Спосіб попередньої підготовки проб для визначення мікроорганізмів

Реферат: Спосіб попередньої підготовки проб для визначення мікроорганізмів, що передбачає подрібнення досліджуваного зразка, змішування з водою або водним розчином, центрифугування, причому досліджуваний зразок змішують зі стерильною водою або фосфатним буфером, або фізіологічним розчином при масовому співвідношенні досліджуваного зразка і розчинника рівному 1:(5-10,0) і рН=4,8-7,0, отриманий екстракт центрифугують 1-5 хв при 900-2000 g, супернатант переносять в іншу центрифугувальну ємність і повторно центрифугують 1-5 хв при 6000-10000 g, а в осаді, що утворився, визначають наявність мікроорганізмів за допомогою їх фенотипових ознак. UA 117316 U (12) UA 117316 U UA 117316 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі гігієнічної безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а саме до визначення мікроорганізмів у харчових продуктах. Відомий спосіб попередньої підготовки лабораторних проб для аналізу, що полягає в отриманні однорідної маси продукту за допомогою подрібнення, дроблення, помелу і розтирання залежно від виду продукту (ГОСТ 26671-2014) [1]. В процесі підготовки проб передбачається отримання частинок для аналізу потрібного розміру з використанням сит, а після розведення водою при співвідношенні 1:5 рідких зразків соків та напоїв, а також згущених продуктів (повидло, пюре тощо) центрифугування при 990 g 15 хвилин. Недоліком способу є те, що обов'язковою умовою отримання зразків однорідної консистенції є неодноразове подрібнення та використання сит, центрифугування, що може призвести до втрат продукту і одним із застережень те, що не повинно бути втрат матеріалу проби. Крім того, для різних видів продукції (твердих продуктів, у тому числі м'ясних консервів, рідких тощо) передбачається використання різноманітних прийомів при подрібненні та підготовці проб, зокрема, кількаразове просіювання, протирання, гомогенізація тощо. В разі необхідності передбачено видалення кісточок, спецій, різних домішок, при наявності жиру необхідним є його розплавлення та додавання до проби, при аналізі заморожених продуктів рідку частину, що утворюється при розморожуванні також потім додають до продукту. Всі ці операції можуть призвести до втрат проб, ускладнення проведення аналізу і, як наслідок, до певних неточностей. Цей спосіб не враховує особливості пробопідготовки для аналізу мікроорганізмів. Запропоновані режими підготовки зразків ефективні при хімічних аналізах, в той же час значна частина мікробних контамінантів буде осідати (переходити в тверду частину продукту) і потенційно може бути втрачена. Відомий спосіб визначення Bacillus cereus в харчових продуктах і кормах для тварин з горизонтальним методом підрахунку презумптивних бактерій Вас. cereus [2]. Але він відноситься до класичних методів посіву мікроорганізмів і не включає попередню підготовку проб. Крім того, вирощування мікроорганізмів на середовищах є тривалим процесом, тому необхідним є скорочення часу проведення аналізу. Відомий підхід до традиційних методів визначення мікроорганізмів, при якому 50 г зразка 3 змішують з 450 см буферного розчину і подрібнюють 2 хв із швидкістю 10000-12000 обертів в хв. Цей спосіб не застосовують для подальших молекулярно-генетичних досліджень, оскільки при запропонованій швидкості гомогенізації клітини мікроорганізмів можуть зруйнуватися (втрачається їх чисельність) і гомогенізація продукту при вищезазначених умовах призводить до неможливості фізичними методами відокремити частинки від мікроорганізмів [3]. Найбільш близьким за технічною суттю до запропонованого способу є спосіб попередньої підготовки проб для визначення мікроорганізмів, який наведений в описі винаходу заявки РФ № 2006104588/13 [4], що включає підготовку проби до дослідження в два прийоми, залежно від 3 щільності, вмісту жиру і плинності продукту. Виділяють 25 г (см ) продукту з подальшим 3 подрібненням, переведенням в рідку фазу в об'ємі 50-100 см за допомогою додавання 3 фізіологічного розчину, а при дослідженні води, останню у кількості 500 см фільтрують через 3 мембранні фільтри; здійснюють поділ проби на частини по 2 см . Цей спосіб обрано прототипом. Прототип і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - здійснюють попередню підготовку харчової сировини шляхом подрібнення; - додають водний розчин для переведення мікроорганізмів в рідку фазу; - здійснюють поділ проби для подальших досліджень. Але спосіб за прототипом має наступні недоліки: - наявність етапу з переведенням у рідку фазу не передбачає відділення ні твердих часточок продуктів, ні розчинних компонентів, які заважають при проведенні подальших досліджень; - спосіб не дає змоги отримати достовірні значення при невисоких концентраціях мікроорганізмів внаслідок розведення підготованих проб. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб попередньої підготовки проб для визначення мікроорганізмів, в якому за рахунок проведення подвійного центрифугування та підбору масового співвідношення розчинника (води, або фізіологічного чи буферного розчину) і досліджуваного зразка, досягається концентрування клітин мікроорганізмів, відділення їх від часточок продукту та розчинних речовин, що забезпечує отримання однозначного результату щодо визначення не тільки наявності мікроорганізмів в пробі, але й кількісного визначення, як живих, так і мертвих клітин, підвищення чутливості методу і достовірність результатів, а також спрощення та зменшення часу проведення аналізу. 1 UA 117316 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поставлена задача вирішена в спосіб попередньої підготовки проб для визначення мікроорганізмів, що передбачає подрібнення досліджуваного зразка, змішування з водою або водним розчином, центрифугування, тим, що досліджуваний зразок змішують зі стерильною водою або фосфатним буфером, або фізіологічним розчином при масовому співвідношенні досліджуваного зразка і розчинника рівному 1: (5-10,0) і pH=4,8-7,0, отриманий екстракт центрифугують 1-5 хв при 900-2000 g, супернатант переносять в іншу центрифугувальну ємність і повторно центрифугують 1-5 хв при 6000-10000 g, а в осаді, що утворився, визначають наявність мікроорганізмів. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак можна пояснити наступним. Технічним результатом даного способу є: - спрощення процесу; - підвищення чутливості визначення мікроорганізмів в харчових продуктах; підвищення достовірності отриманих результатів. Спрощення досягається за рахунок: - використання подвійного центрифугування, при цьому при першому відбувається осадження частинок продукту, а при другому - мікроорганізмів; - використання води або фізіологічного розчину, або фосфатного буферу дозволяє використати спосіб для різних видів продуктів і мікроорганізмів з урахуванням подальшого проведення аналізу. Підвищення чутливості і достовірності досягається за рахунок концентрування мікроорганізмів та обережного режиму центрифугування. Крім того, використання тільки води дозволить усунути складності при визначенні мікроорганізмів методом ПЦР, а в інших випадках - використання фізіологічного розчину або фосфатного буферу дозволить зберегти осмотичний тиск та рН і запобігає руйнуванню клітин. Крім того, визначення мікроорганізмів здійснюється з осаду, таким чином олігопептиди, розчинні компоненти їжі тощо не заважають проведенню аналізу будь-яким методом, придатним для визначення мікроорганізмів, що підвищує чутливість методу і достовірність отриманих результатів. Комплексом чинників, що визначають розділення компонентів середовища, є характер розподілу часток за розміром, переважаючий розмір часток, щільність і в'язкість дисперсійного середовища і дисперсної фази. Соки і соковмісні напої з об'ємною долею м'якоті понад 10 % (з манго, томату, банана та ін.) при аналізі зазвичай заздалегідь розбавляють водою в співвідношенні 1:5 (за об'ємом) для освітлення розчину і центрифугують з чинником розділення не менше 990 g впродовж 15 хв. У разі неповного осадження нерозчинних у воді часток пробу знову фільтрують через беззольний фільтр або центрифугують з чинником розділення не менше 990 g впродовж 15 хв. Продукт при тонкому подрібненні (гомогенізації) має переважний розмір часток 250-300 мкм, так, розмір -6 -6 часток для грушевого соку з м'якушем складає 29,510 м, сливового - 54,510 м, гарбузового -6 2510 м. При запропонованому методі немає необхідності в фільтруванні розчину, оскільки при першому центрифугуванні видаляються часточки продукту, при цьому можуть осісти також дріжджові клітини та спори, тому центрифугування проводиться при невеликій швидкості нетривалий час для попередження втрат мікроорганізмів. Для осадження клітин мікроорганізмів (при другому центрифугуванні) застосовується чинник розділення значно вищий - від 6000 до 10000 g. Проведені дослідження дозволили виявити оптимальні режими проведення всіх технологічних операцій. Запропонований спосіб дозволяє швидко підготувати проби для проведення аналізу на потенційно небезпечні мікроорганізми, що важливо для визначення безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а також моніторингу якості харчових систем. Об'єктом дослідження можуть бути свіжі овочі, фрукти, коренеплоди, зелень, соки, десерти, консервована продукція, пряно-ароматичні суміші, каші та локшина швидкого приготування. Здійснення заявляємого способу ілюструється наступними прикладами. Приклад 1. Об'єкт дослідження - морква. Свіжу моркву подрібнювали, наважку 10 г змішували зі стерильною водою (для попередження внесення додаткових мікроорганізмів) при співвідношенні тверда фаза:вода 1:5, центрифугували для відділення частинок моркви від супернатанту 1 хв при 900 g, супернатант центрифугували 3 хв при 8000 g, в осаді визначали наявність мікроорганізмів, зокрема, наявність Bacillus cereus здійснювали за допомогою їх фенотипових ознак. Дані наведені в таблиці 1. Приклади 2-6 здійснювали аналогічно прикладу 1, але змінювали тривалість та швидкість центрифугування, співвідношення твердої фази і води. Наявність Вас. cereus здійснювали за допомогою фенотипових ознак. Дані наведені в таблиці 1. Приклад 7 - контроль. Дані наведені в таблиці 1. 2 UA 117316 U 5 10 15 20 Приклади 8-37 ілюструють дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів водою із різних об'єктів, а саме: Приклади 8-13 - об'єкт дослідження - овочевий коктейль. Дані наведені в таблиці 2. Приклади 14-19 - об'єкт дослідження - десерт фруктовий. Дані наведені в таблиці 3. Приклади 20-25 - об'єкт дослідження - пластівці екструдовані (гречані). Дані наведені в таблиці 4. Приклади 26-31 - об'єкт дослідження - приправа з овочами та спеціями. Дані наведені в таблиці 5. Приклади 32-37 - об'єкт дослідження - каша швидкого приготування (п'ять злаків). Дані наведені в таблиці 6. Приклади 38-48 ілюструють дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів фізіологічним розчином із різних об'єктів, а саме: Приклади 38-43 - об'єкт дослідження - свіжий перець. Дані наведені в таблиці 7. Приклади 44-48 - об'єкт дослідження - різні харчові продукти: 44 - сік сливовий, 45 - десерт гарбузовий, 46 - пластівці екструдовані (вівсяні), 47 - локшина швидкого приготування, 48 - рибні консерви до стерилізації. Дані наведені в таблиці 8. Приклади 49-59 ілюструють дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів фосфатним буфером із різних об'єктів, а саме: Приклади 49-54 - об'єкт дослідження - свіжа зелень петрушки. Дані наведені в таблиці 9. Приклади 55-59 - об'єкт дослідження - різні харчові продукти: 55 - сік грушевий (до стерилізації), 56 - зелений горошок консервований (до стерилізації), 57 - повидло сливове, 58 пластівці екструдовані (перлові), 59 - м'ясні консерви (до стерилізації). Дані наведені в таблиці 10. Таблиця 1 Вплив умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів водою зі свіжої моркви Умови обробки 1 №№ прикладів 4 5 6 7 контроль 3/1500 2/2000 15/900 4,5 3,3 4,0 4,6 5/7000 3/8000 1/9000 5/9000 30/3000 8,5 7,5 7,1 8,8 8,3 2 Умови 1-го центрифугування [час (хв) / 1/900 частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 10,1 3 осаді (КУО/г, 10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / 3/8000 частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 7,0 4 осаді (КУО/г,  10 ) 3 3/1000 5/1000 2/1500 4,8 3,6 4/6000 6,1 25 Таблиця 2 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів водою з овочевого коктейлю (сік морквяно-яблучний) Умови обробки Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 3 осаді (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 4 осаді КУО/г,  10 ) №№ прикладів 10 11 12 13 контроль 3/1500 2/2000 15/900 2,1 1,6 1,9 2,2 5/7000 5/8000 0,5/10000 4/9000 30/3000 3,4 3,9 4,0 0,3 3,8 8 9 3/1000 5/1000 2/1500 4,3 1,6 4/6000 3,8 3 UA 117316 U Таблиця 3 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів водою з десерту фруктового (персик) Умови обробки Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 3 осаді (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 4 осаді КУО/г,  10 ) №№ прикладів 16 17 18 19 контроль 5/1500 2/2000 15/900 1,2 0,9 1,3 1,5 5/7000 3/8000 1/9000 5/9000 30/3000 2,9 2,7 2,8 3,0 2,7 14 15 3/1000 5/1000 3/1500 1,8 1,1 4/6000 2,7 Таблиця 4 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів водою з пластівців екструдованих (гречаних) №№ прикладів Умови обробки Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 2 осаді (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 3 осаді КУО/г,  10 ) 20 21 22 23 24 25 контроль 3/1000 5/1000 3/1500 5/1500 2/2000 15/900 6,8 4,2 4,6 2,9 4,8 5,0 1/6000 5/7000 3/8000 2/9000 4/9000 30/3000 7,8 11,4 11,1 11,2 11,5 10,9 Таблиця 5 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів водою з приправи з овочами та спеціями Умови обробки Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 3 осаді (КУО/г, 10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 4 осаді КУО/г, 10 ) №№ прикладів 28 29 30 31 контроль 5/1500 2/2000 15/900 3,0 2,1 4,7 3,8 5/7000 3/8000 2/9000 4/9000 30/3000 7,1 6,7 7,2 6,8 6,9 26 27 2/1000 5/1000 3/1500 4,5 2,7 2/6000 6,3 5 4 UA 117316 U Таблиця 6 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів водою з каші п'ять злаків швидкого приготування Умови обробки Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 2 осаді (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 3 осаді КУО/г,  10 ) №№ прикладів 34 35 36 37 контроль 5/1500 2/2000 15/900 4,1 2,6 5,3 4,7 5/7000 3/8000 2/9000 4/9000 30/3000 10,5 10,1 10,6 10,8 10,0 32 33 2/1000 5/1000 3/1500 6,5 3,8 2/6000 9,7 Таблиця 7 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів фізіологічним розчином зі свіжого перцю Умови обробки Співвідношення твердої фази до рідкої Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 2 осаді (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в 4 осаді КУО/г,  10 ) №№ прикладів 40 41 42 43 контроль 1:7 1:10 1:10 3/1500 1/1500 2/1500 15/900 7,1 5,8 2,9 3,5 11,0 5/7000 3/8000 4/9000 1/7000 2/7000 30/3000 3,8 3,6 3,9 3,0 32 3,5 38 39 1:5 1:10 1:5 5/1000 2/1000 6,5 Таблиця 8 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів фізіологічним розчином із різних зразків Умови обробки Співвідношення твердої фази до рідкої Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в осаді 3 (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в осаді 4 КУО/г, 10 ) 44 45 №№ прикладів 46 47 48 1:5 1:10 1:5 1:7 1:10 5/1000 5/1000 2/1000 1/1500 3/1000 2,7 1,4 0,3 0,1 0,4 5/7000 3/8000 2/9000 3/7000 4/8000 2,5 2,4 0,7 0,5 0,6 5 5 UA 117316 U Таблиця 9 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів фосфатним буферним розчином зі свіжої зелені петрушки Умови обробки 49 Співвідношення твердої фази до 1:5 рідкої Умови 1-го центрифугування [час 5/1000 (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в осаді 7,5 2 (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час 5/7000 (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в осаді 4,3 4 КУО/г,  10 ) №№ прикладів 51 52 50 53 54 контроль 1:10 1:5 1:7 1:10 1:10 2/1000 3/1500 1/1000 2/1500 15/900 6,2 7,0 4,0 5,4 12,1 3/8000 4/9000 1/7000 2/7000 30/3000 4,2 4,3 3,6 3,8 3,8 Таблиця 10 Результати дослідження впливу умов центрифугування при виділенні мікроорганізмів фосфатним буферним розчином із різних зразків 55 Умови обробки Співвідношення твердої фази до рідкої Умови 1-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в осаді 2 (КУО/г,  10 ) Умови 2-го центрифугування [час (хв) / частота обертання (g)] Кількість мікроорганізмів в осаді 3 КУО/г,  10 ) 5 10 15 56 №№ прикладів 57 58 59 1:5 1:7 1:5 1:7 1:10 5/1000 3/1500 3/1500 4/1000 3/1000 18,0 36,5 0,7 10,1 7,8 5/7000 3/8000 2/9000 4/7000 4/8000 34,0 41,2 3,9 11,6 70,1 Джерела інформації:: 1. ГОСТ 26671-2014 Межгосударственный стандарт "Продукты переработки фруктов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов" - 5 с. 2. ISO 7932:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus-Colony-count technique at 30 degrees C. 3. Sandra M. Tallent, E. Jeffery Rhodehamel, Stanley M. Harmon, Reginald W. Bennett / The Bacillus Chapter has been updated with the inclusion of a new optional chromogenic agar, Bacara agar, for the detection and enumeration of Bacillus cereus in foods // Bacteriological Analytical Manual, 2012, February. 4. Заявка на изобретение № 2006104588/13 РФ МПК C12Q 1/00 (2006.01) Способ определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами при лабораторном контроле [Текст] / Черепахина И.Я., Фецайлова О.П., Балахнова В.В., Бурлакова О.С, Помухина О.И., Безуглова Е.В., Мазрухо А.Б., Мишанькин Б. Н. Заявитель: Федеральное гос. учреждение здравоохранения Ростовский-на-Дону НИИ противочумный институт, заявл. 14.02.2006, опубл. 10.09.2007. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб попередньої підготовки проб для визначення мікроорганізмів, що передбачає подрібнення досліджуваного зразка, змішування з водою або водним розчином, центрифугування, який відрізняється тим, що досліджуваний зразок змішують зі стерильною 6 UA 117316 U 5 водою або фосфатним буфером, або фізіологічним розчином при масовому співвідношенні досліджуваного зразка і розчинника рівному 1:(5-10,0) і рН=4,8-7,0, отриманий екстракт центрифугують 1-5 хв при 900-2000 g, супернатант переносять в іншу центрифугувальну ємність і повторно центрифугують 1-5 хв при 6000-10000 g, а в осаді, що утворився, визначають наявність мікроорганізмів за допомогою їх фенотипових ознак. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7