Трансгенна рослина кукурудзи, стійка до гербіцидів, та спосіб її ідентифікації

Реферат: Винахід стосується трансгенної рослини кукурудзи, яка має геном, що включає варіант трансформації AAD-1, насінини кукурудзи, що включає вказаний варіант трансформації AAD-1, їх потомства, виділеної полінуклеотидної молекули для виявлення трансформованої варіантом UA 114882 C2 (12) UA 114882 C2 AAD-1 кукурудзи, способів виявлення трансформованої кукурудзи, набору для здійснення таких способів та полінуклеотиду. UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Рівень техніки Ген aad-1 (початково виділений з Sphingobium gerbicidovorans) кодує білок арилоксіалканоатдіоксигенази (AAD-1). Дана ознака надає стійкість до гербіцидів на основі 2,4дихлорфеноксіоцтової кислоти і арилоксифеноксипропіонату (які звичайно визначаються як "фоп" гербіциди, такі як фізалофоп) і може бути використана як селектований маркер в процесі трансформації рослин і в селекційних розплідниках. Ген aad-1 як ген, що надає рослинам стійкість до гербіцидів, був вперше розкритий в публікації WO 2005/107437 (див. також US 20090093366). Експресія гетерологічних або чужорідних генів в рослинах залежить від місця інсерції чужорідного гена в хромосому. Дане явище може бути пов'язане, наприклад, зі структурою хроматину (наприклад, гетерохроматину) або з близькістю розташування елементів, регулюючих транскрипцію (наприклад, енхансерів), від сайта інтеграції (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Один і той же ген в трансгенній рослині (або іншому організмі) однакового типу може характеризуватися великою мінливістю рівня експресії серед різних подій. Крім того, можуть мати місце відмінності в просторових або часових патернах експресії. Наприклад, відмінності у відносній експресії трансгена в різних тканинах рослини можуть не відповідати патернам, очікуваним від регулюючих транскрипцію елементів у введеній генній конструкції. Таким чином, часто доводиться створювати і досліджувати велике число подій, щоб ідентифікувати подію, яка експресує введений для певної мети ген на задовільному рівні. Для досягнення комерційних цілей звичайно продукують сотні і тисячі різних подій, щоб виявити єдину подію, яка характеризується необхідними рівнями і патернами експресії трансгена. Подія, що характеризується необхідними рівнями і/або патернами експресії трансгена, має важливе значення для інтрогресії трансгена в інші генетичні середовища шляхом статевого ауткросингу стандартними методами селекції. Потомство таких гібридів зберігає характеристики експресії трансгена первинного трансформанта. Такий метод використовують для досягнення надійної експресії гена в ряді сортів, добре адаптованих до локальних умов вирощування. Заявки на патент США 20020120964 А1 і 20040009504 А1 стосуються події PVGHGT07(1445) бавовнику, способів його виявлення і композицій для здійснення вказаних способів. Заявка WO 02/100163 стосується події MONI5985 бавовнику, способів її виявлення і композицій для здійснення вказаних способів. Заявка WO 2004/011601 стосується події MON863 кукурудзи, способів її виявлення і композицій для здійснення вказаних способів. Заявка WO 2004/072235 стосується події MON88913 бавовнику, способів її виявлення і композицій для здійснення вказаних способів. Заявка WO 2006/098952 стосується події 3272 кукурудзи. Заявка WO 2007/142840 стосується події MIR162 кукурудзи. Патент США № 7179965 стосується бавовнику, що включає подію cry1F і подію cry1Ac. Даний винахід стосується кукурудзи AAD-1, що включає специфічну подію, раніше не описану в наукових публікаціях. Суть винаходу Даний винахід стосується події кукурудзи AAD-1, що одержала назву DAS-40278-9, насіння якої депоноване в Американську колекцію типових культур (АТСС) під номером доступу РТА10244, і потомства вказаної кукурудзи. Іншими об'єктами даного винаходу є подальші покоління рослин, насіння і зерна або регенеровані частини рослин і насіння і потомство кукурудзи, що включає подію DAS-40278-9, а також виготовлені з них харчові або кормові продукти. У обсяг даного винаходу також входять частини рослин кукурудзи, що містить подію DAS-40278-9, які включають, не обмежуючись ними, пилок, насінні зачатки, квітки, пагони, коріння і листя, ядра вегетативних клітин, клітини пилка і яйцеклітини. Даний винахід далі стосується рослин кукурудзи, що мають стійкість до гербіцидів на основі феноксіоцтової кислоти і/або арилоксіалканоату, нових генетичних композицій події DAS-40278-9 кукурудзи і деяких аспектів агрономічної продуктивності рослин кукурудзи, що включають подію DAS-40278-9. Даний винахід частково стосується селекції рослин і рослин, стійких до гербіцидів. Даний винахід стосується нової події трансформації гена aad-1 в рослинах кукурудзи, що включає полінуклеотидну послідовність за даним винаходом, яка введена в певний сайт геному клітини кукурудзи. У деяких варіантах здійснення винаходу вказана подія/полінуклеотидна послідовність можуть бути об'єднані з іншими ознаками, які включають, наприклад, інші гени стійкості до гербіцидів і/або інсектицидні білки. Однак даний винахід включає рослини, які мають одну подію, описану в даному описі винаходу. 1 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Додаткові ознаки можуть бути введені в геном рослини в результаті селекції рослин, повторної трансформації трансгенної рослини, що містить подію DAS-40278-9 кукурудзи, або додавання нових ознак шляхом направленої інтеграції методом гомологічної рекомбінації. Інші варіанти здійснення винаходу стосуються видалення полінуклеотидних послідовностей, що включають подію DAS-40278-9 кукурудзи, в тому числі, наприклад, касету експресії гена pat. В результаті видалення полінуклеотидної послідовності модифікована подія може бути перенацілена в певний сайт хромосоми, в якому додаткові полінуклеотидні послідовності об'єднані з подією DAS-40278-9 кукурудзи. Один варіант здійснення даного винаходу стосується хромосомного сайта-мішені кукурудзи, розташованого на хромосомі 2 на відстані приблизно 20 сМ між маркером UMC1265 (див. SEQ ID NO:30 і SEQ ID NO:31) і маркером ММС0111 (див. SEQ ID NO:32 і SEQ ID NO:33) простих повторів послідовності (SSR), на відстані приблизно 20 сМ на карті зчеплення генів кукурудзи DAS2008, де сайт-мішень включає гетерологічну нуклеїнову кислоту. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується сайта-мішені хромосомного набору кукурудзи, локалізованого в SEQ ID NO:29, і залишків вказаного сайта, розглянутих в даному описі винаходу і відомих фахівцю в даній галузі. Один варіант здійснення даного винаходу стосується способу створення трансгенної рослини кукурудзи, який включає введення гетерологічної нуклеїнової кислоти в певне положення хромосоми 2 на відстані приблизно 20 сМ між маркером UMC1265 (див. SEQ ID NO:30 і SEQ ID NO:31) і маркером ММС0111 (див. SEQ ID NO:32 і SEQ ID NO:33) SSR, на відстані приблизно 20 сМ на карті зчеплення генів кукурудзи DAS2008. У іншому варіанті здійснення винаходу інсертована гетерологічна нуклеїнова кислота фланкована біля 5'-кінця всією або частиною 5'-кінцевої фланкуючої послідовності, що визначається в даному описі винаходу з посиланням на SEQ ID NO:29, і фланкована біля 3'-кінця всією або частиною 5'кінцевої фланкуючої послідовності, що визначається в даному описі винаходу з посиланням на SEQ ID NO:29. Крім того, даний винахід стосується аналізів, призначених для виявлення даної події в зразку (наприклад, в зерні кукурудзи). Вказані аналізи можуть бути виконані на основі послідовності ДНК рекомбінантної конструкції, інсертованої в геном кукурудзи, і на основі геномних послідовностей, фланкуючих сайт інсерції. У обсяг даного винаходу також входять набори для виконання вказаних аналізів і умови їх використання. Таким чином, даний винахід частково стосується клонування і аналізу послідовностей ДНК повнорозмірної вставки AAD-1 і її крайових ділянок (в лініях трансгенної кукурудзи). Вказані послідовності є унікальними. На основі вказаної вставки і крайових послідовностей були створені подіє-специфічні праймери. Аналіз методом ПЛР показав, що вказані події можуть бути ідентифіковані в результаті аналізу ампліконів ПЛР, створених з використанням наборів подієспецифічних праймерів. Таким чином, вказані і інші методи можуть бути використані для ідентифікації ліній кукурудзи, що включають подію за даним винаходом. Короткий опис креслень На фігурі 1 показана карта плазміди pDAS1740. На фігурі 2 показані компоненти вставки для DAS-40278-9 (pDAS1740). На фігурі 3 показана рестрикційна карта і компоненти вставки для DAS-40278-9 (pDAS1740). На фігурі 4 показані амплікони, праймери і метод клонування ДНК-вставки і крайових послідовностей для DAS-40278-9. На фігурі 5 показані місцеположення праймерів відносно вставки і крайових послідовностей для DAS-40278-9. На фігурі 6 показані з'єднувальні ділянки і інсерція для DAS-40278-9. На фігурі 7 показана схема селекції, описана в прикладі 7. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1-28 являють собою праймери за даним винаходом. SEQ ID NO:29 являє собою вставку і фланкуючі послідовності для події DAS-40278-9. SEQ ID NO:30-33 являють собою праймери для фланкуючих маркерних послідовностей, описаних в прикладі 4. Докладний опис винаходу Даний винахід частково стосується селекції рослин і рослин, стійких до гербіцидів. Даний винахід стосується нових подій трансформації рослин кукурудзи (маїсу), що включають полінуклеотидні послідовності гена aad-1 за даним винаходом, інсертовані в певний сайт геному клітини кукурудзи. У деяких варіантах здійснення винаходу вказана полінуклеотидна послідовність, наприклад, може бути об'єднана з іншими ознаками (такими як інші гени стійкості до гербіцидів і/або гени, що кодують інсектицидні білки). У деяких варіантах здійснення 2 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу вказані полінуклеотидні послідовності можуть бути видалені і потім направлено зв'язані з додатковими полінуклеотидними послідовностями. Однак даний винахід стосується рослин, що включають одну подію за даним винаходом. Крім того, даний винахід стосується аналізів, призначених для виявлення в зразку події за даним винаходом. У обсяг даного винаходу входять способи створення і/або продукування будь-яких діагностичних молекул нуклеїнових кислот, представлених або запропонованих в даному описі винаходу, в основі яких, зокрема, лежить повне або часткове використання фланкуючих послідовностей за даним винаходом. Зокрема, даний винахід частково стосується події DAS-40278-9 трансгенної кукурудзи (відомої також як pDAS1740-278), ліній рослин, що включає вказані події, клонування і аналізу послідовностей ДНК вказаної вставки і/або її крайових ділянок. Лінії рослин за даним винаходом можуть бути виявлені за допомогою послідовностей, розглянутих і запропонованих в даному описі винаходу. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються ліній кукурудзи, стійкої до гербіцидів, і способів їх ідентифікації. Даний винахід частково стосується виявлення події за даним винаходом з метою визначення наявності події, що представляє інтерес, в потомстві гібриду. Крім того, в обсяг даного винаходу входить спосіб виявлення даної події, виконання якого необхідне, наприклад, для відповідності положенням, що вимагають передпродажного затвердження і маркування продуктів, одержаних, наприклад, з рослин рекомбінантної кукурудзи. Подію за даним винаходом можна виявити будь-яким добре відомим методом виявлення нуклеїнової кислоти, таким як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) або гібридизація ДНК за допомогою зондів нуклеїнової кислоти. Подіє-специфічний аналіз методом ПЛР описаний, наприклад, в публікації Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999). У даній публікації описана ідентифікація події стійкості до гліфосату 40-3-2 сої методом ПЛР з використанням набору праймерів, що заповнюють з'єднання між вставкою і фланкуючою ДНК. Зокрема, один праймер включав послідовність з вставки і другий праймер включав послідовність з фланкуючої ДНК. Кукурудза була модифікована шляхом введення гена aad-1 з Sphingobium herbicidovorans, що кодує білок арилоксіалканоатдіоксигенази (AAD-1). Дана ознака надає стійкість до гербіцидів на основі 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти і арилоксифеноксипропіонату (які звичайно визначаються як "фоп" гербіциди, такі як хізалофоп) і може бути використана як селектований маркер в процесі трансформації рослини і в селекційних розплідниках. Трансформація кукурудзи за допомогою фрагмента ДНК з плазміди pDAS1740 була виконана шляхом селекції з метою створення події DAS-40278-9. Зразки геномної ДНК, виділені з двадцяти рослин кукурудзи, одержаних з п'яти поколінь і чотирьох рослин в кожному поколінні події DAS-40278-9, були відібрані для молекулярного дослідження події DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1. Експресію білка AAD-1 досліджували за допомогою спеціального набору для експрес-аналізу AAD-1. Для подальшого молекулярного дослідження були відібрані тільки рослини з позитивною експресією білка AAD-1. Аналіз гібридизації методом саузерн-блотингу підтвердив наявність гена aad-1 в рослинах кукурудзи з позитивною експресією білка AAD-1, який був інсертований у вигляді однієї інтактної копії у вказані рослини в процесі гібридизації із зондом гена aad-1. У даному описі винаходу також розглянуте молекулярне дослідження ДНК, інсертованої у події DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1. Вказану подію було одержано методом точкової трансформації з використанням фрагмента Fsp I плазміди pDAS1740. Аналіз методом саузернблотингу був виконаний для визначення патерна інтеграції інсертованого фрагмента ДНК і виявлення числа вставок/копій гена aad-1 у події DAS-40278-9. Були одержані дані, які свідчать про інтеграцію і цілісність трансгена aad-1, інсертованого в геном кукурудзи. Була досліджена інтеграція некодуючих ділянок (призначених для регуляції кодуючих ділянок), таких як промотори і термінатори, ділянки приєднання матриці, RB7 Mar v3 і RB7 Mar v4, а також стійкість вставки трансгена в декількох поколіннях. Стійкість інсертованої ДНК була продемонстрована в п'яти поколіннях рослин. Крім того, за допомогою зондів, що охоплюють майже всю ділянку кістяка, фланкуючу сайти рестрикції (Fsp I) плазміди pDAS1740, була продемонстрована відсутність послідовності ділянки кістяка трансформуючої плазміди, що включає ген стійкості до ампіциліну (Ap'). Докладна фізична карта інсерції була створена на основі аналізів події DAS-40278-9, виконаних методом саузерн-блотингу. У тканинах кукурудзи визначали рівні білка AAD-1. Крім того, був виконаний аналіз складу стебел і зерен кукурудзи для дослідження відповідності між лінією ізогенної нетрансформованої кукурудзи і лінією трансформованої кукурудзи, що включає подію DAS-40278-9 (необприскана кукурудза, кукурудза, обприскана 2,4-D, обприскана хізалофопом і обприскана 2,4-D і 3 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 хізалофопом). Агрономічні характеристики лінії ізогенної нетрансформованої кукурудзи також порівнювали з кукурудзою, що включає подію DAS-40278-9. Експресію, склад поживних речовин і агрономічні показники нетрансгенної контрольної кукурудзи і лінії гібридної кукурудзи, що містить арилоксіалканоатдіоксигеназу-1 (AAD-1), досліджували в польових умовах в один і той же рік на шести ділянках, розташованих в штатах Айова, Іллінойс (2 ділянки), Індіана, Небраска і в провінції Онтаріо, Канада. У даному описі винаходу підсумовані рівні експресії білка AAD-1 в листі, пилку, корінні, стеблах, цілій рослині і зерні і представлені результати визначення агрономічних показників і аналізу складу зразків стебел і зерна контрольної кукурудзи і кукурудзи AAD-1, що включає подію DAS-40278-9. Розчинний екстрагований білок AAD-1 вимірювали за допомогою кількісного твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) в листі, пилку, корінні, стеблах, цілій рослині і зерні кукурудзи. Хороші середні значення експресії були одержані в тканинах коріння і пилка, які більш детально розглянуті в даному описі винаходу. Значення експресії були аналогічні для всіх обробок обприскуванням, а також для ділянок, які не обприскували і обприскували гербіцидом 2,4-D і хізалофопом. Аналізи складу, в тому числі загальних показників, мінеральних речовин, амінокислот, жирних кислот, вітамінів, шкідливих речовин і вторинних метаболітів виконували для дослідження відповідності між кукурудзою AAD-1, що включає подію DAS-40278-9 (обробленою і необробленою гербіцидами), і контрольною кукурудзою. Результати, одержані для складу всіх зразків кукурудзи AAD-1, що включає подію DAS-40278-9, відповідали або перевершували (в біологічному і агрономічному відношенні) результати, одержані для контрольних ліній і/або звичайної кукурудзи, при виконанні аналізу агрономічних даних для ділянок, на яких виростала контрольна кукурудза і кукурудза AAD-1, що включає подію DAS-40278-9. Як було указано вище в розділі "Рівень техніки", введення і інтеграція трансгена в геном рослини викликає появу деяких випадкових подій (звідси назва "подія" для даної експресованої інсерції). Тобто при використанні багатьох методів трансформації, таких як трансформація Agrobacterium, "генна рушниця" і точкова трансформація, неможливо передбачити, чи буде введений трансген в геном. Таким чином, ідентифікація фланкуючої геномної ДНК рослини з обох сторін вставки може мати важливе значення для виявлення рослини, яка має дану подію інсерції. Наприклад, можна створити праймери для ПЛР, що дозволяють одержати амплікон ПЛР в ділянці з'єднання вставки і геному-хазяїна. Вказаний амплікон ПЛР може бути використаний для ідентифікації унікального або відмінного типу події інсерції. Оскільки "події" спочатку є випадковими подіями, то як частина даного опису винаходу щонайменше 2500 насінин лінії кукурудзи, що включає дану подію, були депоновані, ставши надбанням громадськості без яких-небудь обмежень (але відповідно до патентних прав), в Американську колекцію типових культур (АТСС) за адресою 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Вказаному депозиту був наданий номер АТСС РТА-10244 (насіння гібриду кукурудзи Yellow Dent (Zea Mays L.): DAS-40278-9; депоновані компанією Dow AgroScience LLC; дата надходження насіння/штаму в АТСС: 10 липня 2009; життєздатність насіння підтверджена 17 серпня 2009). Даний депозит був зроблений і буде зберігатися відповідно до умов Будапештського договору про міжнародне визнання депонування насіння для цілей патентної процедури. Даний депозит буде зберігатися без яких-небудь обмежень в депозитарії АТСС, який є загальнодоступним депозитарієм, протягом 30 років або протягом п'яти років після останнього запиту або протягом ефективного часу дії патенту залежно від того, який з вказаних періодів часу є найбільш тривалим, і буде замінений, якщо стане нежиттєздатним протягом вказаного терміну. Депоноване насіння є частиною даного винаходу. Абсолютно ясно, що з вказаного насіння можуть бути вирощені рослини кукурудзи, і такі рослини також є частиною даного винаходу. Даний винахід також стосується послідовностей ДНК у вказаних рослинах кукурудзи, які придатні для виявлення таких рослин і їх потомства. Методи виявлення і набори за даним винаходом можуть бути використані для ідентифікації будь-якої однієї, двох або навіть всіх трьох вказаних подій залежно від кінцевої мети дослідження. Наведені в даному описі винаходу визначення термінів і приклади допомагають більш детально описати даний винахід і надають фахівцям в даній галузі необхідні вказівки для здійснення винаходу. За винятком особливо обумовлених випадків терміни мають загальноприйняті значення, відомі фахівцям в даній галузі. Номенклатура основ ДНК використана відповідно до розділу 37 Зводу федеральних правил, § 1.822. У використаному тут значенні термін "потомство" означає потомство будь-якого покоління батьківської рослини, що включає подію DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1. 4 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 Трансгенну "подію" одержують шляхом трансформації рослинних клітин гетерологічною ДНК, тобто конструкцією нуклеїнової кислоти, яка включає трансген, що представляє інтерес, регенерації популяції рослин, одержаної в результаті інсерції вказаного трансгена в геном рослини, і відбору конкретної рослини, що характеризується наявністю інсерції в певному положенні в геномі. Термін "подія" стосується первинного трансформанта і потомства вказаного трансформанта, що включає гетерологічну ДНК. Термін "подія" також стосується потомства, одержаного в результаті ауткросингу трансформанта з іншим сортом, що включає геномну/трансгенну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування з батьківською формою, з якою гібрид схрещується знову, введена трансгенна ДНК і фланкуюча геномна ДНК (геномна/трансгенна ДНК) з трансформованої батьківської форми присутня в потомстві гібриду в тому ж положенні в хромосомі. Термін "подія" також стосується ДНК первинного трансформанта і його потомства, що включає введену ДНК і фланкуючу геномну послідовність поруч з введеною ДНК, які повинні бути передані потомству, включаючи трансген, що представляє інтерес, в результаті схрещування однієї батьківської форми, яка включає введену ДНК (наприклад, первинний трансформант і потомство, одержане в результаті самозапилення), з батьківською формою, яка не містить введену ДНК. "З'єднувальна послідовність" заповнює ділянку, на якій ДНК, введена в геном, зв'язується з ДНК нативного геному кукурудзи, фланкуючою ділянку інсерції, при цьому для діагностики події достатньо ідентифікувати або виявити одну або декілька з'єднувальних послідовностей в генетичному матеріалі рослини. До таких послідовностей належать послідовності ДНК, що заповнюють місця вставки подій кукурудзи за даним винаходом, і фланкуючі ДНК однакової довжини. У даному описі винаходу наведені конкретні приклади таких діагностичних послідовностей; однак, інші послідовності, які перекривають місця з'єднання інсерцій або місця з'єднання інсерцій і геномної послідовності, також є діагностичними і можуть бути використані відповідно до даного винаходу. Даний винахід стосується ідентифікації таких фланкуючих, з'єднувальних послідовностей і послідовностей вставок. У обсяг даного винаходу входять відповідні праймери і амплікони ПЛР. Відповідно до даного винаходу для виявлення або ідентифікації промислових сортів трансгенної кукурудзи або ліній, виділених з ліній трансгенної кукурудзи, які є приватною власністю, можуть бути використані методи ПЛР із застосуванням ампліконів, розташованих поруч з введеною ДНК і її крайовими послідовностями. Повні послідовності всіх вказаних вставок нарівні з частинами відповідних фланкуючих послідовностей представлені в даному описі винаходу у вигляді SEQ ID NO:29. Нижче наведені координати вставки і фланкуючих послідовностей для цієї події відносно SEQ ID NO:29 (всього 8557 пар основ). Дане питання більш детально розглянуте в прикладі 3.8. 5'-кінцева фланкуюча послідовність Номери залишків (SEQ ID NO:29) Довжина (п.о.) 40 45 50 55 Вставка 3'-кінцева фланкуюча послідовність 1-1873 1874-6689 6690-8557 1873 п.о. 4816 п.о. 1868 п.о. Дана інсерційна подія і його компоненти далі проілюстровані на фігурах 1 і 2. Зазначені послідовності (зокрема, фланкуючі послідовності) є унікальними. На основі вказаної вставки і крайових послідовностей були створені подіє-специфічні праймери. Аналіз методом ПЛР показав, що вказані лінії кукурудзи можуть бути ідентифіковані в різних генотипах кукурудзи шляхом аналізу ампліконів ПЛР, створених за допомогою наборів подіє-специфічних праймерів. Таким чином, для ідентифікації вказаних ліній кукурудзи можуть бути використані вищезгадані і інші споріднені методи. Послідовності, ідентифіковані вказаними методами, є унікальними. Наприклад, пошук за допомогою програми BLASТ в базах даних GENBANK, не виявив якоїнебудь значної гомології між клонованими крайовими послідовностями і послідовностями в базі даних. Методи виявлення за даним винаходом особливо корисні в поєднанні з селекцією рослин для визначення потомства рослин, що включає дану подію, яку було одержано після схрещування батьківської рослини, що включає подію, що представляє інтерес, з іншою лінією рослин з метою надання вказаному потомству однієї або декількох додаткових ознак. Вказані методи ПЛР дозволяють ефективно розробляти програми селекції кукурудзи і контролювати якість, зокрема, промислового насіння трансгенної кукурудзи. На даний час також можуть бути створені і використані набори для виявлення методом ПЛР вказаних ліній трансгенної кукурудзи. Вказані методи також дозволяють реєструвати і зберігати продукти. 5 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Крім того, фланкуючі/геномні послідовності кукурудзи можуть бути використані для специфічної ідентифікації локалізації кожної вставки в геномі. Така інформація може бути використана для створення систем молекулярних маркерів, специфічних до кожної події. Вказані послідовності можуть бути використані для прискореної селекції і одержання даних про зчеплення генів. Інформація про фланкуючі послідовності може бути далі використана для вивчення і дослідження процесів інтеграції трансгенів, визначення сайтів для інтеграції трансгенів в геномі, сортування подій, визначення стійкості трансгенів і їх фланкуючих послідовностей і експресії генів (особливо відносно сайленсингу генів, патернів метилування трансгенів, впливу положення і можливих елементів, що визначають експресію, таких як Mar [ділянки приєднання матриці] і тому подібних). У світлі даного опису винаходу повинно бути ясно, що в обсяг даного винаходу входить насіння, депоноване в АТСС під номером РТА-10244. Даний винахід також стосується рослини кукурудзи, стійкої до гербіцидів, вирощеної з насіння, депонованого в АТСС під номером доступу РТА-10244. Даний винахід далі стосується частин вказаної рослини, таких як листя, зразки тканин, насіння, вироблене вказаною рослиною, пилок і тому подібні. Даний винахід далі стосується походження і/або потомства рослин, вирощених з депонованого насіння, переважно рослини кукурудзи, стійкої до гербіцидів, геном якої включає виявлювану послідовність, яка з'єднує геномну ДНК дикого типу/вставну ДНК, за даним винаходом. У використаному тут значенні термін "кукурудза" означає маїс (Zea mays), і у визначення даного терміну входять всі сорти, які можуть бути одержані в результаті селекції кукурудзи. Даний винахід далі стосується способів одержання гібридів при використанні рослини за даним винаходом як щонайменше однієї батьківської форми. Наприклад, даний винахід стосується гібридної рослини F1, що має як одну або обидві батьківські форми будь-які рослини за даним винаходом. Крім того, в обсяг даного винаходу входить насіння, вироблене такими гібридами F1 за даним винаходом. Даний винахід стосується способу одержання насіння гібриду F1 шляхом схрещування вказаної рослини з іншою (наприклад, інбредною батьківською лінією) рослиною і одержання гібридного насіння. Даний винахід стосується вказаної рослини, яка є материнською або батьківською формою. Характеристики одержаних рослин можуть бути поліпшені в результаті ретельного відбору батьківських рослин. Рослина кукурудзи, стійкої до гербіцидів, може бути одержана в результаті первинного схрещування першої батьківської рослини кукурудзи, вирощеної з насіння будь-якої лінії за даним винаходом, і другої батьківської рослини кукурудзи, що дозволяє одержати множину рослин першого потомства; і потім відбору рослини першого потомства, стійкого до гербіцидів (або яке містить щонайменше одну з подій за даним винаходом); і самозапилення рослини першого потомства, що дозволяє одержати множину рослин другого потомства; і потім відбору з рослин другого потомства однієї рослини, стійкої до гербіцидів (або яка містить щонайменше одну з подій за даним винаходом). Вказані стадії можуть далі включати зворотне схрещування рослини першого потомства або рослини другого потомства з другою батьківською рослиною кукурудзи або третьою батьківською рослиною кукурудзи. Потім може бути посіяне насіння кукурудзи за даним винаходом або його потомство. Потрібно також зазначити, що можуть бути схрещені дві різних трансгенних рослини з метою одержання потомства, що містить два незалежно доданих екзогенних гени. В результаті самозапилення відповідного потомства можуть бути одержані рослини, які є гомозиготними для обох доданих екзогенних генів. У обсяг даного винаходу також входить зворотне схрещування батьківської рослини і ауткросинг з нетрансгенною рослиною як вегетативне розмноження. У даній галузі відомі інші методи селекції, звичайно використовувані для надання рослинам різних ознак і одержання сільськогосподарських культур. Селекцію методом зворотного схрещування використовують для перенесення генів з метою створення спадкової і добре успадковуваної ознаки в необхідному гомозиготному культиварі або інбредній лінії, що є батьківською формою, з якою гібрид схрещується знову. Джерело ознаки, що передається, іменується батькомдонором. Передбачається, що одержана рослина повинна мати ознаки батьківської форми, з якою гібрид схрещується знову (тобто культивара), і необхідну ознаку, перенесену від батькадонора. Після первинного схрещування відбирають рослини, які мають фенотип батька-донора, і повторно схрещують (зворотне схрещування) з батьківською формою, з якою гібрид схрещується знову. Передбачається, що одержана батьківська форма повинна мати ознаки батьківської форми, з якою гібрид схрещується знову (наприклад, культивара), і необхідну ознаку, перенесену від батька-донора. 6 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Молекули ДНК за даним винаходом можуть бути використані як молекулярні маркери при здійсненні методу селекції з використанням маркерів (МАВ). Молекули ДНК за даним винаходом (такі як маркери AFLP, маркери RFLP, маркери RAPD, SNP і SSR) можуть бути використані в методах, які дозволяють ідентифікувати генетично пов'язані агрономічно корисні ознаки, відомі в даній галузі. Ознака стійкості до гербіцидів може бути простежена в потомстві гібриду рослини кукурудзи за даним винаходом (або в його потомстві і в будь-якому іншому культиварі або сорті кукурудзи) за допомогою методів МАВ. Молекули ДНК є маркерами даної ознаки, і методи МАВ, добре відомі в даній галузі, можуть бути використані для відстеження ознаки стійкості до гербіцидів в рослинах кукурудзи, якщо щонайменше одна лінія кукурудзи за даним винаходом або її потомство були батьком або предком. Способи за даним винаходом можуть бути використані для ідентифікації будь-якого сорту кукурудзи, що має подію за даним винаходом. Способи за даним винаходом включають одержання рослини кукурудзи, стійкої до гербіцидів, шляхом селекції рослини за даним винаходом. Зокрема, вказані способи можуть включати схрещування двох рослин за даним винаходом або однієї рослини за даним винаходом і будь-якої іншої рослини. Переважні способи далі включають відбір потомства вказаного гібриду шляхом дослідження потомства відносно наявності події, виявлюваної методами за даним винаходом. Наприклад, даний винахід може бути використаний для відстеження події за даним винаходом протягом декількох циклів селекції рослин, що включають інші необхідні ознаки, зокрема агрономічні ознаки, аналізовані в різних прикладах, наведених в даному описі винаходу. Рослини, що включають подію за даним винаходом і необхідну ознаку, наприклад, можуть бути виявлені, ідентифіковані, відібрані і швидко використані в подальших циклах селекції. Подія за даним винаходом/ознака можуть бути також об'єднані в процесі селекції і відстежені відповідно до даного винаходу нарівні з ознакою стійкості до впливу комах і/або іншими ознаками стійкості до гербіцидів. Один переважний варіант здійснення винаходу стосується рослини, що включає подію за даним винаходом, об’єднану з геном, що кодує стійкість до гербіциду дикамба. Таким чином, даний винахід може бути, наприклад, об'єднаний з ознаками, що кодують стійкість до гліфосату (наприклад, рослини, стійкі до бактеріальних генів EPSPS, GOX, GAT), стійкість до глюфозинату (наприклад, Pat, bar), стійкість до гербіциду, інгібуючого ацетолактатсинтазу (ALS) (наприклад, імідазолінони [такі як імазетапір], сульфонілсечовини, триазолопіримідинсульфонанілід, піримідинілтіобензоат і інші хімічні речовини [Csr1, SurA і т. д.]), стійкість до бромоксинілу (наприклад, Bxn), стійкість до інгібіторів ферменту HPPD (4гідроксифенілпіруватдіоксигеназа), стійкість до інгібіторів фітоєндезатурази (РDS), стійкість до гербіцидів, інгібуючих фотосистему II (наприклад, psbA), стійкість до гербіцидів, інгібуючих фотосистему I, стійкість до гербіцидів, інгібуючих протопорфіриногеноксидазу IX (РРО) (наприклад, РРО-1), стійкість до гербіцидів на основі фенілсечовини (наприклад, CYP76B1), ферменти, що розщеплюють гербіцид дикамба (див., наприклад, заявку на патент США 20030135879), і іншими, які можуть бути використані окремо або в різних комбінаціях, забезпечуючи ефективне знищення або запобігання поширенню бур'янів і/або стійкість до будьякого гербіциду вищезгаданих класів. Що стосується додаткових гербіцидів, то як деякі додаткові переважні інгібітори ALS (відомі також як AHAS) можна указати триазолопіримідинсульфонаніліди (такі як клоранзулам-метил, диклозулам, флоразулам, флуметзулам, метозулам і пеноксзулам), піримідинілтіобензоати (такі як біспірибак і піритіобак) і флукарбазон. Деякі переважні інгібітори HPPD включають мезотріон, ізоксафлутол і сулкотріон. Деякі переважні інгібітори РРО включають флуміклорак, флуміоксазин, флуфенпір, пірафлуфен, флутіацет, бутафенацил, карфентразон, сулфентразон і прості дифенілові ефіри (такі як ацифлуорфен, фомесафен, лактофен і оксифлуорфен). Крім того, AАD-1 окремо або в поєднанні з однією або декількома додатковими ознаками НТС може бути об'єднаний з однією або декількома додатковими первинними ознаками (такими як, наприклад, стійкість до впливу комах, стійкість до грибів або стійкість до стресу і т. д.) або вторинними ознаками (такими як, наприклад, більш висока врожайність, кращий профіль виходу олії, краща якість клітковини і т. д.). Таким чином, даний винахід може бути використаний для створення повного агрономічного набору поліпшених якостей культури з можливістю гнучкої і економічно ефективної боротьби з цілим рядом сільськогосподарських шкідників. У даній галузі описані методи введення полінуклеотидної послідовності в конкретну ділянку хромосоми рослинної клітини шляхом гомологічної рекомбінації. Наприклад, метод сайтспецифічної інтеграції, описаний в публікації заявки на патент США № 2009/0111188 А1, передбачає використання рекомбіназ або інтеграз, що опосередковують введення полінуклеотидної послідовності донора в хромосому-мішень. Крім того, в міжнародній заявці на патент № WO 2008/021207 описаний метод гомологічної рекомбінації, опосередковуваної 7 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цинковмісною пальцеподібною ділянкою, для введення однієї або декількох полінуклеотидних послідовностей донора в певні положення геному. Для введення полінуклеотидної послідовності в певну ділянку хромосоми можуть бути використані рекомбінази, такі як FLP/FRT, описані в патенті США № 6720475, або CRE/LOX, описані в патенті США № 5658772. І нарешті, мегануклеази, використовувані для направленого введення донорських полінуклеотидів в певну ділянку хромосоми, були описані в публікації Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060. Добре відомі і широко застосовуються різні інші методи сайт-специфічної інтеграції в рослинні клітини (Kumor et al., Trands in Plant Sсi. 6(4) (2001) pp. 155-159). Крім того, для модифікації рослин можуть бути використані системи сайт-специфічної рекомбінації, ідентифіковані в декількох прокаріотичних і нижчих еукаріотичних організмах. Приклади таких систем включають, не обмежуючись ними, систему рекомбіназ R/RS з плазміди pSR1 дріжджів Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182:191-203) і систему Gin/gix фага Mu (Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176). У деяких варіантах здійснення даного винаходу може бути бажано інтегрувати або приєднати новий трансген(и) поруч з існуючою трансгенною подією. Трансгенною подією може бути переважний геномний локус, вибраний на основі унікальних характеристик, таких як єдиний сайт інсерції, нормальне менделівське розщеплення, стійка експресія і краща комбінація ефективності, що включає стійкість до гербіцидів і агрономічну продуктивність в різних оточеннях. Знову інтегровані трансгени повинні зберігати характеристики експресії трансгенів існуючих трансформантів. Крім того, розроблені аналізи, призначені для виявлення і підтвердження наявності знову інтегрованої події, які дозволяють ідентифікувати фланкуючі послідовності і положення в хромосомі знову інтегрованої події. І нарешті, введення нового трансгена в певну ділянку хромосоми, зв'язану з існуючим трансгеном, дозволить прискорити інтрогресію трансгенів в інші генетичні середовища в результаті ауткросингу за допомогою стандартних методів селекції. У деяких варіантах здійснення даного винаходу може бути бажано видалити полінуклеотидні послідовності з трансгенної події. Наприклад, видалення трансгена, описане в попередній заявці на патент США № 61/297628, передбачає використання нуклеаз цинковмісної пальцеподібної ділянки для видалення полінуклеотидної послідовності, що складається з полігенної касети експресії, з введеної в хромосому трансгенної події. Полінуклеотидна послідовність, що видаляється, може бути селектованим маркером. Після ексцизії і видалення полінуклеотидної послідовності модифікована трансгенна подія може бути перенацілена шляхом інсерції полінуклеотидної послідовності. Ексцизія полінуклеотидної послідовності і подальше перенацілювання модифікованої трансгенної події створюють такі переваги як можливість повторного використання селектованого маркера або усунення випадкових змін транскриптоми рослини, виникаючих в результаті експресії специфічних генів. Даний винахід стосується певного сайта в хромосомі 2 геному кукурудзи, який добре придатний для інсерції гетерологічних нуклеїнових кислот. Крім того, в обсяг даного винаходу входять 5'-кінцевий молекулярний маркер, 3'-кінцевий молекулярний маркер, 5'-кінцева фланкуюча послідовність і 3'-кінцева фланкуюча послідовність, використовувані для ідентифікації локалізації сайта-мішені в хромосомі 2. Таким чином, даний винахід стосується способів введення гетерологічних нуклеїнових кислот, що представляють інтерес, в попередньо визначений сайт-мішень або поруч з вказаним сайтом-мішенню. Даний винахід також стосується насіння і/або рослини кукурудзи, що включають будь-яку гетерологічну нуклеотидну послідовність, яка введена у вказаний сайт-мішень або розташована в безпосередній близькості від такого сайта. Одним способом здійснення такої цілеспрямованої інтеграції є ексцизія і/або заміна касети експресії гена pat іншою вставкою за даним винаходом. Таким чином, цілеспрямована гомологічна рекомбінація, наприклад і без обмежень, може бути використана відповідно до даного винаходу. У використаному тут значенні термін "стекінг" генів, подій або ознак означає об'єднання бажаних ознак в одній трансгенній лінії. Селекціонери рослин об'єднують трансгенні ознаки шляхом схрещування батьківських форм, кожна з яких має необхідну ознаку, з подальшою ідентифікацією потомства, що має обидві необхідні ознаки. Іншим способом стекінгу генів є одночасне перенесення двох або більше генів в ядро клітини рослини в процесі трансформації. Іншим способом стекінгу генів є повторна трансформація трансгенної рослини іншим геном, що представляє інтерес. Наприклад, стекінг генів може бути використаний для об'єднання двох або більше різних ознак, що включають, наприклад, дві або більше різних ознак стійкості до впливу комах і ознак стійкості до хвороб, дві або більше ознак стійкості до гербіцидів і/або ознак стійкості до впливу комах і ознак стійкості до гербіцидів. Використання селектованого маркера крім гена, що представляє інтерес, також може вважатися стекінгом генів. 8 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "гомологічна рекомбінація" означає взаємодію будь-якої пари нуклеотидних послідовностей, які мають відповідні сайти, що містять подібну нуклеотидну послідовність, за допомогою якої дві вказані нуклеотидні послідовності можуть взаємодіяти (рекомбінувати) з утворенням нової послідовності рекомбінантної ДНК. Сайти подібної нуклеотидної послідовності визначаються в даному описі винаходу як "гомологічна послідовність". Частота гомологічної рекомбінації звичайно зростає із збільшенням довжини гомологічної послідовності. Таким чином, хоч гомологічна рекомбінація може відбуватися між двома нуклеотидними послідовностями, які є недостатньо ідентичними, частота (або ефективність) рекомбінації зменшується при збільшенні розходження між двома послідовностями. Рекомбінація може бути здійснена при використанні однієї гомологічної послідовності в донорській молекулі і молекулімішені, в результаті чого утворюється продукт рекомбінації "одного кросинговеру". Альтернативно в нуклеотидну послідовність-мішень і донорську нуклеотидну послідовність можуть бути введені дві гомологічні послідовності. В результаті рекомбінації двох гомологічних послідовностей донорської молекули з двома гомологічними послідовностями мішені утворюється продукт рекомбінації "двох кросинговерів". Якщо гомологічні послідовності в донорській молекулі фланкують послідовність, призначену для маніпуляції (наприклад, послідовність, що представляє інтерес), рекомбінація молекули-мішені двома кросинговерами дозволяє одержати продукт рекомбінації, в якому послідовність, що представляє інтерес, замінює послідовність ДНК, яка початково знаходилася між гомологічними послідовностями в молекулі-мішені. Обмін послідовностями ДНК між мішенню і донором в результаті рекомбінації "двома кросинговерами" іменується "заміною послідовності". Фермент AAD-1 за даним винаходом робить можливою експресію трансгена, яка визначає стійкість до комбінацій гербіцидів, що знищують майже всі широколисті і трав'янисті бур'яни. AAD-1 може бути прекрасною ознакою стійкості культури до гербіциду (HTC), що об'єднується з іншими ознаками HTC (такими як, наприклад, стійкість до гліфосату, стійкість до глюфозинату, стійкість до імідазолінону, стійкість до бромоксинілу і т. д.) і ознаками стійкості до впливу комах (Cry1F, Cry1Ab, Cry34/45 і т. д.). Крім того, AAD-1 може бути селектованим маркером, який допомагає відібрати первинні трансформанти рослин, генетично створені з використанням другого гена або групи генів. Ознаки НТС за даним винаходом можуть бути використані в нових комбінаціях з іншими ознаками НТС (які включають, не обмежуючись ними, стійкість до гліфосату). Вказані комбінації ознак дозволяють створити нові методи знищення бур'янів (і подібних видів) завдяки знову набутій або спадковій стійкості до гербіцидів (наприклад, до гліфосату). Таким чином, в обсяг даного винаходу входять, крім ознак НТС, нові способи знищення бур'янів за допомогою гербіцидів, в яких стійкість до гербіцидів була досягнута в результаті введення вказаного ферменту в трансгенні культури. Крім того, у всьому світі переважно вирощують сільськогосподарські культури, стійкі до гліфосату. При багаторазовому чергуванні з іншими сільськогосподарськими культурами, стійкими до гліфосату, можуть виникнути труднощі із знищенням рослин-самосівів, стійких до гліфосату, в сівозмінних культурах. Таким чином, використання трансгенних ознак за даним винаходом, спільно або окремо введених в сільськогосподарські культури, робить можливим знищення інших рослин-самосівів з ознаками НТС. Переважна рослина або насінина за даним винаходом містить в своєму геномі послідовності вставок поряд щонайменше з 20-500 або більшим числом суміжних фланкуючих нуклеотидів з обох сторін вставки. За винятком особливо обумовлених випадків фланкуючі послідовності є послідовностями, представленими в SEQ ID NO:29 (див. наведену вище таблицю). SEQ ID NO:29 включає гетерологічну ДНК, введену в первинний трансформант, і ілюстративні фланкуючі геномні послідовності, розташовані поруч з введеною ДНК. Вказані фланкуючі послідовності можуть бути повністю або частково передані потомству, яке одержує введену ДНК в результаті схрещування батьківської лінії, що включає дану подію. Даний винахід стосується культур тканин регенерованих клітин рослини за даним винаходом. У обсяг даного винаходу також входить рослина, регенерована з такої культури тканин, зокрема, коли вказана рослина може експресувати всі морфологічні і фізіологічні властивості представленого сорту. Переважні рослини за даним винаходом мають всі фізіологічні і морфологічні властивості рослини, вирощеної з депонованого насіння. Даний винахід далі стосується потомства такого насіння і насіння, що має якісні ознаки, що представляють інтерес. Маніпуляції (такі як мутація, подальша трансфекція і селекція) з рослинами або насінням або їх частинами можуть привести до створення так званих "по суті похідних" сортів. 9 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Міжнародний союз по захисту нових сортів рослин (UPOV) виробив наступне керівництво для визначення сорту, який є по суті похідним захищеного сорту: [А] сорт потрібно вважати по суті похідним іншого сорту ("первинного сорту"), якщо (i) даний сорт в основному виділений з первинного сорту або з сорту, який сам був виділений з первинного сорту, при збереженні експресії основних характеристик, властивих генотипу або комбінації генотипів первинного сорту; (ii) даний сорт має явні відмінності від первинного сорту; і (iii) за винятком відмінностей, що виникли в результаті деривації, даний сорт відповідає первинному сорту відносно експресії основних характеристик, властивих генотипу або комбінації генотипів первинного сорту. UPOV, шостий з'їзд Міжнародних організацій, Женева, 30 жовтня 1992 р.; документ підготовлений президією Союзу. У використаному тут значенні термін "лінія" означає групу рослин, які характеризуються незначною або відсутністю спадкової мінливості серед особнів відносно щонайменше однієї ознаки. Такі лінії можуть бути створені декількома поколіннями самозапилення і селекції або вегетативного розмноження з однієї батьківської форми за допомогою методів з використанням культур тканин або клітин. У використаному тут значенні терміни "культивар" і "сорт" є синонімами і означають лінію, використовувану для промислового виробництва. Термін "стійкість" або "стійкий" застосовно до певного компонента означає збереження даного компонента з покоління в покоління, переважно протягом щонайменше трьох поколінь по суті на одному і тому ж рівні, наприклад переважно ±15%, більш переважно ±10%, найбільш переважно ±5%. На стійкість може впливати температура, місцеположення, стрес і час посіву. При порівнянні подальших поколінь в польових умовах вказаний компонент повинен бути виявлений аналогічним чином. Термін "комерційна корисність" означає хорошу потужність рослини і високу фертильність, завдяки яким фермери можуть вирощувати дану сільськогосподарську культуру з використанням звичайних сільськогосподарських машин і можуть екстрагувати з насіння олію з необхідними компонентами за допомогою звичайного подрібнюючого і екстрагуючого обладнання. Врожайність комерційно корисної культури, виміряна з урахуванням маси насіння, вмісту олії і загальної кількості олії, одержаної на акр площі, повинна становити 15% від середньої врожайності іншого комерційного порівнюваного сорту, що не має першосортних ознак, який був вирощений в тому ж регіоні. Термін "агрономічно елітна" означає лінію, яка має необхідні агрономічними характеристики, такі як врожайність, дозрівання, стійкість до хвороб і тому подібні, крім стійкості до впливу комах, завдяки наявності однієї або декількох подій за даним винаходом. У обсяг даного винаходу входять агрономічні ознаки, що розглядаються окремо або в будь-якій комбінації в наведених нижче прикладах, які має рослина, що включає подію за даним винаходом. Будь-які і всі вказані агрономічні характеристики і дані можуть бути використані для ідентифікації таких рослин на основі однієї ознаки, частини діапазону або всього діапазону характеристик, використовуваних для визначення таких рослин. Як повинно бути зрозуміло фахівцю в даній галузі в світлі даного опису винаходу, переважні варіанти наборів для виявлення ознак за даним винаходом можуть включати, наприклад, зонди і/або праймери, які призначені для створення і/або включають "з'єднувальні послідовності" або "перехідні послідовності" (де геномна фланкуюча послідовність кукурудзи стикується з послідовністю вставки). Наприклад, даний набір включає полінуклеотидні зонди, праймери і/або амплікони, створені для ідентифікації однієї або обох з'єднувальних послідовностей (де вставка стикується з фланкуючою послідовністю), представлені в таблиці 1. Однією загальною особливістю такого набору є наявність одного праймера, що гібридизується у фланкуючій ділянці, і одного праймера, що гібридизується у вставці. Такі праймери часто мають довжину, що дорівнює щонайменше приблизно ~15 залишкам. Вказані праймери можуть бути використані для створення/ампліфікації виявлюваного амплікона, що вказує на наявність події за даним винаходом. Праймери можуть бути використані для створення амплікона, що заповнює (і включає) вищезгадану з'єднувальну послідовність. Праймер(и), "який забезпечує з'єднання" у фланкуючій послідовності, звичайно не гібридизується на відстані більше приблизно 200 основ або за межами з'єднання. Таким чином, типові фланкуючі праймери включають щонайменше 15 залишків ланцюга в межах 200 основ фланкуючих послідовностей від початку вставки. Тобто в обсяг даного винаходу входять праймери, які включають послідовність відповідної довжини, що складається із залишків ~16741873 і/або ~6690-6890 SEQ ID NO:29. Праймери для вставки можуть бути створені аналогічним 10 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином в будь-якому місці вставки, але для створення таких праймерів можуть бути також використані залишки ~1874-2074 і ~6489-6689. Фахівцю в даній галузі повинно бути також відомо, що праймери і зонди можуть бути створені з можливістю гібридизації в стандартних умовах гібридизації і/або ПЛР з сегментом SEQ ID NO:29 (або комплементом) і комплементарними їй послідовностями, коли праймер або зонд не є повністю комплементарним наведеній послідовності. Тобто допустима деяка міра помилкового спарювання. Наприклад, в праймері, що складається приблизно з 20 нуклеотидів, звичайно один, два або близько до цього нуклеотидів можуть не зв'язуватися з протилежним ланцюгом, якщо помилково спарена основа знаходиться всередині або біля кінця праймера, протилежного амплікону. Нижче наведені різні прийнятні умови гібридизації. У зондах також можуть бути використані синтетичні аналоги нуклеотидів, такі як інозин. Також можуть бути використані пептидні зонди нуклеїнової кислоти (PNA), а також ДНК- і РНК-зонди. Важливо, щоб такі зонди і праймери дозволяли діагностувати (однозначно ідентифікувати і виявляти) наявність події за даним винаходом. Потрібно зазначити, що при ампліфікації методом ПЛР можуть виникати помилки, які викликають, наприклад, незначні помилки секвенування. Тобто, за винятком особливо обумовлених випадків, послідовності, наведені в даному описі винаходу, були визначені в результаті створення довгих ампліконів з геномних ДНК кукурудзи, після чого амплікони клонували і секвенували. У послідовностях, створених і визначених таким чином, цілком ймовірно, можуть бути виявлені невеликі відмінності і незначні розходження, пов'язані з численними циклами ампліфікації, необхідними для створення амплікона достатньої довжини для секвенування з геномних ДНК. Фахівцю в даній галузі повинно бути зрозуміло, що в обсяг даного винаходу входять будь-які коректування, необхідні в зв'язку з виникненням звичайних помилок секвенування або розходжень вказаних типів. Потрібно також зазначити, що можливе видалення деякої геномної послідовності, наприклад, при введенні послідовності в процесі створення події. Таким чином, фланкуючі послідовності за даним винаходом можуть дещо відрізнятися від геномних послідовностей, представлених, наприклад, в базі даних GENBANK. Деякі з вказаних відмінностей розглянуті нижче в розділі "Приклади". Також можуть бути зроблені коректування зондів і праймерів. Компоненти кожної з "вставок" показані на фігурах 1 і 2 і більш детально розглянуті нижче в розділі "Приклади". Полінуклеотидні послідовності ДНК вказаних компонентів або їх фрагменти можуть бути використані як ДНК-праймери або зонди при здійсненні способів за даним винаходом. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються способів виявлення трансгена/інсерційної ділянки геному в рослинах, насінні і подібних частинах рослини кукурудзи, і композицій для здійснення вказаних способів. Створені послідовності ДНК, що включають з'єднувальну послідовність трансгена/інсерційної ділянки геному за даним винаходом (між залишками 18731874 і 6689-6690 SEQ ID NO:29), їх сегменти, комплементи наведених послідовностей і будь-які їх сегменти. З'єднувальна послідовність інсерційної ділянки заповнює з'єднання між гетерологічною ДНК, введеною в геном, і ДНК з клітини кукурудзи, фланкуючої сайт інсерції. Такі послідовності дозволяють діагностувати дану подію. На основі вказаної вставки і крайових послідовностей можуть бути створені подіє-специфічні праймери. Аналіз методом ПЛР показав, що лінії кукурудзи за даним винаходом можуть бути ідентифіковані в різних генотипах кукурудзи шляхом аналізу ампліконів ПЛР, створених за допомогою наборів подіє-специфічних праймерів. Для ідентифікації ліній кукурудзи за даним винаходом можуть бути використані вищезгадані і інші споріднені методи. Таким чином, амплікони ПЛР, одержані з таких пар праймерів, є унікальними і можуть бути використані для ідентифікації вказаних ліній кукурудзи. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються послідовностей ДНК, які включають суміжний фрагмент нового трансгена/інсерційної ділянки геному. У обсяг даного винаходу входять послідовності ДНК, які включають полінуклеотиди послідовності вставки трансгена достатньої довжини і полінуклеотиди геномної послідовності кукурудзи достатньої довжини, з однієї або більше ніж з трьох вищезгаданих рослин кукурудзи, і/або послідовності, придатні для використання як послідовності праймерів з метою одержання амплікона, що дозволяє діагностувати одну або декілька вказаних рослин кукурудзи. Споріднені варіанти здійснення винаходу стосуються послідовностей ДНК, які включають щонайменше 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше суміжних нуклеотидів частини трансгена послідовності ДНК, наведеної в даному описі винаходу (такої як SEQ ID NO:29 і її сегменти), або комплементарних їй послідовностей, і 11 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фланкуючої послідовності ДНК кукурудзи аналогічної довжини з вказаних послідовностей або комплементарних ним послідовностей. Такі послідовності можуть бути використані як ДНКпраймери при здійсненні методів ампліфікації ДНК. Амплікони, одержані за допомогою вказаних праймерів, дозволяють діагностувати будь-які події кукурудзи за даним винаходом. Тому даний винахід також стосується ампліконів, одержаних за допомогою таких ДНК-праймерів і гомологічних праймерів. Даний винахід також стосується способів виявлення в зразку ДНК, яка відповідає події кукурудзи за даним винаходом. Такі способи можуть включати: (а) контактування зразка, що включає ДНК, з набором праймерів, які, при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з ДНК щонайменше однієї з вказаних подій кукурудзи, утворюють амплікон, що дозволяє діагностувати вказану подію; (b) виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з утворенням амплікона; і (с) виявлення одержаного амплікона. Інші способи виявлення за даним винаходом включають спосіб виявлення в зразку ДНК, яка відповідає щонайменше одній з вказаних подій, що включає: (а) контактування зразка, що включає ДНК, із зондом, який гібридизується в суворих умовах гібридизації з ДНК щонайменше однієї з вказаних подій кукурудзи і не гібридизується в суворих умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини кукурудзи (ДНК події, що не представляє інтересу); (b) гібридизацію зразка і зонда в суворих умовах гібридизації; і (с) виявлення гібридизації зонда з вказаною ДНК. Інші варіанти здійснення винаходу стосуються способів створення рослини кукурудзи, що включає подію aad-1 за даним винаходом, які включають стадії: (а) статевого схрещування першої батьківської лінії кукурудзи (що включає касети експресії за даним винаходом, які надають рослинам даної лінії ознаку стійкості до гербіцидів) і другої батьківської лінії кукурудзи (в якій відсутня вказана ознака стійкості до гербіцидів) з утворенням численного потомства рослин; і (b) відбір рослини-нащадка за допомогою молекулярних маркерів. Такі способи можуть необов'язково включати стадію зворотного схрещування рослини-нащадка з другою батьківською лінією кукурудзи з метою одержання рослини кукурудзи з розведенням гомозигот, що включає вказану ознаку стійкості до впливу комах. Іншим об'єктом даного винаходу є способи визначення зиготності потомства гібриду, що включає будь-яку одну (або декілька) з трьох вказаних подій. Вказані способи можуть включати контактування зразка, що містить ДНК кукурудзи, з набором праймерів за даним винаходом. Вказані праймери, використовувані при здійсненні реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК щонайменше однієї з вказаних подій кукурудзи, утворюють перший амплікон, який дозволяє діагностувати щонайменше одну з вказаних подій кукурудзи. Такі способи далі включають виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з утворенням першого амплікона; виявлення першого амплікона і контактування зразка, що містить ДНК кукурудзи, з вказаним набором праймерів (вказаний набір праймерів, використовуваний при здійсненні реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК з рослин кукурудзи, продукує другий амплікон, що включає нативну геномну ДНК кукурудзи, гомологічну геномній ділянці кукурудзи); і виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з утворенням другого амплікона. Вказані способи далі включають виявлення другого амплікона і порівняння першого і другого ампліконів в зразку, при цьому присутність обох ампліконів свідчить про те, що зразок є гетерозиготним для інсерції трансгена. Набори для виявлення ДНК можуть бути створені з використанням композицій за даним винаходом і методів, добре відомих в галузі виявлення ДНК. Вказані набори можуть бути використані для ідентифікації ДНК події кукурудзи за даним винаходом в зразку в процесі селекції рослин кукурудзи, що містять вказану ДНК. Набори включають послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ампліконам, наприклад, розглянутим в даному описі винаходу, або послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ДНК, що міститься в генетичних елементах трансгена подій за даним винаходом. Вказані послідовності ДНК можуть бути використані при здійсненні реакцій ампліфікації ДНК або як зонди в способі гібридизації ДНК. Набори можуть також містити реагенти і речовини, необхідні для виконання даного способу виявлення. Термін "зонд" означає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої приєднана стандартна детектована мітка або репортерна молекула (така як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентна речовина або фермент). Такий зонд є комплементарним ланцюгу нуклеїнової кислоти-мішені у випадку даного винаходу, ланцюгу геномної ДНК однієї з вказаних подій кукурудзи, з рослини кукурудзи або із зразка, що включає ДНК даної події. Зонди за даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди і інші речовини зонда, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНК-мішені і можуть бути використані для виявлення вказаної послідовності ДНК-мішені. 12 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "праймери" означає виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які гібридизовані з ланцюгом комплементарної ДНК-мішені методом гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду між праймером і ланцюгом ДНК-мішені і потім подовжені по ланцюгу ДНК-мішені полімеразою, наприклад ДНК-полімеразою. Пари праймерів за даним винаходом використовують для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших стандартних методів ампліфікації нуклеїнових кислот. Зонди і праймери звичайно складаються з 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500 або більшого числа полінуклеотидів. Такі зонди і праймери специфічно гібридизуються з послідовністю-мішенню в суворих умовах гібридизації. Зонди і праймери за даним винаходом переважно мають повну схожість послідовності з послідовністю-мішенню, хоч стандартними методами можуть бути створені зонди, які відмінні від послідовності-мішені, але зберігають здатність гібридизуватися з послідовностями-мішенями. Методи одержання і використання зондів і праймерів описані, наприклад, в публікації Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lasboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Пари праймерів для ПЛР можуть бути виділені з відомої послідовності, наприклад, за допомогою комп'ютерних програм, призначених для вказаної мети. Праймери і зонди на основі фланкуючих послідовностей ДНК і послідовностей вставок за даним винаходом можуть бути використані для підтвердження (і за необхідності для корекції) розглянутих послідовностей стандартними методами, наприклад методами повторного клонування і секвенування таких послідовностей. Зонди і праймери нуклеїнових кислот за даним винаходом гібридизуються в суворих умовах з послідовністю ДНК-мішені. Для ідентифікації ДНК з трансгенної події в зразку можуть бути використані будь-які стандартні методи гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. Молекули нуклеїнових кислот або їх фрагменти можуть специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнових кислот в певних умовах. Як указано в даному описі винаходу, дві молекули нуклеїнових кислот можуть специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо такі молекули здатні утворювати непаралельну дволанцюжкову структуру нуклеїнової кислоти. Вважається, що молекула нуклеїнової кислоти є "комплементом" іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вказані молекули є повністю комплементарними. Як указано в даному описі винаходу, молекули є "повністю комплементарними", якщо кожний нуклеотид однієї молекули є комплементарним нуклеотиду іншої молекули. Дві молекули вважаються "мінімально комплементарними", якщо вказані молекули здатні гібридизуватися одна з одною з достатньою мірою стійкості для збереження гібриду щонайменше в умовах "зниженої суворості". Аналогічним чином молекули вважаються "комплементарними", якщо вказані молекули здатні гібридизуватися одна з одною з достатньою мірою стійкості для збереження гібриду в 13 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стандартних суворих умовах. Стандартні суворі умови гібридизації описані в публікації Sambrook et al., 1989. Відхилення від повної комплементарності допустимі, якщо такі відхилення повністю не анулюють здатність молекул утворювати дволанцюжкову структуру. Молекула нуклеїнової кислоти, яка може бути використана як праймер або зонд, повинна мати достатньо комплементарну послідовність, здатну утворювати стійку дволанцюжкову структуру при певних концентраціях розчинника і солі. У використаному тут розумінні по суті гомологічна послідовність є послідовністю нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, порівнюваної в суворих умовах гібридизації. Термін "суворі умови" застосовно до гібридизації зонда нуклеїнової кислоти з нуклеїновою кислотою-мішенню (тобто з конкретною послідовністю нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес) методом специфічної гібридизації описаний в публікації Sambrook et al., 1989, стор. 9.52-9.55. Див. також публікацію Sambrook et al., 1989, стор. 9.47-9.52 і 9.56-9.58. Таким чином, нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути використані завдяки їх здатності вибірно утворювати дуплексні молекули з комплементарними ділянками фрагментів ДНК. Залежно від передбачуваного застосування можна використовувати різні умови гібридизації для досягнення різних мір вибірності зонда відносно послідовності-мішені. Для застосувань, що вимагають високої вибірності, звичайно використовують відносно суворі умови для утворення гібридів, наприклад, можуть бути вибрані умови, що характеризуються низькою концентрацією солі і/або високою температурою, наприклад, що досягаються при використанні від близько 0,02 М до близько 0,15 М NaCl при температурі від близько 50 °C до близько 70 °C. Суворі умови, наприклад, можуть включати щонайменше двократне промивання фільтра для гібридизації суворим промивальним буфером (0,2-кратний об'єм SSC, 0,1% SDS, 65 °C). Фахівцям в даній галузі (6.3.1-6.3.6) відомі відповідні суворі умови, стимулюючі гібридизацію ДНК, наприклад, 6,0кратний об'єм хлориду натрію/цитрату натрію (SSC) при температурі близько 45 °C з подальшим промиванням 2,0-кратним об'ємом SSC при 50 °C. Наприклад, концентрація солі на стадії промивання може бути вибрана в діапазоні від умов зниженої суворості, що включають використання приблизно 2,0-кратного об'єму SSC при 50 °C, до суворих умов, що включають використання приблизно 0,2-кратного об'єму SSC при 50 °C. Крім того, температура на стадії промивання може бути підвищена від кімнатної температури, приблизно 22 °C, що створюється в умовах зниженої суворості, до температури близько 65 °C, що застосовується в суворих умовах. Можуть бути змінені як температура, так і концентрація солі, або один з параметрів, температура або концентрація солі, може залишатися постійним при зміні іншого параметра. Такі вибірні умови допускають незначні, якщо взагалі допускають, помилкові спарювання між зондом і матрицею або ланцюгом-мішенню. Фахівцям в даній галузі добре відомі методи виявлення послідовностей ДНК шляхом гібридизації, і як приклад таких аналізів методом гібридизації можна навести патенти США №№ 4965188 і 5176995. У особливо переважному варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота за даним винаходом специфічно гібридизується в суворих умовах з одним або декількома праймерами (або ампліконами, або іншими послідовностями), наведеними або запропонованими в даному описі винаходу, включаючи їх комплементи і фрагменти. У одному аспекті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом включає послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в SEQ ID NO:3-14, її комплементи і/або фрагменти. У іншому аспекті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом включає послідовність, яка ідентична таким послідовностям нуклеїнових кислот на 80-100% або 90-100%. У ще одному аспекті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом ідентична такій послідовності на 95-100%. Такі послідовності можуть бути використані як маркери в процесі селекції рослин для ідентифікації потомства генетичних гібридів. Гібридизацію зонда з молекулою ДНК-мішені можна виявити різними методами, відомими фахівцям в даній галузі, які включають, не обмежуючись ними, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки. У випадку ампліфікації послідовності-мішені нуклеїнової кислоти (наприклад, методом ПЛР) з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації "суворі умови" являють собою умови, в яких вказана пара праймерів гібридизується тільки з послідовністю-мішенню нуклеїнової кислоти, з якою праймер, що має відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), повинен зв'язуватися і переважно продукувати унікальний продукт ампліфікації, амплікон. Термін "специфічний до (послідовності-мішені)" означає, що зонд або праймер гібридизується в суворих умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню в зразку, що включає таку послідовність-мішень. 14 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У використаному тут значенні термін "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означає продукт ампліфікації нуклеїнової кислоти послідовності-мішені нуклеїнової кислоти, що є частиною матриці нуклеїнової кислоти. Наприклад, для визначення наявності в рослині кукурудзи, одержаній в результаті статевого схрещування, геномної ДНК трансгенної події з рослини кукурудзи за даним винаходом, ДНК, екстрагована із зразка тканини рослини кукурудзи, може бути піддана ампліфікації нуклеїнової кислоти з використанням пари праймерів, з яких один праймер виділений з фланкуючої послідовності, локалізованої в геномі рослини поруч з сайтом інсерції вставленої гетерологічної ДНК, і другий праймер виділений з вставленої гетерологічної ДНК, для продукування амплікона, що дозволяє діагностувати наявність ДНК події. Подію також можна діагностувати на основі довжини і послідовності амплікона. Довжина амплікона може дорівнювати загальній довжині пар праймерів і однієї пари нуклеотидних основ і/або загальній довжині пар праймерів і приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 30 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 або 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 або більшому числу пар нуклеотидних основ (плюс або мінус будь-яке число вищезгаданих приростів). Альтернативно пара праймерів може бути виділена з фланкуючої послідовності з обох сторін вставленої ДНК з утворенням амплікона, що включає всю нуклеотидну послідовність вставки. Один член пари праймерів, виділеної з геномної послідовності рослини, може бути розташований на відстані від вставленої послідовності ДНК. Вказана відстань може складати від однієї пари нуклеотидних основ до приблизно двадцяти тисяч пар нуклеотидних основ. У визначення терміна "амплікон" входять димери праймерів, які можуть бути утворені при виконанні термічної реакції ампліфікації ДНК. Нуклеїнова кислота може бути ампліфікована різними методами ампліфікації нуклеїнової кислоти, відомими в даній галузі, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). У даній галузі відомі різні методи ампліфікації, які описані, нарівні з іншими публікаціями, в патенті США № 4683195 і патенті США № 4683202. Методом ПЛР можна ампліфікувати до 22 т.п.о. геномної ДНК. При здійсненні даного винаходу можуть бути використані вказані методи, а також інші методи ампліфікації ДНК, відомі в даній галузі. Послідовність ДНК-вставки або фланкуючої геномної послідовності гетерологічного трансгена з події кукурудзи за даним винаходом може бути перевірена (і за необхідності скоректована) шляхом ампліфікації таких послідовностей події за допомогою праймерів, виділених з послідовностей за даним винаходом, стандартними методами секвенування ДНК амплікона ПЛР або клонованої ДНК. Амплікон, одержаний вказаними методами, може бути виявлений різними методами. Електрофорез в агарозному гелі і забарвлювання бромідом етидію є загальноприйнятим, добре відомим методом виявлення ампліконів ДНК. Іншим таким методом є генетичний двійковий аналіз з використанням олігонуклеотиду ДНК, що перекриває суміжну фланкуючу геномну послідовність ДНК і вставлену послідовність ДНК. Вказаний олігонуклеотид іммобілізують в ямках мікропланшета. Після ПЛР ділянки, що представляє інтерес (з використанням одного праймера у вставленій послідовності і одного праймера в суміжній фланкуючій геномній 15 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності), одноланцюжковий продукт ПЛР може бути гібридизований з іммобілізованим олігонуклеотидом і використаний як матриця для виконання реакції подовження на одну основу з використанням ДНК-полімерази і мічених ddNTР, специфічних до передбачуваної наступної основи. Зчитування може бути виконане за допомогою флуоресцентного аналізу або ELISA. Сигнал вказує на наявність вставки/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. Іншим методом є метод піросеквенування, описаний в публікації Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). При виконанні вказаного методу створюють олігонуклеотид, який перекриває місце з'єднання суміжної геномної ДНК і вставленої ДНК. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковим продуктом ПЛР з ділянки, що представляє інтерес (один праймер у вставленій послідовності і один праймер у фланкуючій геномній послідовності), і інкубують в присутності ДНК-полімерази, АТР, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'фосфосульфату і люциферину. Окремо додають DNTP, в результаті чого виникає світловий сигнал, який вимірюють. Світловий сигнал свідчить про наявність вставки/фланкуючої послідовності трансгена внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або декілька основ. Поляризація флуоресценції є ще одним методом, який може бути використаний для виявлення амплікона за даним винаходом. Відповідно до даного методу створюють олігонуклеотид, який перекриває місце з'єднання геномної фланкуючої послідовності і вставленої ДНК. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковим продуктом ПЛР з ділянки, що представляє інтерес (один праймер у вставленій ДНК і один праймер у фланкуючій геномній послідовності ДНК), і інкубують в присутності ДНК-полімерази і міченого флуоресцентним барвником ddNTP. Подовження на одну основу викликає включення ddNTP. Таке включення можна виміряти у вигляді зміни поляризації за допомогою флуорометра. Зміна поляризації свідчить про наявність вставки/фланкуючої послідовності трансгена внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) є методом виявлення і кількісного визначення наявності послідовності ДНК. У короткому викладі даний метод включає створення олігонуклеотидного зонда FRET, який перекриває місце з'єднання геномної фланкуючої послідовності і вставної ДНК. Зонд FRET і праймери для ПЛР (один праймер в послідовності вставної ДНК і один праймер у фланкуючій геномній послідовності) піддають циклічній обробці в присутності термостійкої полімерази і dNTP. У процесі специфічної ампліфікації taq полімераза ДНК відщеплюється і вивільняє флуоресцентну частину з гасильної частини зонда FRET. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкуючої послідовності/послідовності вставки трансгена внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Для виявлення послідовності був запропонований метод молекулярних маяків. У короткому викладі даний метод включає створення олігонуклеотидного зонда FRET, який перекриває місце з'єднання фланкуючої геномної послідовності і вставної ДНК. Унікальна структура зонда FRET дозволяє одержати вторинну структуру, що містить флуоресцентну і гасильну частини в безпосередній близькості одна від одної. Зонд FRET і праймери для ПЛР (один праймер в послідовності вставної ДНК і один праймер у фланкуючій геномній послідовності) піддають циклічній обробці в присутності термостійкої полімерази і dNTP. Після успішної ампліфікації методом ПЛР гібридизація зонда FRET з послідовністю-мішенню викликає видалення вторинної структури зонда і просторове відділення флуоресцентної і гасильної частин. Виникає флуоресцентний сигнал. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкуючої геномної послідовності/послідовності вставки трансгена внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Крім розглянутого положення в геномі кукурудзи, яке є найбільш придатним для інсерції, даний винахід також стосується насіння кукурудзи і/або рослини кукурудзи, що включає щонайменше одну вставку, відмінну від гена aad-1, в безпосередній близькості від даного положення в геномі. Один варіант здійснення винаходу стосується заміни вставки aad-1, розглянутої в даному описі винаходу, іншою вставкою. Для вказаної мети може бути використана, наприклад, направлена гомологічна рекомбінація. Даний метод описаний, наприклад, в WO 03/080809 A2 і відповідній опублікованій заявці на патент США (US 20030232410). Таким чином, даний винахід стосується рослин і рослинних клітин, які включають гетерологічну вставку (замість гена або з декількома копіями гена aad-1), фланковану повними фланкуючими послідовностями або упізнаваними частинами фланкуючих послідовностей за даним винаходом (наприклад, залишками 1-1873 і 6690-8557 SEQ ID NO:29). Всі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, наведені в цьому документі, повністю включені в даний опис винаходу як посилання в тій мірі, в якій вони відповідають положенням даного винаходу. 16 UA 114882 C2 5 10 Наведені нижче приклади ілюструють способи здійснення винаходу і демонструють певні переважні варіанти здійснення винаходу. Вказані приклади не обмежують обсяг винаходу. Фахівцям в даній галузі повинно бути зрозуміло, що методи, описані в нижченаведених прикладах, представляють певні підходи, використовувані для ілюстрації переважних варіантів здійснення винаходу. Однак фахівцям в даній галузі повинно бути зрозуміло в світлі даного опису винаходу, що в конкретні варіанти здійснення винаходу можуть бути внесені багато які зміни, які дозволяють одержати аналогічні або подібні результати, не виходячи за межі суті і обсягу винаходу. За винятком особливо обумовлених випадків всі проценти є масовими процентами, і співвідношення сумішей розчинників є об'ємними співвідношеннями. За винятком особливо обумовлених випадків в даному описі винаходу використані наступні абревіатури. AAD-1 п.о. °С ДНК DIG EDTA т.п.о. мкг мкл мл М OLP ПЛР PTU SDS SOP SSC ТВЕ В 15 20 25 30 35 арилоксіалканоатдіоксигеназа-1 пара основ градуси по шкалі Цельсія дезоксирибонуклеїнова кислота дигоксигенін етилендіамінтетраоцтова кислота тисяча пар основ мікрограм мікролітр мілілітр молярна маса перекриваючий зонд полімеразна ланцюгова реакція транскрипційна одиниця рослини додецилсульфат натрію стандартна методика експерименту буферний розчин, що містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, рН 7,0 буферний розчин, що містить суміш трісоснови, борну кислоту і EDTA, рН 8,3 вольти Приклади Приклад 1. Трансформація і відбір події pDAS1740-278 AAD-1 Подія pDAS1740-278 AAD-1 була одержана методом точкової трансформації (WHISKER) лінії кукурудзи Hi-II. Даний метод трансформації описаний в заявці на патент США № 20090093366. У вказану лінію кукурудзи був перенесений фрагмент Fsp I плазміди pDAS1740, також визначуваної як pDAB3812 (фігура 1). Конструкція плазміди містить касету експресії рослини, що включає RB7 Mar v3 : промотор v2 убіквітин 1 Zea mays // AAD1 v3 // PER5 3'UTR Zea mays : транскрипційну одиницю рослини (PTU) RB 7 Mar v4. Було одержано багато подій. Подіям, що зберегли життєздатність і продукували здорову тканину калюсу, стійку до галоксифопу, були надані однозначні ідентифікуючі коди, що представляють передбачувані трансформаційні події, після чого вказані події були перенесені в свіже селективне середовище. Рослини були регенеровані з тканини, виділеної з кожної унікальної події, і перенесені в теплицю. Були одержані зразки листя для молекулярного аналізу, виконуваного для перевірки наявності трансгена AAD-1 методом саузерн-блотингу, методом підтвердження крайових послідовностей ДНК і методом підтвердження з використанням геномного маркера. Позитивні рослини Т0 запилювали інбредними лініями для одержання насінини Т1. Рослини Т1 з подією pDAS1470-278-9 (DAS-40278-9) відбирали, піддавали самозапиленню і досліджували протягом п'яти поколінь. У той же час рослини Т1 піддавали зворотному схрещуванню і переносили гени в елітну зародкову плазму (ХНН13) шляхом опосередковуваної маркером селекції протягом декількох поколінь. Дану подію було одержано з незалежного трансформованого ізоляту. Вказану подію буловідібрано на основі унікальних характеристик, таких як єдиний сайт інсерції, нормальне менделевське розщеплення, стійка експресія, чудова комбінація ефективності, що включає стійкість до гербіциду і агрономічну продуктивність в широких генотипних середовищах і численних оточеннях. У наведених нижче прикладах представлені дані, використані для дослідження події pDAS-1740-278-9. 17 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад 2. Дослідження події pDAS1740-278-9 методом саузерн-блотингу Аналіз методом саузерн-блотингу був виконаний для встановлення патерна інтеграції інсертованого фрагмента ДНК і визначення числа вставок/копій гена aad-1 у події pDAS-1740278-9 (DAS-40278-9). Одержані дані свідчили про інтеграцію і цілісність трансгена aad-1, введеного в геном кукурудзи. Дані саузерн-блотингу дозволили передбачити, що вставка фрагмента pDAS1740/Fsp I у подію DAS-40278-9 кукурудзи відбулася у вигляді простої інтеграції однієї інтактної копії транскрипційної одиниці aad-1 з плазміди pDAS1740. Був виконаний детальний аналіз методом саузерн-блотингу з використанням зондів, специфічних до гена, промотору, термінатора і інших регуляторних елементів, що знаходяться в ділянці плазміди, і дескриптивних рестрикційних ферментів, що мають сайти розщеплення в плазміді і продукують фрагменти, що гібридизуються, всередині плазміди або фрагменти, що заповнюють місце з'єднання плазміди з геномною ДНК кукурудзи (крайові фрагменти). Молекулярна маса, встановлена в результаті гібридизації методом саузерн-блотингу для комбінації рестрикційного ферменту і зонда, була характерна для даної події і визначала його ідентифікуючі патерни. Вказані аналізи також показали, що фрагмент плазміди був введений в геномну ДНК кукурудзи без реаранжування транскрипційної одиниці aad-1. Ідентичні фрагменти, що гібридизуються, були виявлені в п'яти різних поколіннях події DAS-40278-9 трансгенної кукурудзи, що свідчить про стійке успадкування інсерції PTU aad-1 протягом декількох поколінь. Гібридизація з сумішшю трьох зондів до ділянки кістяка, розташованих за межами сайта рестрикції Fsp I плазміди pDAS1740, не дозволила виявити яких-небудь специфічних фрагментів ДНК/гена, що вказує на відсутність гена стійкості до ампіциліну і відсутність інших ділянок кістяків вектора безпосередньо поруч з сайтами рестрикції Fsp I плазміди pDAS1740 у події DAS-40278-9 трансгенної кукурудзи. Ілюстративна карта вставки події DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1 показана на фігурах 2, 3. Приклад 2.1. Одержання зразків листя кукурудзи і виділення геномної ДНК (гДНК) гДНК була одержана з листя окремих рослин кукурудзи, що містить подію DAS-40278-9 кукурудзи aad-1. гДНК екстрагували з тканини листя окремих рослин кукурудзи, що містять подію DAS-40278-9 кукурудзи aad-1. Було використане насіння трансгенної кукурудзи, одержане з п'яти різних поколінь події DAS-40278-9. Для дослідження події DAS-40278-9 були відібрані двадцять окремих рослин кукурудзи з чотирьох рослин в кожному поколінні. Крім того, гДНК була виділена з рослини звичайної кукурудзи, ХНН13, що містить генетичне середовище, характерне для даної лінії з відсутністю гена aad-1. До виділення гДНК листя було взяте з кожної рослини для аналізу експресії білка aad-1 за допомогою набору індикаторних смужок для експрес-аналізу (American Bionostica, Swedesboro, NJ) відповідно до рекомендацій виробника. Кожний зразок пунктату листя був оцінений як + або - залежно від наявності або відсутності aad-1. Для подальшого дослідження були відібрані тільки позитивні рослини з п'яти поколінь події DAS-40278-9. Зразки листя кукурудзи були одержані з окремих рослин, що містять подію DAS-40278-9, і звичайної контрольної рослини ХHH13. Зразки листя швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали приблизно при -80 °C до використання. Геномну ДНК екстрагували з тканини замороженого листя кукурудзи стандартним методом СТАВ. За необхідності деякі зразки геномної ДНК піддавали подальшому очищенню за допомогою Qiagen Genomic-Tip (Quigan, Valencia, CA) методами, рекомендованими виробником. Екстраговану ДНК піддавали кількісному спектрофлуорометричному аналізу з використанням реагенту Pico Green (Invitrogen, Carlsbad, CA). Потім ДНК візуалізували на агарозному гелі для підтвердження результатів аналізу з використанням реагенту Pico Green і визначення якості ДНК. Приклад 2.2. Розщеплення і відділення ДНК Для молекулярного дослідження ДНК дев'ять мікрограмів (9 мкг) геномної ДНК із зразка ДНК події DAS-40278-9 кукурудзи і зразка ДНК звичайної контрольної кукурудзи розщеплювали, додаючи до кожного зразка ДНК приблизно п'ять-одинадцять одиниць відібраного рестрикційного ферменту на мкг ДНК і відповідний реакційний буфер. Кожний зразок інкубували приблизно при 37 °C протягом ночі. Для розщеплення зразків використовували рестрикційні ферменти EcoR I, Nco I, Sac I, Fse I і Hind III (New England Biolabs, Ipswich, MA). Позитивний гібридизований контрольний зразок, одержаний в результаті об'єднання плазмідної ДНК, pDAS1740 (pDAB3812) з геномною ДНК контрольного зразка у співвідношенні, приблизно еквівалентному 1 копії трансгена на один геном кукурудзи, розщеплювали такими ж методами з використанням таких же рестрикційних ферментів, що і випробувані зразки. ДНК з контрольного зразка звичайної кукурудзи (ХНН13) розщеплювали такими ж методами з використанням таких 18 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 же рестрикційних ферментів, що і випробувані зразки, і використовували як негативний контрольний зразок. Зразки розщепленої ДНК осаджували за допомогою Quick-Precip (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD) і повторно суспендували в 1-кратному об'ємі наповнювача Blue Juice (Invitrogen, Carlsbad, CA) для досягнення об'єму, необхідного для введення в гель. Зразки ДНК і маркери молекулярної маси піддавали електрофорезу в 0,8% агарозних гелях з 1-кратним буфером ТВЕ (Fisher Scientific, Pittsburg, PA) під напругою 55-65 вольт протягом приблизно 1822 годин для відділення фрагмента. Гелі забарвлювали бромідом етидію (Invitrogen, Carlsbad, CA) і візуалізували ДНК в ультрафіолетовому (UV) світлі. Приклад 2.3. Перенесення методом саузерн-блотингу і обробка мембрани Аналіз методом саузерн-блотингу виконували в основному відповідно до опису, наведеного в публікації Memelink, et al. (1994), Southern, Northern, and Western Blot Analysis. Plant Mol. Biol. Manual F1:1-23. Після відділення за допомогою електрофорезу і візуалізації фрагментів ДНК гелі депуринізували 0,25 н. розчином HCl (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) протягом приблизно 15 хвилин, піддавали впливу денатуруючого розчину (AccuGENE, Sigma, St. Louis, MO) протягом приблизно 30 хвилин і потім нейтралізуючого розчину (AccuGENE, Sigma, St. Louis, MO) протягом щонайменше 30 хвилин. Одержані фрагменти ДНК протягом ночі переносили методом саузерн-блотингу на найлонові мембрани (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) з використанням системи тампонів з 10-кратним об'ємом SSC (Sigma, St. Louis, MO). Після перенесення фрагментів ДНК мембрани промивали 2-кратним розчином SSC і зв'язували ДНК з мембраною шляхом перехресного зшивання в ультрафіолетовому світлі. В результаті методом саузерн-блотингу були одержані мембрани, готові до гібридизації. Приклад 2.4. Мічення і гібридизація ДНК-зонда Фрагменти ДНК, зв'язані з найлоновою мембраною, були виявлені за допомогою міченого зонда. Зонди, використані для даного дослідження, були створені шляхом введення методом ПЛР нуклеотиду, міченого дигоксигеніном (DIG), [DIG-11]-dUTP, з фрагментів, одержаних за допомогою праймерів, специфічних до елементів гена і інших ділянок плазміди pDAS1740. ДНКзонди були синтезовані методом ПЛР з використанням набору для синтезу ПЛР DIG-мічених зондів (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) відповідно до рекомендацій виробника. У таблиці 1 наведений перелік зондів, використаних в даному дослідженні. Таблиця 1 Локалізація і довжина зондів, використаних при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу Назва зонда OLP1-3 OLP2 OLP3A OLP3B OLP4ABC OLP5-2 35 40 45 Елемент гена Промотор убіквітин (ZmUbi1) Ген aad-1 Термінатор пероксидази (ZmPer5) RB7 Mar v4 Ділянка кістяка (OLP4A) Ген Ар' ділянки кістяка (OLP4B) Ділянка кістяка (OLP4C) RB7 Mar v3 Положення в pDAS1740 (п.о.) 28-2123 2103-3022 3002-3397 3375-4865 4900-5848 5828-6681 6660-7144 7124-8507 Довжина (п.о.) 2096 920 396 1491 949 855 485 1384 Мічені зонди аналізували методом електрофорезу в агарозному гелі для визначення їх якості і кількості. Необхідну кількість міченого зонда потім використовували для гібридизації з ДНК-мішенню на найлонових мембранах для виявлення специфічних фрагментів методами, описаними для використання розчину DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Блоти, що містять ДНК, фіксовані на найлонових мембранах, промивали 2-кратним об'ємом SSC і попередньо гібридизували з 20-25 мл попередньо нагрітого розчину DIG Easy Hyb в посудинах для гібридизації приблизно при 50 °C протягом як мінімум 30 хвилин в шафі для гібридизації. Розчин для попередньої гібридизації потім декантували і замінювали 20 мл попередньо нагрітого розчину DIG Easy Hyb, що містить необхідну кількість специфічних зондів, попередньо денатурованих шляхом кип’ятіння у воді протягом 5 хвилин. Стадію гібридизації виконували приблизно при 40-60 °C протягом ночі в шафі для гібридизації. Приклад 2.5. Виявлення Наприкінці гібридизації зондів розчини DIG Easy Hyb, що містять зонди, декантували в чисті пробірки і зберігали при -20 °C. Зазначені зонди можуть бути повторно використані 2-3 рази 19 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 відповідно до рекомендацій виробника. Блоти на мембранах швидко обполіскували і двічі промивали в чистих пластикових ємностях промивальним буфером в умовах зниженої суворості (2-кратний об'єм SSC, 0,1% SDS) протягом приблизно 5 хвилин при кімнатній температурі, потім двічі промивали промивальним буфером в суворих умовах (0,1-кратний розчин SSC, 0,1% SDS) протягом 15 хвилин приблизно при 65 °C. Блоти на мембранах потім переносили в інші чисті пластикові ємності і недовго промивали 1-кратним промивальним буфером з набору промивальних і блокувальних буферів DIG (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) протягом приблизно 2 хвилин, блокували в 1-кратному блокувальному буфері протягом як мінімум 30 хвилин і інкубували з антитілом проти DIG-міченої лужної фосфатази (АР) (розведення у співвідношенні 1:5000, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) в 1-кратному блокувальному буфері протягом як мінімум 30 хвилин. Після 2-3 промивань 1-кратним промивальним буфером специфічні ДНК-зонди залишалися зв'язаними з блотами на мембранах, і еталонні зразки DIGміченої ДНК візуалізували в системі виявлення нуклеїнової кислоти за допомогою хемілюмінесцентного барвника CDР-Star (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) відповідно до рекомендацій виробника. Блоти експонували на хемілюмінесцентній плівці (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) протягом одного або двох періодів часу для виявлення фрагментів, що гібридизуються, і візуалізації еталонів молекулярної маси. Потім плівки проявляли проявником для плівок All-Pro 100 Plus (Konica SRX-101) і сканували зображення. Для кожного зонда було документоване число і розміри виявлених смуг. Маркер II молекулярної маси DIG-міченої ДНК (MWM DIG II), що став видимим після виявлення DIG, був використаний для визначення розміру фрагмента, що гібридизується, на блотах, одержаних методом саузерн-блотингу. Приклад 2.6. Відділення зондів ДНК-зонди відділяли від блотів на мембранах після одержання даних гібридизації методом саузерн-блотингу, після чого блоти на мембранах можна було повторно використовувати для гібридизації з іншим ДНК-зондом згідно з рекомендаціями виробника (DIG Application Manual for Filter Hybridization (2003), Roche Diagnostics). Після виявлення сигналу і експонування на плівці блоти на мембранах ретельно обполіскували водою Milli-Q і двічі промивали у відділяючому буфері (0,2 н. розчин NaOH, 0,1% SDS) протягом приблизно 15 хвилин при кімнатній температурі або при 37 °C. Блоти на мембранах потім недовго промивали 2-кратним об'ємом SSC, після чого вони були готові до попередньої гібридизації і гібридизації з іншим ДНК-зондом. Блоти на мембранах експонували на новій хемілюмінесцентній плівці для гарантії того, що всі ДНК-зонди були видалені до переходу до наступної гібридизації. Повторно експоновані плівки поміщали разом з раніше одержаними даними гібридизації в файл досліджень для реєстрації. Приклад 2.7. Результати аналізу методом саузерн-блотингу У таблиці 2 вказані розміри передбачуваних і встановлених фрагментів при певному розщепленні і використанні відповідного зонда з урахуванням сайтів відомих рестрикційних ферментів фрагмента pDAS1740/Fsp I. В результаті виконаних розщеплень і гібридизацій були ідентифіковані фрагменти двох типів: внутрішні фрагменти, в яких сайти відомих ферментів фланкують ділянку зонда і повністю знаходяться всередині фрагмента pDAS1740/Fsp I, і крайові фрагменти, в яких сайт відомого ферменту розташований біля одного кінця ділянки зонда і наявність другого сайта передбачається в геномі кукурудзи. Розміри крайових фрагментів змінюються залежно від події, оскільки в більшості випадків сайти інтеграції фрагментів ДНК є унікальними для кожної події. Крайові фрагменти дозволяють локалізувати сайт рестрикційного ферменту відносно інтегрованої ДНК і визначити число інсерцій ДНК. По результатах аналізів методом саузерн-блотингу, виконаних в даному дослідженні, був зроблений висновок про те, що в геном події DAS-40278-9 кукурудзи була введена одна копія інтактної PTU гена aad-1 з плазміди pDAS1740/Fsp I, як детально показано на карті вставок (фігури 2, 3). 20 UA 114882 C2 Таблиця 2 Фрагменти, що гібридизуються, прогнозовані і встановлені при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу ДНК-зонд EcoR I Nco I Ген aad-1 Sac I Fse I/Hind III Nco I Промотор ZmUbi1 Sac I Fse I/Hind III Nco I Термінатор ZmPer5 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 Розміри передбачуваних 1 фрагментів (п.о.) 8512 немає >3382 (крайовий) 8512 немає >2764 (крайовий) 8512 немає >4389 (крайовий) 3361 немає 3361 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 8512 немає >3472 (крайовий) 8512 немає >4389 (крайовий) 3361 немає 3361 8512, ~3600* ~3600* ~6300, ~3600* 8512, ~3800* ~3800* ~3800*, ~16000 3361, ~6400* ~6400* 3361, ~6400*# pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 8512 немає >2764 (крайовий) 8512 немає >1847 (крайовий) 3361 немає 3361 8512, ~3900* ~3900* ~4000, ~3900* 8512, ~9000* ~9000* ~1900, ~9000* 3361, ~2100* ~2100* 3361, ~2100* pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 8512 немає >2764 (крайовий) >3472 (крайовий) 8512 немає >1847 (крайовий) >4389 (крайовий) 8512 немає ~4000 ~6300 8512 немає ~1900 ~16000 Рестрикційні ферменти Sac I Fse I/Hind III Nco I RB7 Mar 4 Sac I pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 21 Розміри встановлених 2 фрагментів (п.о.) 8512 немає ~12000 8512 немає ~4000 8512 немає ~16000 3361 немає 3361 UA 114882 C2 Продовження таблиці 2 Фрагменти, що гібридизуються, прогнозовані і встановлені при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу ДНК-зонд Nco I RB7 Mar 3 Розміри передбачуваних 1 фрагментів (п.о.) Рестрикційні ферменти Sac I Nco I Ділянка кістяка Sac I pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 pDAS1740 XHH13 DAS-40278-9 Розміри встановлених 2 фрагментів (п.о.) 8512 немає >2764 (крайовий) >3472 (крайовий) 8512 немає >1847 (крайовий) >4389 (крайовий) 8512 немає ~4000 ~6300 8512 немає ~1900 ~16000 8512 немає немає 8512 немає немає 8512 немає немає 8512 немає немає Примітка: * Зірочкою після указання розміру встановленого фрагмента відмічена гібридизація ендогенної послідовності, яка була виявлена у всіх зразках (включаючи негативні контрольні зразки). # Дублети в контрольному зразку звичайної кукурудзи, ВС3S1, і деяких зразках BC3S2. 1. Розміри прогнозованих фрагментів зазначені на основі плазмідної карти pDAS1740 (pDAB3812), показаної на фігурі 1. 2. Розміри фрагментів, встановлених при виконанні зазначених аналізів, вважаються приблизними і зазначені на основі розмірів фрагментів маркера II молекулярної маси DIGміченої ДНК. Через введення молекул DIG для візуалізації фрагменти маркера звичайно мають довжину, яка приблизно на 5-10% більше їх фактичної молекулярної маси. 5 10 15 20 25 Для дослідження вставки гена aad-1 у подію DAS-40278-9 були відібрані рестрикційні ферменти з унікальним сайтом рестрикції в плазміді pDAS1740, EcoR I, Nco I, Sac I, Fse I/Hind III. Було передбачено, що крайовий фрагмент довжиною >3382 п.о., >2764 п.о., >4389 п.о. повинен гібридизуватися із зондом до гена aad-1 після розщеплення відповідно EcoR I, Nco I і Sac I (таблиця 2). Була виявлена одна смуга гібридизації aad-1, відповідна ~12000 п.о., ~4000 п.о. і ~16000 п.о., при використанні відповідно EcoR I, Nco I і Sac I, що вказує на наявність одного сайта інсерції гена aad-1 в геномі події DAS-40278-9 кукурудзи. Розщеплення двома ферментами Fse I і Hind III було вибране для вивільнення фрагмента довжиною 3361 п.о., що містить транскрипційну одиницю aad-1 (PTU, промотор/ген/термінатор) (таблиця 2). Після розщеплення Fse I/Hind III був виявлений прогнозований фрагмент довжиною 3361 п.о. при використанні зонда до гена aad-1. Результати, одержані для розщеплення зразка DAS-40278-9 всіма чотирма ферментами/комбінацією ферментів з подальшою гібридизацією із зондом до гена aad-1, показали, що в геном події DAS-40278-9 кукурудзи була введена одна копія інтактної транскрипційної одиниці aad-1 з плазміди pDAS1740. Для дослідження ділянки промотору (ZmUbi1) для aad-1 у події DAS-40278-9 були вибрані рестрикційні ферменти Nco I, Sac I і Fse I/Hind III. Розщеплення ферментами Nco I і Sac I передбачувано повинно викликати утворення фрагмента крайової ділянки довжиною відповідно >3472 п.о. і >4389 п.о. при гібридизації з ДНК-зондами, специфічними до ділянки промотору ZmUbi1 (таблиця 2). Дві смуги гібридизації, відповідні ~6300 п.о. і ~3600 п.о., були виявлені при використанні зонда до промотору ZmUbi1 після розщеплення Nco I. Однак смуга, відповідна ~3600 п.о., була присутньою у всіх зразках, включаючи контрольні зразки звичайної кукурудзи, з чого випливає, що смуга, відповідна ~3600 п.о., є смугою неспецифічного сигналу, утворюваного в результаті гомологічного зв’язування зонда до виділеного з кукурудзи 22 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 промотору убіквітину (ZmUbi1) з ендогенним геном ubi кукурудзи. На відміну від цього смуга сигналу, відповідна ~6300 п.о., була виявлена в досліджених зразках DAS-40278-9 і не була виявлена в контрольних зразках звичайної кукурудзи, з чого випливає, що смуга, відповідна ~6300 п.о., є специфічною для зонда до промотору ZmUbi1 з плазміди pDAS1740, і тому дана смуга є передбачуваною смугою для Nco I/ZmUbi1, вказаною в таблиці 2. Аналогічним чином дві смуги гібридизації, відповідні ~3800 п.о. і ~16000 п.о., були виявлені при використанні зонда до промотору ZmUbi1 після розщеплення Sac I. Смуга, відповідна ~3800 п.о., була присутньою у всіх зразках, включаючи контрольні зразки звичайної кукурудзи, і тому може розглядатися як неспецифічна гібридизація зонда до промотору ZmUbi1 з ендогенним геном ubi кукурудзи. Смуга гібридизації, відповідна ~16000 п.о., присутня тільки в зразках DAS-40278-9, є передбачуваною смугою Sac I/ZmUbi1. Розщеплення двома ферментами Fse I/Hind III передбачувано вивільняє фрагмент RTU aad-1 довжиною 3361 п.о., який гібридизується із зондом до промотору ZmUbi1 (таблиця 2). Дана смуга, відповідна 3361 п.о., і смуга неспецифічної гібридизації, відповідна ~6400 п.о., були виявлені при використанні зонда до промотору ZmUbi1 після розщеплення Fse I/Hind III. Смуга, відповідна ~6400 п.о., є смугою неспецифічного зв’язування зонда до промотору ZmUbi1 з ендогенним геном ubi кукурудзи, оскільки дана смуга присутня у всіх зразках, включаючи контрольні зразки звичайної кукурудзи. Крім того, в контрольному зразку звичайної кукурудзи ВС3S1 і в деяких зразках BC3S2 була виявлена інша смуга в безпосередній близькості від смуги, відповідної ~6400 п.о. Зазначена додаткова смуга в безпосередній близькості від смуги, відповідної ~6400 п.о., також вважається смугою неспецифічного зв’язування, оскільки вона присутня в контрольних зразках звичайної кукурудзи ХНН13 і, найбільш ймовірно, асоційована з генетичним середовищем ХНН13. Такі ж рестрикційні ферменти/комбінація ферментів Nco I, Sac I і Fse I/Hind III були вибрані для дослідження ділянки термінатора (ZmPer5) для aad-1 у події DAS-40278-9. Розщеплення ферментом Nco I передбачувано утворює фрагмент крайової ділянки довжиною >2764 п.о. при гібридизації з ДНК-зондами, специфічними до ділянки термінатора ZmPer5 (таблиця 2). Після розщеплення ферментом Nco I при використанні зонда до термінатора ZmPer5 були виявлені дві смуги гібридизації, відповідні ~4000 п.о. і ~3900 п.о. Смуга, відповідна ~3900 п.о., була присутньою у всіх зразках, включаючи контрольні зразки звичайної кукурудзи, з чого випливає, що смуга, відповідна ~3900 п.о., є смугою неспецифічного сигналу, ймовірно, внаслідок гомологічного зв’язування зонда до термінатора (ZmPer5) виділеного з кукурудзи гена пероксидази з ендогенним геном per кукурудзи. На відміну від цього смуга сигналу, відповідна ~4000 п.о., була виявлена тільки в досліджених зразках DAS-40278-9 і не була виявлена в контрольних зразках звичайної кукурудзи, з чого випливає, що смуга, відповідна ~4000 п.о., є специфічною для зонда до термінатора ZmPer5 з плазміди pDAS1740 і тому являє собою передбачувану смугу Nco I/ZmPer5, вказану в таблиці 2. Крайовий фрагмент довжиною >1847 п.о. передбачувано гібридизується із зондом до термінатора ZmPer5 після розщеплення ферментом Sac I. Після розщеплення ферментом Sac I при використанні зонда до термінатора ZmPer5 були виявлені дві смуги гібридизації, відповідні ~1900 п.о. і ~9000 п.о. Смуга, відповідна ~9000 п.о., була присутньою у всіх зразках, включаючи контрольні зразки звичайної кукурудзи, і тому вважається смугою неспецифічної гібридизації зонда до термінатора ZmPet5 з ендогенним геном per кукурудзи. Смуга гібридизації, відповідна ~1900 п.о., яка була присутньою тільки в зразках DAS-40278-9, вважається передбачуваною смугою Sac I/ZmPer5. Розщеплення двома ферментами Fse I/Hind III передбачувано вивільняє фрагмент PTU aad-1 довжиною 3361 п.о., який гібридизується із зондом до термінатора ZmPer5 (таблиця 2). Смуга, відповідна 3361 п.о., і додаткова смуга неспецифічної гібридизації, відповідна ~2100 п.о., були виявлені при використанні зонда до термінатора ZmPer5 після розщеплення ферментами Fse I/Hind III. Додаткова смуга, відповідна ~2100 п.о., є смугою неспецифічного зв’язування зонда до термінатора ZmPer5 з ендогенним геном кукурудзи, оскільки вказана смуга присутня у всіх зразках, включаючи негативні контрольні зразки. Результати, одержані при розщепленні зразка DAS-40278-9 вказаними ферментами з подальшою гібридизацією із зондом до промотору ZmUbi1 і термінатора ZmPer5, знов підтвердили, що в геном події DAS-40278-9 кукурудзи була введена одна копія інтактної PTU aad-1 з плазміди pDAS1740. Для дослідження інших компонентів фрагмента pDAS1740/Fsp I у події DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1 були вибрані рестрикційні ферменти Nco I і Sac I (таблиця 2). Послідовності ДНК компонентів RB7 Mar v3 і RB7 Mar v4 ідентичні більше ніж на 99,7%, тому передбачалося, що ДНК-зонди, специфічні до RB7 Mar v3 або RB7 Mar v4, повинні гібридизуватися з фрагментами ДНК, що містять будь-який варіант RB7 Mar. Два крайових фрагменти довжиною >2764 п.о. і >3472 п.о. передбачувано гібридизували із зондами до RB7 Mar v4 і RB7 Mar v3 після розщеплення ферментом Nco I (таблиця 2). Після розщеплення ферментом Nco I в 23 UA 114882 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зразках DAS-40278-9 були виявлені дві смуги гібридизації, відповідні ~4000 п.о. і ~6300 п.о., при використанні зонда до RB7 Mar v4 або RB7 Mar v3. Аналогічним чином два крайових фрагменти довжиною >1847 п.о. і >4389 п.о. були виявлені при використанні зондів до RB7 Mar v4 і RB7 Mar v3 після розщеплення ферментом Sac I (таблиця 2). Після розщеплення ферментом Sac I при використанні зонда до RB7 Mar v4 або RB7 Mar v3 в зразках DAS-40278-9 були виявлені смуги гібридизації, відповідні ~1900 п.о. і ~16000 п.о. Разом взяті результати гібридизації методом саузерн-блотингу, одержані при використанні зондів до вказаних елементів, показують, що ДНК, введена у подію DAS-40278-9 кукурудзи, містить інтактну РTU aad-1 нарівні з ділянками приєднання матриці RB7 Mar v3 і RB7 Mar v4 відповідно біля 5'- і 3'-кінців вставки. Приклад 2.8. Відсутність послідовностей ділянки кістяка Комбінація з рівним молярним співвідношенням трьох фрагментів ДНК (таблиця 1), що охоплюють майже всю ділянку кістяка Fsp I (4867-7143 п.о. в плазміді pDAS1740) плазміди pDAS1740, була використана як зонд до ділянки кістяка для дослідження події DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1. Для створення події DAS-40278-9 був використаний фрагмент плазміди pDAS1740/Fsp I, тому не очікувалося виникнення специфічного сигналу гібридизації при використанні вказаної комбінації зонда до ділянки кістяка (таблиця 2) після розщеплення будьяким рестрикційним ферментом. Була підтверджена відсутність специфічного сигналу гібридизації при використанні зонда до ділянки кістяка після розщеплення ферментом Nco I або Sac I у всіх зразках DAS-40278-9. Позитивні контрольні зразки містили передбачувані смуги гібридизації, які показують, що вказані зонди були здатні гібридизуватися з будь-якими фрагментами гомологічної ДНК при наявності їх в зразках. Одержані дані дозволили передбачити, що інсерція у подію DAS-40278-9 кукурудзи не включала послідовність ділянки кістяка вектора за межами ділянки Fsp I з плазміди pDAS1740. Зразки листя з п'яти різних поколінь події DAS-40278-9 були використані для дослідження молекулярної маси методом саузерн-блотингу. Проводячи розщеплення вибраними рестрикційними ферментами і використовуючи комбінації зондів, визначали патерн інтеграції для дослідження вставленого гена aad-1, а також некодуючих ділянок, що включають промотор, термінатор експресії гена і ділянки приєднання матриці. Дослідження методом саузерн-блотингу ДНК, введеної у подію DAS-40278-9, показує, що у подію DAS-40278-9 була введена одна інтактна копія РTU aad-1. Молекулярна маса, встановлена шляхом гібридизації методом саузерн-блотингу для комбінації рестрикційного ферменту і зонда, була унікальною для даної події і характеризувалася власними ідентифікуючими патернами. Патерн гібридизації ідентичний для всіх п'яти поколінь, з чого випливає, що дана вставка є стійкою в геномі кукурудзи. Гібридизація із зондами, що охоплюють ділянку кістяка за межами трансформуючого фрагмента pDAS1740/Fsp I з плазміди pDAS1740, підтверджує відсутність послідовностей ділянки кістяка вектора у події DAS-40278-9. Приклад 3. Клонування і дослідження послідовності ДНК у вставці і фланкуючих крайових ділянках події DAS-40278-9 кукурудзи Для дослідження вставленої ДНК і опису сайта інсерції в геномі визначали послідовності ДНК вставки і крайових ділянок події DAS-40278-9. Було підтверджено в загальній складності 8557 п.о. геномної послідовності події DAS-40278-9, що включають 1873 п.о. 5'-кінцевої фланкуючої крайової послідовності, 1868 п.о. 3'-кінцевої фланкуючої крайової послідовності і 4816 п.о. ДНК-вставки. ДНК-вставка довжиною 4816 п.о. містить інтактну касету експресії гена aad-1, 259 п.о. неповної ділянки Mar v3 біля 5'-кінця і 1096 п.о. неповної ділянки Mar v4 біля 3'кінця. Аналіз послідовності показав наявність інсерції довжиною 21 п.о. в місці 5'-кінцевого інтеграційного з'єднання і делецію двох пар основ з інсерційного локусу геному кукурудзи. Інсерція, що включає одну пару основ, була виявлена в місці 3'-кінцевого інтеграційного з'єднання між геномом кукурудзи і вставкою DAS-40278-9. Крім того, заміна однієї основи (Т на С) була виявлена у вставці в положенні 5212 в некодуючій ділянці 3'-кінцевої UTR. Жодна з вказаних змін не вплинула на структуру відкритої рамки зчитування касети експресії aad-1. Ампліфікація методом ПЛР вставки події DAS-40278-9 і крайових послідовностей підтвердила, що крайові ділянки були одержані з кукурудзи і з'єднувальні ділянки можуть бути використані для подіє-специфічної ідентифікації DAS-40278-9. Аналіз послідовності, що заповнює з'єднувальні ділянки, показав, що в результаті інсерції ДНК у подію DAS-40278-9 не були утворені нові відкриті рамки зчитування (OPF>=200 кодонів) і існуючі відкриті рамки зчитування геному не були порушені введенням DAS-40278-9 в нативний геном кукурудзи. Таким чином, дослідження вставки і крайових послідовностей події DAS-40278-9 кукурудзи AAD1 показало, що в нативний геном кукурудзи була введена одна інтактна копія касети експресії aad-1. 24 UA 114882 C2 5 10 15 Приклад 3.1. Екстракція і кількісне визначення геномної ДНК Геномну ДНК екстрагували з ліофілізованих або щойно подрібнених тканин листя модифікованим методом СТАВ. Зразки ДНК розчиняли в 1-кратному буфері ТЕ (10 мМ трісбуфера, рН 8,0, 1 мМ EDTA) (Fluka, Sigma, St. Louis, MO) і проводили кількісне визначення методом з використанням Pico Green відповідно до інструкцій виробника (Molecular Probes, Eugene, OR). Для аналізу методом ПЛР зразки ДНК розводили водою для молекулярної біології (5 PRIME, Gaithersburg, MD) до концентрації 10-100 нг/мкл. Приклад 3.2. Праймери для ПЛР У таблиці 3 представлені послідовності праймерів, які були використані для клонування ДНК-вставки і фланкуючих крайових ділянок події DAS-40278-9, з указанням положень і описами, показаними на фігурі 4. В таблиці 4 представлені послідовності праймерів, які були використані для підтвердження вставки і крайових послідовностей. Положення праймерів показані відповідно на фігурах 4 і 5. Всі праймери були синтезовані в компанії Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). Праймери розчиняли у воді (5 PRIME, Gaithersburg, MD) до концентрації 100 мкМ для одержання вихідного розчину і розводили водою до концентрації 10 мкМ для одержання робочого розчину. Таблиця 3 Список послідовностей праймерів, використаних при клонуванні вставки події DAS-40278-9 кукурудзи і фланкуючої крайової послідовності Назва праймера Розмір Локалізація (п.о.) (п.о.) 5End3812_A 26 5End3812_В 23 3End3812_С 26 3End3812_D 26 Amp 1F 23 Amр 1R 28 Amp 2F 23 Amp 2R 23 Amp 3F 25 Послідовність Призначення Первинна ПЛР для SEQ ID NO:1: 5'5'-концевої 2231-2256 (-) TGCACTGCAGGTCGACTCTAGAGGATкрайової 3' послідовності Вторинна ПЛР для SEQ ID NO:2: 5'5'-концевої 2110-2132 (-) GCGGTGGCCACTATTTTCAGAAG-3' крайової послідовності Первинна ПЛР для SEQ ID NO:3: 5'3'-концевої 5535-5560 (+) TTGTTACGGCATATATCCAATAGCGG-3' крайової послідовності Вторинна ПЛР для SEQ ID NO:4: 5'3'-концевої 5587-5612 (+) CCGTGGCCTATTTTCAGAAGAAGTTC-3' крайової послідовності Ампліфікація SEQ ID NO:5: 5'вставки, амплікон 736-758 (+) ACAACCATATTGGCTTTGGCTGA-3' 1, використана з Amp 1R Ампліфікація SEQ ID NO:6: 5'вставки, амплікон 2475-2502 (-) CCTGTTGTCAAAATACTCAATTGTCCTT1, використана з 3’ Amp 1F Ампліфікація SEQ ID NO:7: 5'вставки, амплікон 1696-1718 (+) CTCCATTCAGGAGACCTCGCTTG-3' 2, використана з Amp 2R Ампліфікація SEQ ID NO:8: 5'вставки, амплікон 3376-3398 (-) GTACAGGTCGCATCCGTGTACGA-3’ 2, використана з Amp 2F Ампліфікація SEQ ID NO:9: 5'вставки, амплікон 3254-3278 (+) CCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGAT-3’ 3, використана з Amp 3R 25 UA 114882 C2 Продовження таблиці 3 Список послідовностей праймерів, використаних при клонуванні вставки події DAS-40278-9 кукурудзи і фланкуючої крайової послідовності Назва праймера Розмір (п.о.) Amp 3R 23 Amp 4F 23 Amp 4R 23 Amp 5F 28 Amp 5R 23 Локалізація (п.о.) Послідовність Призначення Ампліфікація вставки, амплікон 3, використана з Amp 3F Ампліфікація SEQ ID NO:11: 5'вставки, амплікон 4806-4828 (+) GTCGCTTCAGCAACACCTCAGTC-3' 4, використана з Amp 4R Ампліфікація 6767-6789 SEQ ID NO:12: 5'вставки, амплікон (-) AGCTCAGATCAAAGACACACCCC-3' 4, використана з Amp 4F Ампліфікація SEQ ID NO:13: 5'вставки, амплікон 6300-6327 (+) TCGTTTGACTAATTTTTCGTTGATGTAC5, використана з 3' Amp 5R Ампліфікація 7761-7783 SEQ ID NO:14: 5'вставки, амплікон (-) TCTCACTTTCGTGTCATCGGTCG-3' 5, використана з Amp 5F SEQ ID NO:10: 5'4931-4953 (-) GTCATGCCCTCAATTCTCTGACA-3’ (+): постійна послідовність; (-): комплементарна послідовність. Таблиця 4 Список послідовностей праймерів, використаних для підтвердження геномної ДНК кукурудзи Назва праймера Розмір (п.о.) 1F5End01 17 1F5End02 24 A15End01 17 AI5End02 20 Локалізація (п.о.) Послідовність Призначення Підтвердження 5'концевої крайової SEQ ID NO:15% 5'1816-1832 (+) геномної ДНК, CCAGCACGAACCATTGA-3' використана з AI5End01 Підтвердження 5'SEQ ID NO:16: 5'концевої крайової 1629-1652 (+) CGTGTATATAAGGTCCAGAGGGTA- геномної ДНК, 3' використана з AI5End02 Підтвердження 5'концевої крайової 4281-4297 SEQ ID NO:17: 5'геномної ДНК, (-) TTGGGAGAGAGGGCTGA-3' використана з 1F5End01 Підтвердження 5'концевої крайової 4406-4426 SEQ ID NO:18: 5'геномної ДНК, (-) TGGTAAGTGTGGAAGGCATC-3' використана з 1F5End02 26 UA 114882 C2 Продовження таблиці 4 Список послідовностей праймерів, використаних для підтвердження геномної ДНК кукурудзи Назва праймера Розмір (п.о.) Локалізація (п.о.) 1F3End03 20 8296-8315 (-) SEQ ID NO:19: 5'GAGGTACAACCGGAGCGTTT-3' 1F3End04 19 8419-8437 (-) SEQ ID NO:20: 5'CCGACGCTTTTCTGGAGTA-3' 1F5End03 22 378-399 (+) SEQ ID NO:21: 5'TGTGCCACATAATCACGTAACA-3' 1F5End04 20 267-286 (+) SEQ ID NO:22: 5'GAGACGTATGCGAAAATTCG-3' 22 4973-4994 (+) 1F3End05 19 7060-7078 (-) SEQ ID NO:24: 5'TCCGTGTCCACTCCTTTGT-3' 1F5EndT1F 22 2033-2054 (-) SEQ ID NO:25: 5'GCAAAGGAAAACTGCCATTCTT-3' 1F5EndT1R 20 1765-1784 (+) Corn278-F 23 1884-1906 (-) Corn278-R 24 AI3End01 Послідовність SEQ ID NO:23: 5'TTGCTTCAGTTCCTCTATGAGC-3' SEQ ID NO:26: 5'TCTCTAAGCGGCCCAAACTT-3' SEQ ID NO:27: 5'ATTCTGGCTTTGCTGTAAATCGT-3’ SEQ ID NO:28: 5'1834-1857 (+) TTACAATCAACAGCACCGTACCTT3' Призначення Підтвердження геномної ДНК, використана з 1F5End03 Підтвердження геномної ДНК, використана з 1F5End04 Підтвердження геномної ДНК, використана з 1F3End03 Підтвердження геномної ДНК, використана з 1F3End04 Підтвердження 3'концевої крайової геномної ДНК, використана з 1F3End05 Підтвердження 3'концевої крайової геномної ДНК, використана з АI3End01 Ампліфікація специфічної послідовності 278 біля 5'-концевого з’єднання Ампліфікація специфічної послідовності 278 біля 5'-концевого з’єднання Ампліфікація специфічної послідовності 278 біля 5'-концевого з’єднання Ампліфікація специфічної послідовності 278 біля 5'-концевого з’єднання (+): постійна послідовність; (-): комплементарна послідовність.5 Приклад 3.3. "Прогулянка по геному" (Genome Walking) Для клонування 5'- і 3'-кінцевих фланкуючих крайових послідовностей події DAS-40278-9 кукурудзи був використаний універсальний набір Genome Walker™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA). Відповідно до інструкцій виробника приблизно 2,5 мкг геномної ДНК з події DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1 розщеплювали протягом ночі ферментами EcoR V, Stu I (обидва ферменти входили в комплект набору) або Sca I (New England Biolabs, Ipswich, MA). 27 UA 114882 C2 5 10 Розщеплену ДНК очищали в пристрої для очищення і концентрування ДНК DNA Clean & Concentrator™-25 (ZYMO Research, Orange, CA) і потім лігували з адапторами з набору Genome Walker™ для створення бібліотек Genome Walker™. Кожну бібліотеку Genome Walker™ використовували як матричну ДНК для ампліфікації за допомогою первинної ПЛР з використанням праймера для адаптора АР1, що входив в комплект набору, і специфічного до конструкції праймерів 5End3812_A і 3End3812_C. Один мікролітр продукту первинної ПЛР, розведений у співвідношенні 1:25, використовували як матрицю для ампліфікації за допомогою вторинної ПЛР з використанням вкладеного праймера для адаптора АР2 і вкладених специфічних до конструкції праймерів 5End3812_В і 3End3812_D. У процесі ампліфікації методом ПЛР використовували TaKaRa LA Taq™ HS (Takara Bio Inc., Shiga, Japan). Для одержання 50 мкл продукту ПЛР використовували 1 мкл матричної ДНК, 8 мкл 2,5 мМ суміші dNTP, 0,2 мкМ кожного праймера, 2,5 одиниці ДНК-полімерази TaKaRa LA Taq™ HS, 5 мкл 10+ кратного буфера II LA для ПЛР (разом з Mg2 ) і 1,5 мкл 25 мМ MgCl2. Умови виконання ПЛР наведені в таблиці 5. 15 Таблиця 5 Умови "прогулянки по геному" події DAS-40278-9 кукурудзи AAD-1 для ампліфікації фланкуючих крайових ділянок Попередня ДенатуПослідовністьНабір праймерів денатурація рація мішень (С/хв.) (С/сек.) 5'-кінцева крайова 5'-кінцева крайова (вкладена) 3End3812_C/AP1 3'-кінцева крайова (вкладена) 25 5End3812_B/AP2 3'-кінцева крайова 20 5End3812_A/AP1 3End3812_D/AP2 95/3 95/3 95/3 95/3 95/30 95/30 95/30 95/30 Відпал (С/сек.) 68→64/30 8 циклів 680,5/цикл →64/30 8 циклів 680,5/цикл →64/30 8 циклів 680,5/цикл →64/30 0,5/цикл 8 циклів Кінцеве ПодовДенатуПодовВідпал подовження рація ження ження (С/сек.) (С/хв.:сек.) (С/сек.) (С/хв.:сек.) (С/ хв.) 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 72/10 22 цикли 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 72/10 22 цикли 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 72/10 22 цикли 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 22 цикли 72/10 Приклад 3.4. Стандартна ПЛР Для клонування і підтвердження ДНК-вставки і крайової послідовності у події DAS-40278-9 кукурудзи використовували стандартну ПЛР. Ампліфікацію за допомогою стандартної ПЛР проводили з використанням TaKaRa LA Taq™ (Takara Bio Inc., Shiga, Japan), ДНК-полімерази HotStarTaq (Quigen, Valencia, CA), системи для подовження послідовності за допомогою високоточної ПЛР (Roche Diagnostics, Inc., Indianapolis, IN) або суміші ферментів і робочого розчину для клонування за допомогою високоточної ПЛР Easy-A® (Stratagene, LaJolla, CA) відповідно до рекомендацій виробника. Конкретні умови виконання ПЛР і описи ампліконів наведені в таблиці 6. Таблиця 6А Умови ампліфікації за допомогою стандартної ПЛР крайових ділянок в події DAS-40278-9 кукурудзи Послідовністьмішень 5'-кінцева крайова 5'-кінцева крайова Попередня Денатурація Відпал Подовження Набір денатурація праймерів (С/сек.) (С/сек.) (С/хв.:сек.) (С/хв.) 1F5End01/ 95/3 95/30 60/30 68/5:00 AI5End01 35 циклів 1F5End02/ 95/3 95/30 60/30 68/5:00 AI5End02 35 циклів 28 Кінцеве подовження (С/хв.) 72/10 72/10