Нанокомпозит металів, як потенційний компонент біопрепаратів і кормових добавок для тварин

Реферат: Нанокомпозит металів як потенційний компонент біопрепаратів і кормових добавок для тварин, що містить металеві наночастки, переважно сферичної форми, в якому розміри наночасток складають від 30 нм до 100 нм, метали вибрані з групи, що складається з срібла (Аргентуму), міді (Купруму), заліза (Феруму), оксиду марганцю (Мангану). Наночастки синтезовані за методом хімічної конденсації, та за умов дослідження in vitro на моделі субклітинних фракцій культури клітин СНО-К1 не проявляють загальної токсичності і генотоксичності та має наступний структурний, якісний та кількісний склад за співвідношенням компонентів, об'єм %: 3 колоїдний розчин наночасток Аргентуму (з концентрацією 1600,0 мкг/см за металом, середнього розміру (~31,5±0,9) нм) - 0,625 %; 3 колоїдний розчин наночасток Феруму (з концентрацією 10000,0 мкг/см , (~100,0±10,0) нм) 0,100 % 3 колоїдний розчин наночасток двоокису Мангану (з концентрацією 2785,0 мкг/см , (~50,0±3,0) нм) - 0,359 %; 3 колоїдний розчин наночасток Купруму (з концентрацією 2560,0 мкг/см , (~70,0±5,0) нм) 0,391 %; вода дистильована - 98,525 %. UA 92804 U (12) UA 92804 U UA 92804 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області нанобіотехнологій, а саме до використання нанотехнологій у ветеринарній медицині та тваринництві для підвищення продуктивності та якості сільськогосподарської продукції. Відомий колоїдний розчин металу, що містить частинки сполук рідкоземельного елемента, кислоту і розчинник, вибраний з неполярних вуглеводнів, причому щонайменше 90 % часток є монокристалічними, а сама дисперсія може бути отримана реакцією солі рідкоземельного елемента з дугою в лужному середовищі (Патент РФ №2242275. Органическая коллоидная дисперсия монокристаллических частиц соединения редкоземельного элемента. МПК 1301J13/00, C10L1/10. Опубл. 2004.12.20). Недоліком відомого колоїдного розчину є обмежена область застосування, що належить до присадок до палива для двигунів внутрішнього згорання. Найбільш близьким аналогом до того, що заявляється, є колоїдний розчин наночасток металу або суміші металів (Патент України № 27080, МПК В01J 13/00, C01G 49/00, C10L 10/00 (2007) / Колоїдний розчин наночасток металу або суміші металів [Текст] / Косінов М.В., Каплуненко В.Г. Заявник і власник патенту Косінов MB., Каплуненко В.Г.; заявл. 10.07.2007. - № υ 2007 07776; опубл. 10.10.2007. - Бюл. № 16.-3 е.), що містить металеві наночастки, в якому розміри наночасток складають від 1 нм до 100 нм, метали вибрані з групи, що складається з срібла, золота, платини, паладію, міді, родію, іридію, нікелю, заліза, марганцю, ванадію, вольфраму, молібдену, кобальту, танталу, титану, алюмінію, магнію, цинку, олова. Металеві наночастки мають переважно сферичну форму, мають електричний поверхневий заряд, а молекули діелектричної рідини наелектризовані і утворюють оболонки навколо металевих наночасток. Основним недоліком цього колоїдного розчину є використання металів у нанорозмірній формі, що можуть мати генотоксичні властивості (Кобальт, Цинк та ін.), що унеможливлює використання його у ветеринарній медицині та тваринництві. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити нанокомпозиційну суміш металів (НкМе) для застосування у тваринництві та ветеринарній медицині, що відрізняється дослідженням загальної токсичності наночасток металів за умов in vitro на моделі субклітинних фракцій культури клітин СНО-К1, визначенням їх гено- і загальнотоксичних властивостей за умов in vitro та включає використання суміші колоїдних розчинів наночасток Аргентуму, Феруму, двоокису Мангану та Купруму, які мають сферичну геометрію, синтезовані за методом хімічної конденсації і в розмірному діапазоні (27,0-100,0) нм за наступного співвідношення компонентів, об'єм%: 3 Колоїдний розчин наночасток Аргентуму (з концентрацією 1600,0 мкг/см за металом, середнього розміру (~31,5±0,9) нм) - 0,625 %; 3 Колоїдний розчин наночасток Феруму (з концентрацією 10000,0 мкг/см , (~100,0±10,0) нм)0,100 % 3 Колоїдний розчин наночасток двоокису Мангану (з концентрацією 2785,0 мкг/см , (~50,0±3,0) нм) - 0,359 %; 3 Колоїдний розчин наночасток Купруму (з концентрацією 2560,0 мкг/см , (~70,0±5,0) нм) 0,391 %; Вода дистильована - 98,525 %. Порівняльний аналіз технічного рішення з прототипом дозволяє зробити висновок, що спосіб, який заявляється, відповідає критерію "новизна". Нанокомпозиційну суміш металів (НкМе) складали за результатами визначення гено- та загальнотоксичної дії таких наночасток (NP) металів - Аргентуму, Феруму, двоокису Мангану, Купруму, гексаціаноферату Кобальту, Кобальту та Цинку на моделі ізольованих субклітинних фракцій тест-культури клітин СНО-К1. Дослідні зразки NP металів синтезовані за методом хімічної конденсації [Методические разработки к практикуму по коллоидной химии / под ред. А.В. Перцова. - М.: Изд-во МГУ, 1976. - 132 с.] та мають сферичну геометрію Приклад 1. Визначення генотоксичності дослідних зразків наночасток металів за методом лужного гель-електрофорезу ("ДНК- комет") на моделі еукаріотичних тест-клітин СНО-К1. Визначення генотоксичних властивостей наночасток металів здійснювали за методом лужного гель-електрофорезу еукаріотичних клітин яєчника китайського хом'ячка СНО-К1 [Didenko, V. Methods in Molecular Biology. In Situ Detection of DNA Damage. Methods and protocols [Текст] / Edited by Vladimir V. Didenko. - Humana Press, 2002. - V. 203. - 279 p.]. Клітини культури CHO-K1 нарощували на середовищі F10 ("Sigma", США), що містить 5 % ембріональної 5 3 сироватки ВРХ ("Gibco", США) до титру (510 )кл/см . Кількість живих клітин, визначених за допомогою фарбування 0,3 % розчином трипайового синього, складала не менш ніж 90 %. 1 UA 92804 U 5 10 Визначення генотоксичності NP металів здійснювали у реакційній суміші, що містить 67 мкл суспензії тест-клітин і 33 мкл NP за температури (37±1)°С. Час інкубації клітин СНО-К1 із зразками NP металів складав 18 год. "Позитивним" контролем вважали клітини СНО-К1, оброблені N-нітрозометилсечовиною (тест-мутаген) в концентрації 1 мМ протягом 48 год.; "негативним" контролем - клітини СНО-К1 в розчині ДМСО. Для фарбування мікропрепаратів "ДНК-комет" використовували флуоресцентний барвник акридиновий жовтогарячий. Флуоресцентну мікроскопію мікропрепаратів здійснювали за умов: збуджуючий фільтр 490 нм, дихроїчне дзеркало 510, відтинаючий фільтр 530 нм, збільшення χ 200-400. На кожний мікропрепарат аналізували не менш ніж 100 "ДНК-комет" без накладень "хвостів". Аналіз "ДНК-комет" проводили візуально. При цьому "ДНК-комети" розподіляли на п'ять умовних типів із відповідним для кожного числовим значенням від 0 до 4. Ступінь пошкодження ДНК при цьому виражали як індекс "ДНК-комет" (ІДНК), який обчислювали за формулою 1: 0n0  1n1  2n2  3n3  4n4 ,(1)  де n0  n4 - число "ДНК-комет" кожного типу, 2 AIE   ˆ 15 20 25 30 35 40 45 50 55  - сума "ДНК-комет". Експерименти виконані в 6 повторах та у двох паралелях. Статистичну обробку результатів проводили по кожній експериментальній точці шляхом порівняння показників ушкодження ДНК в дослідній та контрольних групах. Критерієм позитивного результату слугував статистично достовірний відтворюваний ефект. Результати дослідження генотоксичності NPCо, гексаціаноферату NPCо і NPZn свідчить про наявність такої властивості у даних наночасток у всьому вивченому концентраційному діапазоні. Так, клітини лінії СНО-К1, оброблені такими дискретними наночастками, фіксували наявність первинних ДНК-пошкоджень. На фіг. 1 зображено приклади типових пошкоджень "ДНК-комет" завдяки генотоксичного впливу NPCo (фіг. 1, А) і NPZn (фіг. 1, Б). Значення індексу "ДНК-комет", який характеризує рівень пошкоджень генетичного апарата еукаріотичних клітин, сягає значень, що близькі до таких у "позитивному" контролі (табл. 1). Таким чином, дослідні зразки гексаціаноферату NPCo, саме NPCo і NPZn проявляють гепотоксичну дію щодо ізольованих тест-клітин СНО-К1 у діапазоні концентрацій (0,12-830,00) 3 мкг/см за металом, тобто вони є небезпечними. Наночастки таких металів можуть бути промутагенами і впливати на генетичний апарат клітин з подальшим утворенням ДНК-аддуктів, алкільованої ДНК тощо. Дослідження генотоксичності NPCu, NPFe, NPAg та двоокису ΝΡΜn показало відсутність для них такої властивості у всьому вивченому концентраційному діапазоні. Так, в зразках еукаріотичних клітин СНО-К1, оброблених такими дискретними наночастками, не реєстрували первинних ДНК-пошкоджень. На фіг.2 проілюстровано типове зображення непошкодженої ДНК клітин лінії СНО-К 1 на прикладі впливу NPFe. Значення індексу "ДНК-комет" сягають таких у "негативному" контролі та становлять у середньому (0,010±0,001) % (табл. 1). Тобто, дослідні зразки NPCu, NPFe, NPAg та двоокису ΝΡΜn в вивченому концентраційному діапазоні можна вважати біобезпечними. Приклад 2. Визначення загальної токсичності дослідних зразків наночасток металів за біохімічними маркерами на моделі ізольованих фракцій тест-клітин СНО-К1. Дослідження загальної токсичності дослідних зразків ΝΡ металів проводили, використовуючи біохімічні маркери - активність ATP-ази (КФ 3.6.3.6) та лактатдегідрогенази (ЛДГ-аза, Κ Φ 1.1.1.27), - на моделі субклітинних фракцій еукаріотичних клітин СНО-К 1. Для цього проводили преінкубацію зразків ΝΡ металів протягом 3 хв з препаратами 3 сумарної мембранної фракції тест-клітин (кінцева концентрація білка - (150-200) мкг/см ) у кінцевій концентрації 1 мкг/мл за кожним металом за температури (37±1)°С. При визначенні активності АTР-ази використовували середовище інкубації, що містить 50 мМ Трис-НСІ, 5 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 20 мМ КСІ, 3 мМ АТР (рН=7,5). В "контрольну" пробу замість NP металів додавали 20 мМ Трис-НСІ буфер. Час інкубації тривав 10 хв. Реакцію 3 зупиняли додаванням 1 см 10 % розчину ТХО. Величину АТР-ої активності визначали спектрофотометрично за накопиченням неорганічного фосфору (Ρ;) методом Фіске-Суббароу, обчислювали за формулою 2: Dh  4  Ctg  1000 , (2) Bt де A - активність АТР-ази; B - кількість білка в пробі, мкг; t - час інкубації, що складає 10 хв; A 2 UA 92804 U 1000 - перерахунок мкг у мг; Dp - оптична густина проби, яка відповідає Pi за калібрувальною кривою; Ctg  Ctg кута нахилу калібрувальної кривої, який дорівнює 1,8; 4 - коефіцієнт перерахунку (враховують кювету при побудові калібрувальної кривої (0,25 см 5 10 - 1,00 см)). Результати виражали у відносних одиницях A / A0 , де A 0 - величина АТР-ної активності МФ "контрольної" проби; A - величина АТР-ної активності МФ після взаємодії з наночастками металів ("дослідна" проба). Активність ЛДГ-ази у "дослідній" та "контрольній" пробах визначали спектрофотометрично за швидкістю окиснення NADH у середовищі інкубації, що містить 50 мМ К-фосфатний буфер, 0,3 мМ піруват-Na та 9 мМ NADH (рН 7,5). Активність ЛДГ-ази виражали у мкмоль NADH /хвмг білка та розраховували за формулою 3: D  V , (3) 6,2  2  a де D - середнє значення зміни оптичної густини проби за 1 хв; 3 V - кінцевий об'єм проби, що дорівнює 3,15 см ; 6,22 - коефіцієнт мікромолярної екстинкції відновленої форми піридинових нуклеотидів; a - кількість білка в пробі, визначеного методом Лоурі, мг. A 15 20 25 30 35 Результати виражали у відносних одиницях, порівнюючи абсолютні величини ферментативних активностей "дослідного" та "контрольного" зразків. Токсичними вважали зразки NP металів у випадку стимуляції активності ЛДГ-ази за взаємодії з цитозольною фракцією клітин СНО-К1 не менш, ніж на 20 %, та інгібіції активності АТР-зи з мембранною фракцією не менш ніж на 50 %, відносно їх рівня у "контрольній" пробі. Результати досліджень загальної токсичності дослідних зразків гексаціаноферрату NPCo, саме NPCo, NPZn, NPAg, NPFe, NPCu та двоокису NPMn з субклітинними фракціями клітин СНО-К1 за визначенням величин біохімічних маркерів у порівнянні з такими в "контролі" наведені в таблиці 2. Так, визначено, що під впливом гексаціаноферрату NPCo і саме NPCo визначено вірогідне гальмування активності мембранної АТР-ази та посилення цитозольної ЛДГ-ази відносно їх значень в "контрольній" пробі. За додавання у інкубаційну суміш NPZn встановлювали тенденцію до зміни активностей індикаторних ферментів. Результати щодо активності ферментів у субклітинних фракціях клітин СНО-К 1 внаслідок взаємодії з NPAg, NPFe, NPCu та двоокису NPMn дозволяють вважати їх петоксичними, а враховуючи відсутність їх генотоксичної та мутагенної дії щодо тест-клітин, біобезпечними. За підсумком одержаних даних, було вибрано безпечні зразки NPAg, NPFe, NPCu та двоокису NPMn, як складові нанокомпозиту металів (НкМе) у аліквотному співвідношенні з 3 кінцевою концентрацією 100 мкг/см за кожним металом. Даний НкМе знайде широке впровадження і використання у технологіях отримання як біологічних засобів, так й кормових добавок (нанонутрицевтиків) з перспективою застосування у ветеринарній медицині та тваринництві. 40 3 UA 92804 U Таблиця 1 Значення індексу "ДНК-комет" за умов впливу дослідних наночасток металів щодо генетичного апарата ізольованих тест-клітин СНО-К1 (М±m; n=6) Наночастки металів, робоча концентрація, С, Індекс "ДНК-комет", ІДНК NPCo, вихідна С=1991,6 мкг/мл за металом NPCo (С-664.00 мкг/мл) 3,8+0,2*л NPCo (С= 124,00 мкг/мл) 3,4±0,2* NPCo (С=0,12 мкг/мл) 3,1±0,2* гексаціаноферат NPCo, вихідна С=2489,0 мкг/мл за металом гексаціаноферат NPCo (С=830,00 мкг/мл) 3,4±0,2* гексаціаноферат NPCo (С=155,00 мкг/мл) 3,0±0,2* гексаціаноферат NPCo (С=0,16 мкг/мл) 3,0±0,2* NPCu, вихідна С=2б78,б мкг/мл за металом NPCu (С-823,00 мкг/мл) 0,30±0,02* NPCu (С=226,00 мкг/мл) 0,10±0,02 NPCu (С=0,22 мкг/мл) 0,10±0,02 NPZn, вихідна С=2407,0 мкг/мл за металом NPZn (С=802,00 мкг/мл) 3,9±0,2* NPZn (С=150,00 мкг/мл) 3,8±0,2* NPZn (С=0,25 мкг/мл) 3,1±0,2* двоокис ΝΡΜη, вихідна 02785,0 мкг/мл за металом NPMn (С=928,00 мкг/мл) 0,03±0,01 NPMn (С=433,00 мкг/мл) 0,02±0,01 NPMn (С=238,00 мкг/мл) 0,02±0,01 NPMn (С=0,24 мкг/мл) 0,02±0,01 NPFe, вихідна С=3174,0 мкг/мл за металом NPFe (0=1061,00 мкг/мл) 0,010±0,001 NPFe (С=255,00 мкг/мл) 0,010±0,001 NPFe (С=0,25 мкг/мл) 0,010±0,001 NPAg, вихідна С-86,4 мкг/мл за металом NPAg (С=27,80 мкг/мл) 0,010±0,001 NPAg (С=0,28 мкг/мл) 0,010±0,001 контроль «Негативний" контроль (0,010±0,001)-(0,100±0,001) «Позитивний" контроль 3,9±0,1 Примітка. * - різниця значень вірогідна при (р0,05) відносно значень такого показника у "негативному" контролі. 4 UA 92804 U Таблиця 2 Активність мембранної АТР-ази та цитозольної ЛДГ- ази тест-клітин лінії СНО-К1 за впливу дослідних зразків наночасток металів (М±m; n=5). Активність ЛТР- ази, Наночастки металів/контроль Активність ЛДГ- ази, ум.од. ум.од. Контроль (субклітинні фракції інтактних 1,300±0,030 0,970±0,020 клітин) Субклітинні фракції + гексаціаноферат 1,080±0,006* 1,460±0,040* NPCo Субклітинні фракції + NPCo 1,020±0,002 1,520±0,052* Субклітинні фракції + NPZn 1,100±0,030 1,270±0,080 Субклітинні фракції + NPAg 1,220±0,005 0,900±0,002 Субклітинні фракції + NPFe 1,І20±0,007 1,140±0,006 Субклітинні фракції + NPCu 1,250±0,008 1,250±0,015 Субклітинні фракції + двоокису ΝΡΜη 1,310±0,025 1,080±0,004 Примітка. * - різниця значень вірогідна при (р0,05) відносно значень такого показника у контролі. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 Нанокомпозит металів, як потенційний компонент біопрепаратів і кормових добавок для тварин, що містить металеві наночастки, переважно сферичної форми, в якому розміри наночасток складають від 30 нм до 100 нм, метали вибрані з групи, що складається з срібла (Аргентуму), міді (Купруму), заліза (Феруму), оксиду марганцю (Мангану), який відрізняється тим, що наночастки синтезовані за методом хімічної конденсації та за умов дослідження in vitro на моделі субклітинних фракцій культури клітин СНО-К1 не проявляють загальної токсичності і генотоксичності та має наступний структурний, якісний та кількісний склад за співвідношенням компонентів, об'єм %: 3 колоїдний розчин наночасток Аргентуму (з концентрацією 1600,0 мкг/см за металом, середнього розміру (~31,5±0,9) нм) - 0,625 %; 3 колоїдний розчин наночасток Феруму (з концентрацією 10000,0 мкг/см , (~100,0±10,0) нм) 0,100 % 3 колоїдний розчин наночасток двоокису Мангану (з концентрацією 2785,0 мкг/см , (~50,0±3,0) нм) - 0,359 %; 3 колоїдний розчин наночасток Купруму (з концентрацією 2560,0 мкг/см , (~70,0±5,0) нм) 0,391 %; вода дистильована - 98,525 %. 5 UA 92804 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601