в даній галузі. Культур із депозитним номером ECACC Для MVA та вірусу коров'ячої віспи штам Elstree V00083008. прикладом цього типу клітин є курячі ембріофірбоВіруси, що одержуються можуть бути природбласти (CEF) [Drexler I., Heller K., Wahren В., Erfle ними вірусами, ослабленими вірусами або рекомV. and Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia бінантними вірусами. Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a Термін "рекомбінантний вірус" відноситься до potential host for virus propagation, but not in various будь-якого вірусу, який має у вірусному геномі human transformed and primary cells" J. Gen. Virol. вставлений гетерологічний ген, котрий не є в нормі (1998), 79,347- 352]. Клітини СЕF можуть бути частиною вірусного геному. Гетерологічний ген культивовані в умовах, відомих особам досвідчеможе бути терапевтичним геном, геном, що кодує ним в даній галузі. Переважно клітини CEF культиантиген чи пептид, представлений принаймні одвують у безсироватковому середовищі в стаціонаним епітопом для викликання імунної відповіді, рних колбах або в циліндричних пляшках. антисмисловою експресійною касетою або рибоІнкубація переважно займає від 48 до 96 годин при зимним геном. Способи одержання рекомбінант37°С±2°С. Для інфікування поксвіруси беруть в них вірусів є відомими досвідченим особам в даній інфекційній кількості (МОI) від 0,05 до 1 TCID50 й галузі. Гетерологічний ген переважно вставлений інкубація переважно займає від 48 до 72 годин при в неважливу ланку вірусного геному. В іншому 37°С±2°С. переважному втіленні винаходу гетерологічна поСпостерігати прогрес інфікування можна розслідовність нуклеїнової кислоти вставлена в сайт глядаючи цитопатичні ефекти, які зазвичай з'явприродної делеції геному MVA [описано в ляються як заокруглення інфікованих клітин. РСТ/ЕР96/02926]. Даний винахід дозволяє одержувати поксвіру"Ослаблений вірус" є вірусом, котрий інфікуюси, такі як Elstree або MVA з інфікованих клітин. чи організм хазяїна призводить до меншої смертПід терміном "одержання" мається на увазі, що ності та/або захворюваності порівняно із неослабспосіб згідно даного винаходу дозволяє руйнува ти леним батьківським вірусом. Прикладом клітини інфіковані поксвірусом та/або відділити ослабленого вірусу коров'ячої віспи є штам MVA, поксвіруси від клітинних мембран, з котрими вони зокрема MVA-575 та MVA-BN. звичайно зв'язані, до такого стану, коли стає можВідомо, що поксвіруси, такі як вірус коров'ячої ливим подальше очищення. Таким чином, продукт віспи, можуть існувати в двох різних формах: поксвиділення поксвірусів з інфікованих клітин (відновірус прикріплений до клітинної мембрани в цитоситься до "гомогенату, що містить поксвірус" в плазмі інфікованої клітини (внутрішньоклітинний даній заявці) є гомогенною сумішшю вільних поксзрілий віріон (IMV)) та вір уси які мають бути вивевірусів й клітинних детритів (шламів), котрі містять дені назовні (зовнішньоклітинний оболонковий незначні кількості інтактних, незруйнованих клітин віріон (EEV)) [Vanderplasschen A,Hollinshead M, та вірусу, зв'язаного з клітинними мембранами. Smith GL"lntracellular and extracellular vaccinia Якщо інфіковані клітини є клітинами, котрі моvirions enter cells by different mechanisms" J. Gen. жуть бути культивовані в суспензійній культурі, то Virol. (1998), 79,877-887]. Обидва IMV та EEV є інфіковані клітини можуть легко бути зібрані інфекційними, але морфологічно різними, оскільки центрифугуванням. EEV має додаткову ліпопротеїнову оболонку. За Якщо інфіковані клітини є більш чи менш інтанормальних умов частки IMV присутні в більшій ктними адгезивними клітинами, вони мають бути кількості ніж EEV, але методом згідно даного визібрані, тобто видалені з культуральної судини, находу можна отримати обидва типи часток. перед гомогенізуванням високим тиском. Такий Початковий матеріал для стадії гомогенізації метод є відомим особам, досвідченим в даній газгідно даного винаходу є клітинами інфікованими лузі. Придатними для цього є механічні методи відповідним поксвірусом. Термін "інфіковані кліти(наприклад, з використанням гумового клітинного ни" використовується для позначення початкового скребка), фізичні методи (наприклад, охолодження матеріалу для гомогенізації відповідно до даного нижче -15°С й відтавання культуральних посудин винаходу, відноситься до інтактних клітин інфікодо +15°С) або біохімічні методи (обробка ферменваних відповідним вірусом, до частин чи фрагментами, наприклад, трипсином, для відділення клітин тів інфікованих клітин, до котрих приєднано відповід культуральних посудин). Якщо для цих потреб відний поксвірус або до суміші інтактних та використовуються ферменти, слід контролювати лізованих/зруйнованих клітин. Прикладами частин час інкубації, оскільки ці ферменти можуть під час чи фрагментів інфікованих клітин є клітинні мемінкубації також пошкодити вірус. брани лізованих/зруйнованих клітин, до яких приВ способі згідно даного винаходу, інфіковані єднано відповідний поксвірус. Початковий матеріклітини, більш точно, зібрані інфіковані клітини ал також може містити вільні вірусні частки, котрі потім піддаються гомогенізації високим тиском. В не є приєднаними до клітинної мембрани і не розданому описі термін "гомогенізація високим тиском ташовані внутрішньоклітинно. " іноді приводиться в абревіатурі "НРН". ГомогеніДля одержання інфікованих клітин, котрі є позація високим тиском має подвійний ефект. З од 9 77735 10 ного боку гомогенізація високим тиском призво+15°С, ще більш бажано нижче +10°С. дить до руйнування інтактних клітин. Таким чином, Спосіб згідно даного винаходу може бути ліIMV вивільнюються і стають доступними для понійно розширений і може проводитися як пакетним дальшого очищення. З іншого боку гомогенізація чином так і безперервно. високим тиском має той ефект, що поксвіруси віПри пакетному провадженні процесу кожний докремлюються від клітинної мембрани або припакет клітин, які мають бути гомогенізовані можуть наймні зменшується розмір клітинно-мембраннобути піддані стадії гомогенізації високим тиском вірусних агрегатів. До того ж це спрощує подальодин або декілька разів. Бажано щоб над кожним ше очищення поксвірусу. пакетом стадію гомогенізації було виконано від Особа досвідчена в даній галузі, є знайомою із одного до трьох разів, більш бажано лише один загальними принципами гомогенізації високим раз. тиском [White MD, Marcus D., "Disintegration of Успіх стадії гомогенізації може бути оцінений microorganisms", Adv. Biotechnol. Processes 1988; визначенням титру вір усу (еквіваленту кількості 8: 51-96]. Системи НРН базуються на використанні інфекційних вірусних часток, визначених або інфівисокого тиску для проштовхування зразка через куючою дозою культури тканини (TCID50), або малий фіксований отвір на високій швидкості за одиницями утворення бляшок (pfu)) в початковому контрольованих й відтворюваних умов. В даному матеріалі, як визначено вище, та в матеріалі, одеописі терміни "патрубок", "отвір" та "форсунка" ржаному після стадії гомогенізації. Іншими словавикористовуються взаємозамінно. ми, титр вірусу визначається до та після гомогеніОсновною частиною кожного руйнівника є руйзації високим тиском. Початковий матеріал, що нуюча голівка. Руйн уюча голівка переважно скламістить більш-менш інтактні клітини й значна бідається з (І) камери/циліндра високого тиску, (II) льшість великих агрегатів представлені поксвіруспоршня високого тиску, котрий рухається в каменими частками, зв'язаними із клітинними мембрарі/циліндрі, й таким чином збільшується тиск в нами. Якщо такий матеріал використовувався для камері/циліндрі й (III) патрубка/форсунки через визначення вірусного титру, одержаний титр є никотрий випорскується вміст камери. Випорскнутий жчим ніж дійсна кількість інфекційних часток. Це вміст камери спрямовується на поверхню, таку як має місце завдяки тому факту, що тест-системи, шматок металу, котрий переважно має теплообщо використовуються для визначення вірусного мінну поверхню, що сприяє охолодженню. Для титру, зазвичай являють собою системи клітинних того щоб зібрати зруйнований вміст камери в сискультур (такі як системи описані в прикладі 2) в темі передбачено засіб для збору зруйнованого котрих підраховується кількість інфікованих клітин зразку (названий "збірна камера"). Типовим гомоабо кількість утворених бляшок. Такі тест-системи генізатором високим тиском є Basic Z+ від не можуть знайти різницю між позитивними реConstant Cell Disruption Systems [Low March, зультатами які є наслідком інфікування клітини Daventry, Northants, NN114SD, United Kingdom]. лише однією вірусною часткою й інфікування кліВ переважному втіленні руйнування клітин за тин, наприклад, великим агрегатом вірусів зв'язадопомогою системи гомогенізації високим тиском них із клітинними мембранами. Після гомогенізації проводиться в три стадії. (І) Зразок вводиться в високим тиском поксвіруси стають відокремленими камеру/циліндр високого тиску. Потім створюється від клітинних мембран та/або розмір клітиннотиск в камері/циліндрі. Доки це триває, поршень мембранно-вірусних агрегатів значно зменшуєтьвисокого тиску опускається. (II) Поршень потім ся, що призводить до зростання кількості менших подає зразок через форсунку на високій швидкості. агрегатів. Якщо цей матеріал використовувався Швидке переміщення зразку із зони з високим тисдля визначення титру, одержані результати будуть ком в зону з низьким тиском призводить до руйнувищими, навіть якщо дійсна кількість інфекційних вання клітин. (Ill) Зразок досягає кінцевої цілі й вірусних частинок не зменшиться. Таким чином, наноситься радіально поперек охолоджуваної теуспіх гомогенізації переважно відображається плообмінної поверхні. Продукт потім стікає в камепринаймні таким самим або вищим значенням ру для накопичення. Гідравліка наповнюється зноТСID50/мл ("TCID" є абревіацією від "tissue culture ву й цикл продовжується. infectious dose", "доза, що інфікує тканинну культуВ кінці процесу випорскнутий гомогенат збирару") гомогенату порівняно із початковим матеріається у відповідну посудин у, залежно від об'єму. лом. В розділі прикладів показано в деталях, як Для одержання поксвірусів згідно даного винаможе бути визначене значення ТСID50/мл. Також ходу форсунка повинна мати діаметр в межах 0,10 якість й успішність гомогенізації високим тиском до 0,6мм, 0,15 до 0,6мм, 0,15 до 0,50мм, бажано в може бути визначена електронною мікроскопією. межах від 0,15 до 0,40мм, 0,20 до 0,50мм, більш Для подальшого очищення одержаний гомогебажано 0,20 до 0,40мм, найбільш бажано 0,25мм нат проходить принаймні одну стадію очищення до 0,35мм. Приклади найбільш переважних діамедля одержання фракції збагаченої поксвірусом. трів 0,25мм та 0,35мм. Зокрема, ці стадії можуть бути проведені на гомоЗначення тиску в камері/циліндрі встановлюгенаті, що містить вірус коров'ячої віспи, який приється в межах від 200 до 1000бар, бажано 400 до значений для подальшого очищення вказаного 1000бар, 200 до 800бар, більш бажано 400 до вірусу коров'ячої віспи. 800бар, 600 до 1000бар, ще більш бажано 600 до Стадія очищення, між іншим, може бути: 900бар, найбільш бажано 700 до 900бар. Най- пакетним центрифугуванням (наприклад, з більш переважний тиск становить 800бар. використанням сахарозної підкладки) або безпеТемпература гомогенату на виході не повинна рервно-проточним ультрацентрифугуванням (саперевищувати +25°С й бажано не бути нижче харозні градієнти) [Hilfenhaus, J., Kohler, R. and 11 77735 12 Gruschkau, Η., J.Biol. Stand. (1976) 4,285-293; бран після, до або підчас руйнування інфікованих Madalinski, W., Bankovski, A. and Korbecki, M., Acta клітин і котрі можуть бути надалі очищені. В усіх Virol. (1977) 21,104-108], промислових способах виділення поксвірусів з - ультрафільтрацією (наприклад, поперечнопочаткового матеріалу включено інфіковані клітипроточною фільтрацією з використанням мембрани так само як супернатант культур. Таким чином, ни із порами розміром більше 500кДа, але рівними початковий матеріал включає поксвіруси IMV, що містяться в інфікованих клітинах так само як поксчи меншими 0,1mΜ), - колонковою хроматографією (наприклад, іовіруси EEV, котрі переважно знаходяться в супернатант. Відомі способи руйнування клітин із настунообмінною, гідрофобною взаємодією, розмірною пною гомогенізацією (наприклад, за допомогою ексклюзією або комбінацією) [Hedstrom, К. G. and ультразвуку) не так добре руйнують клітини та/або Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969 137: 421-430; відокремлюють поксвіруси IMV від клітинних уламStickl, H., Korb, W. and Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215,38-50], ків, як гомогенізація високим тиском. Іншими словами, більшість IMV залишаються зв'язаними із - комбінацією вище наведених [Masuda, Ν., клітинними мембранами й уламками. Таким чиEllen, R. P. and Grove, D. A.,J.]. ном, співвідношення вільних IMV до EEV є менБажано, щоб стадія очищення була стадією шим ніж в способі згідно даного винаходу. В споультрафільтрації. Більш бажано, стадією ультрафільтрації має бути поперечно-проточна фільтрасобі використання ультразвуку це співвідношення змінюється незначно при стадіях подальшого ція відома особі досвідченій в даній галузі. [Див. очищення тоді як клітинні уламки із котрими залинаприклад, Richards, G. P. and Goldmintz, D., J. шаються зв'язаними IMV, зазвичай видаляються. Virol. Methods (1982), 4 (3), cc.147-153. "Evaluation На відміну від відомих способів одержання поксвіof a cross-flow filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated oyster tissue русів спосіб виділення за даним винаходом призводить до дуже ефективного руйнування інфікоhomogenates"]. ваних клітин, a IMV дуже ефективно Хоча одна стадія очищення може бути достатвідокремлюються від клітинних мембран. Таким ня для досягнення рівня вимог регулювання для чином, загальна кількість вільних IMV, котрі стають біофармацевтичних продуктів, дві або більше вище згаданих стадій очищення можуть бути скомбідоступними до подальшого очищення є більшою ніж в способах відомих з рівня техніки, також співновані для одержання ще більш чистого продукту. відношення вільних IMV до EEV поксвірусів є біВ найбільш бажаному втіленні першої стадії льшим. очищення є поперечно-проточна фільтрація із наГомогенат, що містить поксвірус та/або фракступною стадією колонкової хроматографії. Більш бажано, щоб стадія колонкової хроматографії була ція збагачена на поксвірус, одержана за методом відповідно даному винаходу є придатними для іонообмінною або гідрофобної взаємодії. використання як вакцини. Одержана фракція збагачена на вірус може, Якщо гомогенат, що містить поксвірус та/або необов'язково, бути висушена заморожуванням. фракція збагачена на поксвірус включає не модиСпосіб висушування заморожуванням є відомим особам досвідченим в цій галузі [Day J. and фіковані поксвіруси або ослаблені поксвіруси, такі як штам вірусу коров'ячої віспи Elstree або MVA, то McLellan M., Methods in Molecular Biology (1995), вона може бути використана для вакцинації проти 38, Humana Press, "Cryopreservation and freezeпоксвірусних інфекцій. Наприклад, гомогенат, збаdrying protocols"]. гачений на вірус та/або фракція збагачена на віТакож винахід відноситься до фракцій збагачених на поксвірус та/або гомогенат збагачений на рус, котра містить штам вірусу коров'ячої віспи Elstree або MVA, зокрема MVA-BN може бути випоксвірус, одержаний за допомогою метода одеркористана як вакцина проти віспяних інфекцій. жання поксвірусів згідно даного винаходу, тобто, Якщо гомогенат, що містить поксвірус та/або спосіб, який включає оброблення інфікованих кліфракція збагачена на поксвірус містять вірус, що тин гомогенізацією високим тиском. Зокрема, винахід відноситься до фракцій, збагачених на поксмістить та екпресує один або більше гетерологічних ген(ів), гомогенат, що містить поксвірус та/або вірус, одержаних способом виділення/очищення фракція збагачена на поксвірус може, також, бути згідно даного винаходу, тобто, способом, в котровикористана для вакцинації тварин, включаючи му гомогенат, що містить поксвірус, одержаний за людей, проти протеїнів, які експресуються гетеродопомогою НРН, й пройшов принаймні одну стадію очищення. Поксвірус може бути будь-яким вище логічними геном(ами). Для виготовлення вакцини, гомогенат, що місзгаданим поксвірусом. Зокрема, поксвірус згідно тить поксвірус, та/або фракція збагачена на поксданого винаходу є вірусом коров'ячої віспи, так вірус, одержані способом згідно даного винаходу само як і будь-який штам, котрий є придатним для конвертується в фізіологічно прийнятну форму. Це вакцинації, зокрема штам Elstree або модифікований вірус коров'ячої віспи Ankara, більш бажано може бути виконано, керуючись досвідом виготовлення поксвірусних вакцин, які використовуються MVA-BN. для вакцинації проти віспи як описано [Stickl, H.et Гомогенат, що містить поксвірус та/або фракal. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99,2386-2392]. Наприція збагачена на поксвірус, одержана способом клад, гомогенат, що містить поксвірус та/або фразгідно даного винаходу, котрий включає стадію НРН, характеризується дуже високим співвіднокцію, збагачену на поксвірус зберігають при -80°С із титром 5x108 TCID50/ml із 10mM Tris, 140mМ шенням вільних IMV поксвірусів до EEV поксвіруNaCI, pH 7.4. Для виготовлення вакцинних доз, сів. Термін "вільний IMV" використовується для наприклад, 103-109 ТСID50 вірусу, ліофілізують в позначення IMV, від'єднаних від клітинних мем 13 77735 14 фосфа тному буферному розчині (PBS) в присутмає діаметр в межах 0,10 дo 0,6mm. ності 2% пептону та 1% альбуміну в ампулі, бажаСпосіб, як описано вище, в котрому гомогенат, но в скляній ампулі. Також, вакцина може бути що містить поксвірус піддається, щонайменше виготовлена поступовим сублімаційним висушуодній стадії очищення для одержання фракції, ванням вірусу в композиції. Ця композиція може збагаченої на поксвірус. містити додаткові добавки, такі як, манітол, декСпосіб, як описано вище, в котрому принаймні стрин, цукор, гліцин, лактозу або полівінілпіроліодна стадія очищення є стадією ультрафільтрації. дон, або інші добавки, такі як антиоксиданти або Спосіб, як описано вище, в котрому ультрафіінертний газ, стабілізатори або рекомбінантні прольтрація є поперечно-проточною фільтрацією. теїни (такі як, сироватковий альбумін людини) Спосіб, як описано вище, в котрому на стадії придатний для застосування in vivo . Типова вірупоперечно-проточної фільтрації використовується совмісна композиція, придатна для ліофільного мембрана, що має розмір пор більше 500кДа але сушіння, включає 10mМ Tris-буферу, 140mМ NaCI, дорівнює або менше 0,1mΜ. 18,9г/л декестрану (MW 36000-40000), 45г/л сахаСпосіб, як описано вище, в котрому за ультрози, 0,108г/л L-глутамінової кислоти моно калієрафільтрацією має місце принаймні одна стадія вої солі моногідрату рН 7,4. Скляна ампула запаюколонкової хроматографії. ється й може зберігатися між 4°С та кімнатною Спосіб, як описано вище, в котрому одержаний температурою на протязі декількох місяців. Тим не гомогенат, що містить поксвірус або фракція збаменш, якщо не має потреби, то ампула зберігаєтьгачена на поксвірус є ліофільно висушеною. ся при температурі нижче -20°С. Гомогенат, що містить поксвірус або фракція Для вакцинації ліофілізований або ліофільно збагачена на поксвірус одержані способом, описависушений продукт може бути розведений від 0,1 ним вище. до 0,5ml водного розчину, бажано фізіологічного Гомогенат, що містить поксвірус або фракція розчину або Tris-буферу, і застосовується системзбагачена на поксвірус як описано вище є вакцино або локально, наприклад, паретерально, внутною. рішньом'язево або будь-яким іншим шляхом відоВикористання гомогенату, що містить поксвімим досвідченому професіоналу. Спосіб рус або фракції збагаченої на поксвірус як описано застосування, доза та кількість застосувань може вище для виготовлення вакцини. бути оптимізована досвідченими професіоналами Спосіб вакцинації тварин, включаючи людину, загальновідомим способом. Більш бажано, щоб за такої потреби, характеризується застосуванням поксвірусні вектори вводилися внутрішньошкірно гомогенату, що містить поксвірус або фракції збаабо внутрішньом'язево. гаченої на поксвірус або вакцини як визначено Винахід, також, відноситься до способу вакцивище в тілі тварини. нації тварин, включаючи людей, який включає іноФігура: клітини CEF інфіковані MVA-BN, оброкуляцію тваринам, включаючи людей, при потребі, блені циклом заморожування-розморожування для гомогенатом, що містить поксвірус, або фракцією, отримання суспензії клітин. Вірусний титр було збагаченою на поксвірус, одержаними способом, визначено, як описано в Прикладі 2, без подальзгідно даного винаходу. шого очищення клітинно-вірусної суспензії ("0Винахід, між іншим, включає наступне, окрема значення"). Вірусно-клітинну суспензію гомогенізоабо в комбінації: вано, способом відомим з рівня техніки з викорисСпосіб виділення поксвірусу з інфікованих клітанням ультразвуку ("Sonifier") або гомогенізацією тин, що включає стадію обробки інфікованих клізгідно даного винаходу ("НРН"), як описано в притин гомогенізацією високим тиском для одержання кладі 1. На стадії НРН тиск був 800бар та форсунгомогенату, що містить поксвірус. ка мала діаметр 0,25мм. Наприкінці стадії гомогеСпосіб, як описано вище, в котрому поксвірус нізації титр вірусу було знову визначено. вибрано з групи, яка включає orthopoxvirus, Приклад(и) avipoxvirus, suipoxvirus та capripoxvirus. Наступні приклад(и) проілюструють даний виСпосіб, як описано вище, в котрому поксвірус нахід. Особі добре обізнаній в даній галузі має вибрано з групи, яка включає вірус коров'ячої вісбути зрозуміло, що наведений(і) приклад(и) ні в пи, козячий поксвірус, овечий поксвірус, канарейякому разі не може інтерпретуватися як обмеженковий поксвірус та пташиний поксвірус. ня застосування технології, що пропонується даСпосіб, як описано вище, в котрому вірус коним винаходом. ров'ячої віспи є модифікованим вірусом коров'ячої Приклад 1: Гомогенізація поксвірусно-клітинної віспи Ankara (MVA), зокрема MVA-BN із депозитсуспензії з використанням гомогенізатора високого ним номером ЕСАСС V00083008. тиску Спосіб, як описано вище, в котрому поксвірус є Фібробласти курячого ембріону (CEF) культирекомбінантним поксвірусом. вовані в циліндричних колбах були інфіковані Спосіб, як описано вище, в котрому гомогеніMVA-BN (ЕС АСС V00083008). Інфіковані клітини зація високим тиском виконується поміщенням були оброблені замороженням та розмороженням інфікованих клітин в камеру високого тиску, збільдля одержання вірусно-клітинної суспензії. шенням тиску в камері та випорскування інфіковаВ гомогенізатор Basic Z+ (Constant Cell них клітин через патрубок. Disruption Systems, Low March, Daventry, Northants, Спосіб, як описано вище, в котрому тиск в каNN114SD, United Kingdom) завантажували 50мл мері збільшується до значення в діапазоні від 200 початкової вірусно-клітинної суспензії на кожний до 1000бар. запуск. Для визначення оптимальних умов гомогеСпосіб, як описано вище, в котрому патрубок нізації було випробувано форсунки з діаметром в 15 77735 16 межах 0,18 до 0,40мм та тиск в межах 200 до Розведення розчинів, що містили вірус були 1000бар. Початкова суспензія оброблялася гомовиконані в 10 стадій (10-1 до 10-12 як призначено) з генізацією високим тиском один, два або три рази. використанням RPMI без телячої сироватки. Потім, Гомогенізатор використовувався згідно інструкції 100mΙ кожного вірусного зразка додавали в лунки із виробника. Оцінка методу виконувалася моніториклітинами. 96-лункові планшети інкубували при нгом титру, як описано в прикладі 2. 37°С та 5% СО2 на протязі 5 днів для того щоб В підготовчих дослідженнях було з'ясовано, дати реплікуватися вірусній інфекції. що діаметр форсунки більший за 0,4мм не дає Через5 днів після інфікування клітини обробжодного позитивного впливу на результати гомоляти антитілами специфічними до вірусу коров'ягенізації. При використанні форсунок з діаметрами чої віспи. Для визначення специфічних антитіл 0,18мм, 0,25мм та 0,35мм найкращі результати використовували пероксидазу хрону (HRP) зв'язабули одержані при обробці вірусно-клітинної суну із вторинними антитілами. Антитіла специфічні спензії одноразово тиском 800бар. За цих умов не до MVA є антитілами специфічними до вірусу коспостерігалося значних відмінностей в умовах тиров'ячої віспи, кролячими політональними антитітру. лами, фракція IgG [Quartett, Berlin, Germany #9503Спосіб згідно даного винаходу був порівняний 2057]. Вторинні антитіла є антитіла до кролячого із прямою проточною ультразвуковою обробкою IgG, поліклональні козячі зв'язані із HRP антитіла відомою з рівня техніки. Результати підсумовано в [Рготеда, Mannheim, Germany, #W4011]. Кольорові Фіг. Порівняно із обробкою ультразвуком, спосіб реакції виконуються згідно відомих методик. згідно даного винаходу призводить до більшого Кожна лунка із клітинами, котра є позитивною титру вір усу та кращої гомогенності суспензії, що є при кольоровій реакції, маркувалася як позитивна більш придатним для подальшої обробки. для обрахування TCID50. Приклад 2. Титрування модифікованого вірусу Титр обраховувався з використанням формукоров'ячої віспи Ankara (MVA) ли Spearman [1] та Kaerber [2]. Оскільки всі параТитрування модифікованого вірусу коров'ячої метри методу залишалися незмінними, то викоривіспи Ankara (MVA) проводилося методом засностовувалася спрощена формула: ваним на ТСID50 з використанням 10-разового розведення в 96-лункових планшетах. Кінцева точка Вірусний титр [TCID50 / ml] = тесту, ін фіковані клітини візуалізовані з викорисx x x ù é танням антитіл до вірусу коров'ячої віспи та відпо= 10ê a + 15 + a + b + c ú , 8 8 8û відним забарвлюючим розчином. ë 2-3-денні первинні клітини CEF (курячі ембріобласти) були розведені до 1x105клітин/мл в 7% а = коефіцієнт розведення останньої колонки, RPMI. 10-кратні розведення виконані із 8-ма реплів котрій всі вісім лунок були позитивними катами на кожне розведення. Після розведення ха = кількість позитивних лунок в колонці а+1 100mΙ поміщали в кожну лунку 96-лункової планхb = кількість позитивних лунок в колонці а+2 шети. Клітини інкубували на протязі ночі при 37°С xс = кількість позитивних лунок в колонці а+3 та 5% СО2. Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601