Кон’югаційна система, що являє собою радіоактивні терапевтичні ліпосоми, спосіб їх одержання та застосування

Цей винахід стосується кон'югаційної системи, яка містить ліпосоми з іонофорами та хелатором, розташованим усередині ліпосом, де ліпосоми надійно споряджені важкими радіоізотопами, які випромінюють a-частинки. Цей винахід далі стосується способу одержання кон'югаційної системи та застосування цієї системи, а також набору для одержання кон'югаційної системи. Біологічні та медичні застосування радіоізотопів у протираковій терапії до цих пір зосереджувалися на застосуванні катіонних або аніонних зразків, наприклад, [131І]йодиду проти раку щитовидної залози та 89Sr для тимчасового полегшення болю від метастазів раку кісток, та на застосуванні здебільшого бетавипромінювальних радіоізотопів, приєднаних до моноклональних антитіл (De Vita та інші, 1996). Застосування цілеспрямованої радіоізотопної терапії проти раку спирається на можливість знайти способи прикріплення радіоізотопів сполук-носіїв специфічних до пухлин (Ga ze, 1996). Сьогодні деякі з радіоізотопів з корисними радіаційними характеристиками не можна застосовувати для спрямовування у пухлину, тому що існ ує проблема забезпечення хімічно стійким зв'язком між радіоізотопом та сполукоюносієм. Нові системи носіїв можуть, однак, поширити як застосування радіоізотопів, так і арсенал радіоізотопів, які вважають корисними для терапії (Gaze, 1996). Ліпосоми з або без рецепторних афінних груп, прикріплених до поверхні, проаналізували на їхню спроможність доставляти ліки, і вони зараз застосовуються клінічно для доставки хіміотерапевтичних препаратів при деяких формах раку. Розробки у галузі ліпосомних досліджень нещодавно привели до нових версій стосовно фармакокінетики, які можуть зробити ці сполуки корисними в якості носіїв радіоізотопу для внутрішньої протиракової радіотерапії (Gabizon, 1995). Внаслідок цих нещодавніх розробок стосовно складів та виготовлення ліпосом отримали дрібні пухирці розміром менш ніж 100нМ з подовженим часом циркуляції, тому що розмір ліпосом можна найкращім чином обмежити малими діаметрами шляхом застосування екструзії крізь мембрани. Крім того, введення щеплених поліетиленгліколем (ПЕГ) ліпосом знизило втручання білків плазми та, таким чином, знизило розпізнавання та кліренс, що спричиняється макрофагами ретикулоендотеліальної системи (Maruyama, та інші, 1997). Досягли підвищених рівнів поглинання пухлиною завдяки постійній концентрації у крові. Досягли навіть подальшого поглинання пухлиною шляхом спряження молекул з рецепторним афінітетом, наприклад, моноклональних антитіл або фолату з поверхнею ліпосом. Крім того, декілька дослідів вказують на перевагу застосування ПЕГ як лінкера між ліпосомою та лігандом, на який вона спрямовується, тому що це також може поліпшити досягання рецептора (наприклад, Maruyama та інші, 1997, Gabison та інші, 1999, Lee та інші, 1994). Ліпосоми раніше вже досліджували в якості носіїв радіоізотопів. (Goins та інші, 1998, Turner та інші, 1988). Pikul та інші (1987) повідомляли про дослідження на основі 212Рb-декстрану, що вводився пасивно (тобто, 212Рb-декстран додавали під час утворення ліпосоми, та фракція 212Рb-декстран входила до складу разом з водною фазою, утворюючи вн утрішню частину ліпосоми). Автори не передбачали, що ці ліпосоми були придатними для лікування раку, та їх застосовували насамперед для дослідження внутрішньоклітинного лізису клітин in vitro радіоізотопом. Не було представлено жодних даних про долю 212 Ві, утворюваного при розпаді 2І2Рb, а розмір ліпосом становив приблизно 350-500нМ, що є дуже великим порівняно з розміром (приблизно 100нМ), який зараз вважають оптимальним при пухлинній терапії in vivo (Forssen, 1997). Також, ліпосоми не містили ПЕГ у мембрані. Ogihar-Umeda та інші (1996) застосовували ліпосоми в якості носіїв гама-випромінювальних радіонуклідів 67Ga, 111 In та 99mТс та запропонували застосовувати споряджені радіоізотопами ліпосоми для одержання зображень. У теоретичному дослідженні Kostarelos та інші (1999) запропонували застосовувати ліпосоми, споряджені потенційно терапевтичними радіонуклідами 131І, 67Cu, 188Re та 211 At, проте вони не запропонували хімічних способів одержання споряджених радіоізотопами ліпосом. ЕР386 146 В1 описує композицію та спосіб застосування інкапсульованих у ліпосоми сполук для терапії пухлин шляхом захоплення нейтронів. Проте, ці ліпосоми були навантажені стійкими елементами (наприклад, бором), які робилися радіоактивними тільки після активації, та ліпосоми не містили ні іонофорів, ні хелатора. Utkhede та інші (1994) описують ліпосоми, що містять 90Y та хелатор-діетилентриамінпентаоцтову кислоту (DTPA), яка відрізняється від хелаторів, описаних у цьому винаході. Крім того, утримання материнського/дочірнього радіоізотопу(-ів) не описано, та, крім того, 90Y не є важким елементом, на відміну від елементів, описаних у цьому винаході. Для того, щоб досягти достатньо надійного спорядження носіїв важкими альфа-випромінювальними радіоізотопами, звичайно необхідно здійснити специфічні хімічні процедури, пристосовані так, щоб відповідати хімії кожного елемента, та такі способи невідомі. Не можна чекати, що процедури, які застосовуються для спорядження радіоізотопами, наприклад, Ga, In, Тс, Сu або Re будуть придатними для альфа-випромінювальних катіонів важких радіоізотопів (атомна вага перебільшує 150), таких як, наприклад, 212½ 213 Bi,212Pb, 223/224Ra, 227Th або 225 Ас. Отже, предметами цього винаходу є кон'югаційна система радіоізотопів-ліпосом з або без споріднених до рецептора груп, яка (1) інкапсулює хелатор та важкий радіоізотоп(-и), який випромінює альфа-частинки, (2) може утримувати дочірній ізотоп(-и), якщо материнський ізотоп(-и) вводиться у ліпосому, та (3) яку можна одержати із застосуванням способу активного введення, придатного для ряду радіоізотопів, а також застосування системи та набір для одержання цієї системи. Ці предмети винаходу забезпечуються цим винаходом та характеризуються формулою винаходу, що додається. Цей винахід стосується кон'югаційної системи, яка містить ліпосоми з іонофорами, тобто агентами, що екстрагують метал для ліпосом, та з хелатором, та з важким радіоізотопом(-ами) (атомна вага перебільшує 150), розташованими усередині ліпосоми. Ліпосоми одержують, застосовуючи активне введення радіоізотопу, тобто через іонофори, та одержують згідно зі способами виробництва ліпосом з розміром звичайно 100нМ. Кінцевий продукт демонструє гарну хімічну стійкість протягом декількох днів та може також утримувати дочірній ізотоп(-и) усередині ліпосоми, наприклад, при трансформації 212Рb у 212Ві. Ліпосоми можна виготовити з або без модифікувальних груп, таких як поліалкіленоксиди, наприклад ПЕГ, приєднаних до мембрани. Тут ми також описуємо спосіб зв'язування таких споряджених радіоізотопами ліпосом з білками, що шукають пухлину, такими як, наприклад, кон'юговані з фолатом моноклональні антитіла. Цей винахід далі буде описано докладніше, з посиланням на фігури та приклади. Фігура 1. Зв'язування з клітинами OVCAR 3 ПЕГлікованих ліпосом, які містять Fab' або споряджене фолатом антитіло з Fab', кон'юговане з мембраною ліпосоми. Фігура 2. Зв'язування з клітинами OVCAR 3 ліпосом з ПЕГ, спряжених з фолатом, порівняно з неспряженими з фолатом ліпосомами з ПЕГ. Для одержання споряджених радіоізотопами ліпосом, придатних для лікування раку, автори цього винаходу досліджували виготовлення та застосування ліпосом, які містять важкі радіоізотопи (тобто, їхня атомна вага перебільшує 150), які випромінюють альфа-частинки, на основі радіонуклідів 212Ві, 21ЗВі, 223Ra, 224 Ra, 225 Ac, 212Pb та 227 Th. Застосовуючи ліпосоми (пухирці) з іонофорами, споряджені радіоізотопами ліпосоми переважно з хелатором (тобто, ліпосоми, що інкапсулюють радіоізотоп та хелатор) одержали шляхом активного введення радіоізотопу та згідно зі способами, що дозволяють одержати ліпосоми звичайного розміру, який становить 100нМ. Одношарові пухирці одержали шляхом гідратації тонкої ліпідної плівки та екструзії (Olson та інші, 1979, Мас Donald та інші, 1991) наступним способом: дистеароїлфосфатидилхолін (DSPC) та холестерин у молярному співвідношенні 2:1, звичайно 10 та 5мкмоль, відповідно, розчинили у хлороформі у круглодонній колбі. Розчинник видалили шляхом роторного випаровування із застосуванням зниженого тиску. Суху ліпідну плівку потім гідратували у 0,5-1мл 150мМ лимонної кислоти, 30мл DOTA (1,4,7,10 тетраазациклододекан 1,4,7,10N,N',N",N'"тетраоцтова кислота), pH 4. Одержана в наслідок цього суспензія зазнала п'ять циклів заморожування та розморожування з наступною повторюваною екструзією крізь полікарбонатні фільтри з розміром пор 100нМ, яку здійснювали п'ять разів, та крізь фільтри з розміром пор 50нМ, яку також здійснювали п'ять разів, при цьому застосовували ручний пристрій для екструзії (Avestin, Ottawa, Canada). Продукт мав ліпідну концентрацію приблизно 30мМ. До початку введення радіоізотопу у ліпосоми зовнішній розчин зазнав обміну шляхом елюювання на колонці PD-10 250мМ цукрози, 20мМ HEPES (N-2-гідроксиетилпіперазин-N'-2-етансульфонова кислота), рН7,4. Компоненти ліпосом: а) внутрішнє водне середовище: pH 1-14, переважно 2-9, більш переважно 4-5. Компоненти: вода, агенти, спроможні підтримувати бажаний pH у внутрішньому водному середовищі протягом бажаного періоду часу, а саме, доки не почнеться опосередковане іонофорами введення радіоактивного металу(-ів). Переважно, компоненти внутрішнього водного середовища зумовлюють функцію комплексоутворення радіоактивного металу(-ів). Це може бути наслідком впливу і) наприклад, електростатичної донорської функцій агентів, які застосовуються для регулювання pH, наприклад, атома(ів) кисню в ацетатних, цитратних та споріднених сполуках, іі) та крім того, наслідком наявності комплексоутворюючого агента у вн утрішньому водному середовищі, наприклад, EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), DTPA (діетилентриамінпентаоцтова кислота), DOTA (1,4,7,10тетраазациклододекан 1,4,7,10N,N’,N",N'"тетраоцтова кислота), DOTMP (1,4,7,10тетраазациклододекан-1,4,7,10 N,N’,N",N”'-тетра(метилен)фосфонова кислота) та споріднених сполук. b) Іонофори: наприклад, агенти, спроможні транспортувати, практично необоротно, радіоактивний метал крізь ліпідний подвійний шар з позаліпосомної фази усередину ліпосоми. Приклади: іонофори, які продемонстрували, що функціонують бажаним чином: кальцій-іонофор А 23187, дициклогексил 18-С6, бібензо-18-С6, 2,3-димеркапто-1-пропанол, Рb-іонофори. c) Компоненти ліпідного подвійного шару: компоненти ліпідного подвійного шару переважно утворюються у суміші, яка є здатною утворювати пухирці та для якої температура переходу із рідини у тверду речовину перебільшує фізіологічну температуру, наприклад, і) фосфоліпіди. Приклади: алкілфосфа тидилхоліни з довгим ланцюгом, наприклад, 1,2-дилауроїл-sn-гліцеро-3-фосфохолін (DLPC), 1,2динліристоїл-sn-гліцеро-3-фосфохолін (DMPC), 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3-фосфохолін (DPPC), 1,2дистеароїл-sn-гліцеро-3-фосфохолін (DSPC), 1,2-діолєоїл-sn-гліцеро-3-фосфохолін (DOPC), 1-пальмітоїл-2олеоїл-sn-гліцеро-3-фосфохолін (РОРС), іі) стероли або сполуки, що мають схожі властивості у тому, що вони загущують (знижують плинність) ліпідний подвійний шар. Приклади: сполуки стиролового класу: холестерин та холестерин 3-сульфат, та ііі) (стерично) in vivo стабілізатор(-и) покращення властивостей конструктів стосовно цілеспрямованості доставки у п ухлинну клітину та подовження часу знаходження у крові, наприклад, прості поліефіри, поліетиленгліколі. Введення ПЕГ та/або похідних ПЕГ у ліпосомні склади надасть переваг стосовно зниження ретикулоендотеліальною системою кліренсу ліпосом, що вводяться шляхом ін'єкції, з циркуляційної системи. Звичайно вводяться у препарат у 3-10 молярних % відносно фосфоліпіду. Кількість стабілізатора, яка необхідна для отримання бажаного стабілізуючого ефекту, залежить, проте, від мономеру (електростатичних та полярних властивостей) та кількості повторних одиниць, тобто від довжини ланцюга. Приклади (ПЕГ та/або похідні ПЕГ): 1,2-динліристоїл-snгліцеро-3-фосфоетаноламін-N-[полі(етиленгліколь)2000] (ПЕГ2000 DJUPE), 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3фосфоетаноламін-N-[полі(етиленгліколь)2000] (ПЕГ2000 DPPE), 1,2-дистеароїл-sn-гліцеро-3фосфоетаноламін-N-[полі(етиленгліколь)2000] (ПЕГ2000 DSPE). d) Компоненти, що сприяють модифікації конструктів, щоб вони мали властивості для цілеспрямованого досягнення пухлинної клітини: вибір відповідного активованого ліпіду буде визначатися природою гаптену, а також вимогами дослідження. Ефективність реакції буде зумовлюватися відщеплюваною групою, гідрофільним спейсером, властивостями матеріалу ліпосоми та концентрацією реагентів. Для досліджень in vi vo, у яких необхідно, щоб гаптен залишався зв'язаним з ліпосомою, певні переваги досягаються завдяки вибору ліпідних якорів з більш довгим ацильним ланцюгом, які обмінюються повільніше між мембранами. Далі, ковалентний зв'язок між гаптеном та ліпідним якорем повинен бути стійким як до хімічного розщеплення, так і до ферментативного гідролізу. Активовані ліпіди можуть функціонувати так, що вони утворюють, наприклад, амінний, амідний, тіоефірний або дисульфідний зв'язки між ліпідом та модифікатором. Якщо стеричні стабілізатори вводяться у препарат, наприклад ПЕГ та/або похідні ПЕГ, група, що функціонує для взаємодії, переважно, знаходиться на кінці сполуки, що є ідентичною або подібною до стабілізатора, та має ефективну довжину ланцюга, що дорівнює або перебільшує довжину ланцюга стабілізатора. Приклади: компоненти пухирців, які сприяють модифікації конструктів так, щоб вони мали властивості цілеспрямовано досягати пухлинної клітини, з ПЕГ та/або похідних ПЕГ: N-[w-(2піридилдитіопропіоніламіно)полі(етиленгліколь)2000] 1,2-дистеароїл-sn-гліцеро-3-фосфоетаноламін (PDPPEG2000-DSPE), N-{w-[4-(p-малеїмідофеніл)бутаноїл]аміно}полі(етиленгліколь)2000]1,2-дистеароїл-snгліцеро-3-фосфоетаноламін(МрВ-РЕG2000-DSРЕ). Відокремлення пов'язаного з ліпосомами радіоізотопу, від не пов'язаного з ліпосомами радіоізотопу, здійснили шляхом застосування гель-витіснювальної хроматографії (Mauk and Gamble 1979, Tilcock та інші 1991). Для такого відокремлення після процедур завантаження ліпосом застосовували колонки для гельвитіснювальної хроматографії PD-10. Завдяки застосуванню об'ємів 1мл або менше на колонках PD-10 ліпосоми елюювалися у перші 4,5мл. Радіоізотопи, не пов'язані з ліпосомами, елюювалися у фракцію, що відповідає зразкам з низькою молекулярною вагою. Колонки PD-10 також застосовували у дослідженні надійності (щодо утримання радіоізотопу) навантажених ліпосом у соляному розчині з фосфатним буфером. Відокремлення пов'язаних з ліпосомами радіоізотопів від вільних радіоізотопів у сироватці здійснювали шляхом гель-витіснювальної хроматографії на колонці Sepharose CL-4B (Hwang and Mauk, 1977). Таким чином можна приготувати розчини, які містять радіоактивні ліпосоми, дисперговані у рідкому носії, який практично не містить незв'язані радіоізотопи. EDTA (етилендіамін N,N'тетраоцтову кислоту) додали до початку процедур хроматографії з метою стабілізації вільного радіоізотопу у стані, при якому його можна легко відокремити від пов'язаної з ліпосомами фракції. Кількість введених радіоізотопів та латентність пов'язаних з ліпосомами радіоізотопів визначили шляхом гама-резонанасної спектроскопії для 228 Ас, 223Ra, 212Pb, 212Ві, 205Ві та 207Ві. 228 Ас та 205/207Bi застосовували як ізотопний індикатор для потенційно терапевтично придатних радіонуклідів 225Ас, 212Ві та 213 Ві, відповідно. Автори цього винаходу зробили значне та несподіване відкриття того, що 212Ві не зазнає суттєвого переміщення після розпаду 212Рb, введеного у цей тип ліпосом. Сучасний стан застосування 212Рb як молекулярнозв'язаного генератора 212Ві вказує на те, що звичайно трапляється суттєве виділення (більше або дорівнює 30%) з хелатора (McClure and Feinendegen, 1998, Mirzadeh та інші, 1993). Проте, завдяки уловлюванню 212Рb при високій концентрації хелатора, такій, як наприклад, усередині ліпосоми, можна уникнути виділення дочірнього продукту, використовуючи кон'югаційну систему, яку можна застосовувати для уловлювання дочірнього ізотопу після ядерного перетворення. Це вперше, коли повідомляється про кон'югаційну систему для 212Рb, яка може утримувати дочірній ізотоп 212Ві майже у загальній кількості. Отже, цей винахід стосується ліпосом з іонофорами, які містять радіоізотоп та хелатор, розташовані усередині ліпосоми (кон'югаційна система), та де ця кон'югаційна система може або не може утримувати дочірній ізотоп. Хелатор згідно з цим винаходом можна обрати з групи, яка містить 1,4,7,10 тетраазациклододекан1,4,7,10N,N',N",N'''-тетраоцтову кислоту (DOTA), 1,4,7,10тетраазациклотридекан-1,4,7,10N,N',N",N'''-тетраоцтову кислоту (TRITA), 1,4,7,10тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10N,N',N",N'''-тетраоцтову кислоту (ТЕТА), 1,4,7,10тетраазациклодо декан-1,4,7,10N,N',N",N'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту (DOTMP), 1,4,7,10тетраазациклотридекан-1,4,7,10N,N',N",N'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту, 1,4,7,10тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10N,N',N",N'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту, діетилентриамін N,N’,N"пентаоцтову кислоту та її ізомерні похідні, криптат[2,2,2], криптат[3,2,2], криптат[2,2,1] та їхні моно- та ди-бензо-похідні, з'єднані місточковим зв'язком калікс[4]арени, що містять багаті електронами (донорські) групи (гідроксил, карбоксил, естер, амід, амін), 1,10діаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10N,N'біс-оцтову кислоту та 1,10діаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10N,N'біс-малонат. Інше важливе та несподіване відкриття полягало у тому, що ліпосоми згідно з цим винаходом могли містити та ефективно утримувати 223Ra. Це вперше, коли описується кон'югаційна система, що є потенційно придатною для доставки у пухлину радію-223. Крім того, ми демонструємо, що вісмут та актиній також можна включати та ефективно утримувати в описаному тут типі ліпосом, що вказує на те, що можна також одержати кон'югаційну систему на основі 212Ві, 213Ві та 225 Ас. Кон'югаційну систему згідно з цим винаходом можна також виготовити з або без груп, що модифікують поверхню, наприклад, ПЕГ, у мембрані ліпосоми (щеплені ПЕГ/ПЕГліковані ліпосоми). Перевага застосування ПЕГ у мембрані полягає у тому, що їх застосування забезпечує декількома реакційноздатними ПЕГ-групами, що сприяє кон'югації з білками, такими як, наприклад, антитіла, фрагменти антитіл, або конструкта, або фолат, або інші споріднені до рецепторів (рецептор-зв'язувальні) білки/молекули. Цей винахід далі стосується нового типу ліпосом з рецептор-зв'язувальними білками, приєднаними до мембрани ліпосоми. Тут ми описуємо споряджені радіоізотопами щеплені ПЕГ ліпосоми, кон'юговані зі спорядженими фолатом антитілами. Застосування фолату та похідних фолату для націлювання на пухлину, що експресують фолат-зв'язувальні білки (FBP), білок клітинної мембрани, з'єднаний з глікозилфосфа тидил-інозитолом, який включається у клітинне поглинання окиснених фолатів через ендоцитоз, привертає увагу дослідників (Kranz та інші, 1996, Reddy та інші, 1998, Shinoda та інші, 1998, Trippet та інші, 1999). Оскільки було продемонстровано, що декілька типів ракових клітин людини надмірно експресують фолат-зв'язувальний білок, то цей рецептор може бути можливою мішенню для доставки терапевтичних радіоізотопів, зв'язаних з фолатом. Отже, застосовуючи кон'юговані з фолатом антитіла, можна отримати спрямований радіоізотопний терапевтичний засіб проти раку. Крім того, якщо споряджений фолатом антигензв'язувальний центр антитіла спрямовується проти пов'язаного з пухлиною антигену, відмінного від фолат-зв'язувального білка, досягається спроможність подвійного зв'язування (тобто, досягається спорідненість як до цього антигену, так і до фолат-зв'язувального білка-рецептора). До вашої уваги, це вперше, коли описується кон'югація споряджених фолатом антитіл. Споряджені фолатом антитіла, кон'юговані з ліпосомами згідно з цим винаходом, можна далі мітити радіоізотопом або сумішшю різних радіоізотопів для підвищення ефективності радіотерапії. Цей винахід демонструє, що цю нову комбінацію споряджених фолатом антитіл, кон'югованих з ліпосомами, можна застосовувати для доставки радіоізотопу(-ів) до клітин, що експресують рецептори фолату. Це є особливо корисним з випромінювачами альфа-частинок, що характеризуються великими втратами енергії на одиницю шляху пробігу (high-LET), які є особливо цитотоксичними для клітин ссавців (Hall, 1994, Larsen та інші, 1998, Ritter та інші, 1977). Проте, джерело альфа-випромінювання може доставляти випромінювання до надзвичайно дрібної ділянки, порівняно з іншими типами випромінювання. Отже, якщо джерело альфа-випромінювання можна спрямувати до тканини-мішені, тоді можна знизити опромінення здорової тканини. Кон'югаційну систему згідно з цим винаходом можна також застосовувати для спрямовування на клітини, що експресують, наприклад, естрогенний рецептор або тестостеронний рецептор, шляхом кон'югування антитіл з естрогеном або тестостероном. Споряджені антитіла, що застосовуються згідно з цим винаходом, є переважно класу IgG або IgM, та/або їхніми фрагментами або конструктами (наприклад, мінітілом). Крім того, ці антитіла, та/або фрагменти, та/або конструкти можуть бути мишачими, химерними або повністю людськими, поліклональними або моноклональними. Цей винахід також стосується застосування кон'югаційної системи згідно з цим винаходом для приготування фармацевтичного розчину, придатного для ін'єкцій або інфузій ссавцям, у тому числі людям, внутрішньовенно, та/або місцево, та/або шляхом введенням у пухлин у. Фармацевтичний розчин можна застосовувати у комбінації з радіоактивним імунокон'югатом або декількома радіоактивними імунокон'югатами та/або у комбінації з іншими формами променевої та фармацевтичної терапії, хіміотерапії, дистанційної променевої терапії або хірургії для лікування злоякісних хвороб. Цей винахід також стосується способу застосування кон'югаційної системи згідно з цим винаходом для лікування ракових хвороб, таких як, наприклад, рак головного мозку, рак легенів, рак шийки матки, рак яєчників, рак молочної залози, лейкозу, лімфоми або злоякісної меланоми. Цей винахід також стосується набору для одержання кон'югаційної системи згідно з цим винаходом, який містить пробірку, яка містить ліпосомний розчин, та другу пробірку, яка містить радіоізотоп у розчині, які можна змішати для полегшення спорядження радіоізотопами. Крім того, цю суміш можна змішати з вмістом третьої пробірки, яка містить білки та/або молекули з рецепторним афінітетом, для одержання кон'югаційної системи з рецепторним афінітетом. Реагенти та обладнання Гама-резонансну спектроскопію виконували із застосуванням германієвого детектора (Canberra, Meriden, CT, USA), зв'язаного з багатоканальним аналізатором (EG&G ORTEC, Oak Ridge, TN, USA). Прилад Beckmann LS (Beckmann, Fullerton, CA, USA) застосовували для сцинтиляційного рахування. DSPC та холестерин купували у Northern Lipids (Vancouver, Canada). Колонки Sephadex G-25 PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) застосовували для очищення споряджених радіоізотопами ліпосом. Макроциклічний хелатор DOTA застосовували як внутрішньоліпосомний хелатор та його купували у Macrocyclics (Richardson, ТХ, USA). У цьому дослідженні застосовували HNO3 класу Ultrex (J. Т. Baker, Phillipsburg, NJ, USA), та 6 M HC1 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA), та біс(2-етилгексил) фосфорну кислоту (HDEHP) від Fluka (через Sigma-Aldrich AS, Norway). Усі буфери, які застосовувалися для опосередкованого іонофорами катіонного навантаження ліпосом, довели до бажаного pH шляхом застосування аргініну (вільна основа). Усю воду, що застосовувалася, отримали, застосовуючи систему очищення води Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Іонообмінні смоли постачалися Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Смоли попередньо кондиціонували шляхом промивання водою, потім 6М НСl, а потім ацетоном та, зрештою, водою. Смоли зберігали у воді до заповнення колонок. Диметилсульфоксид (ДМСО), який застосовували, зберігався у 4 Å си тах. 232 Th(NO3)4 , що застосовувався у цьому дослідженні, зберігався понад 20 років. Зразок отримали від Nuclear Chemistry Group, Department of Chemistry University of Oslo, Oslo, Norway. 3 Н-фолієву кислоту купували у Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Усі інші реагенти купували у Sigma-Aldrich, Norway. Таблиця 1 демонструє деякі фізичні властивості радіоізотопів, що застосовувалися в експериментах з ліпосомами. Таблиця 1 Ізотоп 228 Ас 223 Ra 212 Pb Ti 207 Вi 205 Ві 208 tin 6,13 години 11,43 доби 10,6 години 3,05 хвилини 31,55 року 15,31 доби гамма-випромінювання 911,2(26,6) 269,4(13,7) 271,2 (0,108) (219Rn)2 238,6 (43,6) 583,1 (32,5) 569,7 (97,7) 703,4(31,1) % ймовірності 26,6 13,7 10,8 43,6 35,2 97,7 31,1 *Лише найбільш інтенсивне гама-випромінювання перелічено для кожного радіоізотопу. Дані від Nuclear Data Sheets, Academic Press INC. У ліпосоми, приготовані згідно з описаними процедурами, ввели радій-223 або свинець-212. Після цього антитіла піддали реакції з ліпосомами з метою досягнення розташування молекул антитіла на поверхні ліпосом. Розмір ліпосом приблизно 100мкм буде відповідним для системної доставки, проте звичайні розміри 200-1000мкм можна застосовувати, коли треба здійснити внутрішньопорожнинну доставку, наприклад, для лікування внутрішньочерепної пухлини головного мозку або для лікування внутрішньочеревинного раку яєчників. (Більш великий розмір ліпосом може знизити швидкість кліренсу порожнини, в яку вводиться препарат шляхом ін'єкції, тим самим зберігаючи високу концентрацію препарату у ділянці пухлини). ПРИКЛАДИ Приклад 1. Введення 212РЬ/ 212Ві у ліпосоми Способи: 212Рb/212Ві одержали шляхом утворення 220Rn з джерела 228Th, як описано Hassfjell and Hoff (1994). Жоден з доданих носієм 212Рb/212Ві не вилуговувався зі збиральної судини при застосуванні 0,1М HNO3 та розчин вилили у колонку розміром 2х20мМ з катіонообмінною смолою AG 50W-X4. 212Рb/212Ві потім елюювали 2М НСl та розчин випаровували до сухого стану. 212Рb/ 212Ві потім розчинили у 200мкл 10мМ розчину ацетату, pH 5.212РЬ кількісно проаналізували шляхом вимірювання його гама-випромінювання 238,6кеВ (Таблиця 1). 212Ві кількісно оцінили шляхом вимірювання гама-випромінювання 583,1кеВ його дочірнього 208Т1 при радіоактивній рівновазі. Результати: Визначили, що менш ніж 0,2% від доданої радіоактивності пов'язувалося з ліпосомами протягом часу витримування до 3 днів. Лiпосоми, які відповідали ліпідній концентрації 30-60мМ, сильно перемішали з плівкою іонофора А23187 (10-13нМ). Потім додали приблизно 1МБк 212Рb/212Ві та суміш витримували при 75°С протягом 30 хвилин, після цього елюювали на колонці PD-10. Фракцію, що містила більш ніж 95% навантажених пухирців, потім елюювали на другій колонці PD-10. Латентність пов'язаних з ліпосомами 212Рb/212Ві визначали шляхом витримування пухирців при 37°С у сироватці людини або у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (PBS). Радіоактивне розповсюдження проходило після цього протягом 24 годин. Результати: Ефективність введення 212Рb: 34,8% (n=3). Утримання вимірювали шляхом гама-резонансної спектроскопії, та більш ніж 99% 212Рb пов'язувалося з ліпосомами протягом часу витримування, який становив до 24 годин. Приклад 2: Утримання 212Ві, утвореного внаслідок розпаду пов'язаного з ліпосомами 212Рb Способи: У ліпосоми ввели 212Рb, як описано вище. Пов'язану з ліпосомами радіоактивність виділили шляхом елюювання реакційної суміші 10мМ EDTA у PBS на колонці PD-10, попередньо урівноваженій 10мМ EDTA у PBS. Через 3 години для того, щоб переконатися, що між 2І2РЬ та 212Ві встановилася перехідна рівновага, аліквотні проби розчину помістили у колонки PD-10, попередньо урівноважені 10мМ EDTA у PBS, для відокремлення вільних радіоізотопів від пов'язаних з ліпосомами радіоізотопів. Радіоактивне розповсюдження проходило після цього протягом 24 годин. Окрему аліквоту споряджених ліпосом, які не зазнали процедури відокремлення (з геометрією, ідентичною до геометрії, отриманої з процедур хроматографії), вимірили та застосовували як стандартну. Це виконували для визначення коефіцієнта радіоактивності 212Рb/212Ві при радіоактивній рівновазі. Результати: Шляхом порівняння коефіцієнта 212Рb/212Ві, отриманого для ліпосом, відокремлених шляхом хроматографії, з коефіцієнтом рівноважної суміші, визначили та продемонстрували, що більш ніж 95% 212Ві утримується у ліпосомах після розпаду пов'язаного з ліпосомами 212Рb. Крім того, порівнювали вимірювання радіоактивності 212Ві у дво х фракціях, отриманих шляхом хроматографії. Більш ніж 99% від загальної радіоактивності 212Ві елюювалися у фракції, що відповідають ліпосомам. Приклад 3: Досліджування можливого перенавантаження Рb та Ві у ліпосомах Способи: До плівки іонофора А23187 (20-26нМоль на внутрішній поверхні скляної пробірки), застосовуючи зовнішній розчин, що містить 10мМ EDTA у PBS, додали ліпосоми, що відповідають ліпідній концентрації 30-60мМ, 150мМ уловлювальної лимонної кислоти, 30мМ DOTA. Потім додали 212Рb та 212Ві у PBS з наступним витримуванням при 37°С. Аліквоти розчину пропускали крізь колонки PD-10 та фракції, отримані шляхом хроматографії, які відповідали ліпосомному елюату, проаналізували із застосуванням вбудованого Ge-детектора. Результати: Ніякого помітного навантаження (менше 1%) 212Рb та 212Ві не спостерігали протягом 24 годин. Приклад 4: Введення 223Ra у ліпосоми 223 Ra одержали з генератора на основі 227Ас, як описано у Larsen and Henriksen, 1999. Стисло, 227Ас та його дочірній ізотоп 227Th утримувалися у колонці зі смолою для екстракційної хроматографії, яка сприяє елююванню 223Ra, із застосуванням мінеральної кислоти. Для введення радію у ліпосоми елюйований розчин з генератора випаровували до сухого стану та 223Ra потім розчинили у 5мМ цитраті, pH 7,4. Ліпосоми, що відповідали ліпідній концентрації 30-60мМ сильно перемішували з плівкою іонофора А23187 (10-13нМоль на внутрішній поверхні скляної пробірки). Після цього додали приблизно 50кБк 223Ra та суміш витримували при 75°С протягом 20 хвилин. Реакційну суміш потім додали до 100мкл 10мМ EDTA та елюювали на колонці PD-10 для відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними пухирцями. Утримання пов'язаного з ліпосомами 223Ra досліджували шля хом витримування пухирців при 37°С у сироватці людини (Sigma) або 5мМ EDTA у сироватці людини при концентрації ліпосом 0,3мг загального ліпіду/мл сироватки. Результати наведено у Таблиці 2, і вони демонструють, що 223Ra дуже стабільно утримується у ліпосомах. Таблиця 2 Тривалість витримки (дні) 1 3 4 % від усього 223Ra у ліпосомній фракції 94,6±1 94±2,5 94,7±0,5 Середнє стандартне відхилення, n=4 Приклад 5: Визначення, чи буде перенавантаження впливати на експеримент утримання 223Ra Способи: До плівки іонофора А23187 (10-13нМоль розподілені на внутрішній поверхні скляної пробірки) додали ліпосоми, що відповідали ліпідній концентрації 30-60мМ, утворені шляхом гідратації ліпідних плівок 150мМ лимонної кислоти, 30мМ DOTA, у якості зовнішнього розчину був PBS або сироватка. Потім додали 223 Ra у 5мМ цитрату з pH 7,4 з наступним витримуванням при 37°С. Аліквоти розчину пропускали крізь колонки PD-10 та отриману шляхом хроматографії фракцію, яка відповідала ліпосомам, проаналізували із застосуванням вбудованого Ge-детектора. Приклад 6: Введення 207Ві у ліпосоми Способи: 203-207Bi отримали шляхом реакцій (р. хn) на природних свинцевих мішенях та очистили із застосуванням смоли для селективної екстракційної хроматографії свинцю (Henriksen and Hoff, 1998). Суміш ізотопів Ві, що складається здебільшого з 205Ві та 207Ві, яку далі позначатимемо як 207Ві, застосовували у цьому досліді. 50мкл розчину 207В у 10-4М НСl додали до ліпосом, що відповідають ліпідній концентрації 30-60мМ, які заздалегідь змішали з плівкою іонофора А23187 (10-13нМоль на внутрішній поверхні скляної пробірки) та витримували протягом 30 хвилин при 75°С. Потім реакційну суміш додали у 100мкл 10мМ EDTA та елюювали на колонці PD-10 з метою відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними пухирцями. Результати: Визначили, що 32% від усього 207Ві пов'язувалося з ліпосомами. Приклад 7: Введення 228 Ас у ліпосоми Способи: 228 Ас відокремили від препарату 232 Th(NO3)4 шля хом комбінації екстракції розчинником та іонного обміну. 232 Th(NO3)4 (первинно 4Н2О) розчинили у 20мл 0,1М HNO3, та додали у ділильну лійку об'ємом 500мл, та примусили контактувати з 5х100мл 2М розчину HDEHP у гептані. Водну фазу потім тричі промили гептаном та потім пропустили крізь 3х40мМ колонку з катіонообмінною смолою AG50W-X12 для відокремлення 228 Ас, як описано у Cabell, 1959. 2l2Pb, 212Bi, 224Ra та 228Ra елюювали з колонки 3М HNO3 та розчин залишили на більш ніж 20 годин. Розчин потім випаровували до сухого стан у з наступним вилуго вуванням радіоізотопів з судини за допомогою 1мл 1М HNO3. Цей розчин пропустили крізь 3х40мМ колонку AG50W-X12. Знов 212Рb, 212Ві, 224Ra та 228Ra елюювали 3М HNO3. 228 Ас елюювали 6М HNO3 та елюат випаровували до сухого стану. 228 Ас потім вилуговували з судини, застосовуючи 200мкл 5мМ HNO3. Приблизно 6кБк 228 Ас додали у ліпосоми, що містили іонофор А23187, як описано вище, та витримували протягом 60 хвилин при 75°С. Реакційну суміш потім додали до 100мкл 10мМ EDTA та елюювали на колонці PD-10 з метою відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними пухирцями. Фракції, що відповідали більш ніж 95% навантажених пухирців, зібрали та потім елюювали на другій колонці PD-10. Утримання 228 Ас ліпосомами досліджували шляхом витримування споряджених радіоізотопами пухирців при 37°С у сироватці людини або у PBS. Поширення радіоактивності після цього тривало протягом 24 годин. Результати: В експерименті введення 90-95% від доданого 228 Ас (скоректовано з урахуванням розпаду під час навантаження та очищення) зв'язувалося з ліпосомами після процедури навантаження. Визначили, що в експерименті утримання більш ніж 98% 228 Ас пов'язувалося з ліпосомами протягом часу витримування, який становив до 24 годин. Приклад 8: Введення 90Y Способи: 90 Y застосовували як ізотопний індикатор у цьому прикладі для дослідження поведінки споряджених радіоізотопами ліпосом. 90Y та 90Sr у цьому досліді вимірювали шляхом рідинного сцинтиляційного рахування. 90 Y відокремили від 90Sr за допомогою смоли для селективної екстракційної хроматографії стронцію, як описано у Dietz and Horwitz (1992). Тут, 90Sr (Amersham, Buckinghamshire, England) у 0,1M HNO3 випаровували до сухого стану та у залишок додали 3М HNO3. Розчин пропустили крізь 3х20мМ колонку зі смолою для стронцію (EiChroM, Darien, IL, USA) та колонку промили 5мл 3М HNO3. Ця процедура селективно елюює 90 Y, у той час як Sr практично утримується у колонці, зменшуючи вміст 90 Sr у суміші 90Sr/90 Y з коефіцієнтом приблизно 103 (Dietz and Horwitz, 1992). Після цього 90Sr видалили з колонки із застосуванням 0,05М HNO3 та цей розчин залишили на один тиждень для того, щоб дозволити 90 Y збільшитися. Потім розчин випаровували до сухого стану та у залишок додали 3М HNO3 перед відокремленням радіоізотопів на другій колонці зі смолою для стронцію. Елюат, що містив 90 Y, випаровували до сухого стан у та радіоізотоп вилуговували з судини, застосовуючи 200мкл 5мМ HNO3. Цей розчин додали до ліпосом, що містили іонофор А23187 (як описано вище), та ви тримували протягом 60 хвилин при 75°С. У реакційну суміш потім додали 50мкл 10мМ EDTA та елюювали на колонці PD-10 для відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними пухирцями. Фракцію, яка відповідає більш ніж 95% пухирців, потім елюювали на другій колонці PD-10. Утримання ліпосомами пов'язаного з ліпосомами 90Y досліджували шляхом витримування пухирців при 37°С у сироватці людини або у PBS. Поширення радіоактивності тривало після цього протягом 4 днів. Результати: Більш ніж 95% від доданого 90Y пов'язувалося з ліпосомами після 1 години введення та очищення на гель-витіснювальній колонці. У досліді з ліпосомним утриманням отримали наступні результати: після 5 годин та одного дня більш ніж 99% були пов'язаними з ліпосомами. Через 4 дні визначили, що пов'язана з ліпосомами фракція становила 98±1%. Як продемонстровано у цих експериментах, ліпосоми можна споряджати радіоізотопами, що випромінюють альфа-частинки та/або бета-частинки, та що вони можуть добре утримувати ці ізотопи при фізіологічній температурі. Приклад 9: Одержання ПЕГлікованих ліпосом, зв'язаних з фолатом-Fab’, що містять ітрій-90/радій-223 14мг/мл F(ab')2 RÆ мієломи (Субклас IgG1) у PBS застосовували для цього експеримента (Michalsen, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway). Кон'югація фолієвої кислоти з антитілами Фолієву кислоту *2Н2О спочатку розчинили у диметилсульфоксиді (Fluka, вміст Н 2О менш ніж 0,05%). Розчин потім перемістили за допомогою канюлі на активовані сита 4Å (Fluka) та зберігали в атмосфері аргону у темряві протягом 6-10 годин. Мічений тритієм фолат (3Н-фолат) додали у виді розчину солі калію 3 Н-фолату (1% відносно лимонної кислоти). Специфічна радіоактивність 3Н-фолату, який застосовували для кон'югації з білком, становила 7-7,5ГБк/моль. 3 Н-фолат активували для взаємодії з F(ab')2 антитіла мієломи шляхом додавання 10 мольних еквівалентів 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл)карбодііміду у розчин фолату та витримування протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після цього активований фолат з молярним надлишком у 30-40 разів додали до білку, 14мг/мл у PBS, та дозволили здійснюватися реакції протягом 30-60 хвилин. Реакцію загасили шляхом додавання 0,2мл 0,3М гліцину у PBS/бораті, pH 8,5. Кон'югат фолату та F(ab')2 (фолатР(аb')2) відокремили від матеріалу, який не реагував, застосовуючи колонку PD-10, попередньо урівноважену PBS. Для того, щоб утворити фолат-Fab’, фолат-Р(аb')2 витримували у 1мМ дитіотреїтолі (DTT) при кімнатній температурі протягом 2 годин з наступним елююванням на гель-витіснювальній колонці NAP-5. Фракцію, що містила фолат-Fab’, дезоксигенували шляхом барботування аргону крізь розчин, після чого розчин одразу змішали з ліпосомним розчином. Ступінь кон'югації фолієвої кислоти визначили вмістом 3Н в очищеному білку, що вимірили шляхом рідинного сцинтиляційного рахування (Beckmann LS6500) разом з даними спектрофотометрії при 280нМ. Для кількісного оцінювання фракції фолату-Fab’, зв'язаного з ліпосомами, слідові кількості йодованого F(ab')2 додали до початку реакції з DTT (білок йодували, застосовуючи IodoGen згідно зі стандартними процедурами). Кон'югація споряджених антитіл з ліпосомами Натрієву сіль DSPE-PEG2000-MPB (Northern Lipids, VA, Canada) включили до 5%, молярних, від усього фосфоліпіду. Ліпосоми були інакше утвореними та їх також виготовили для етапу опосередкованого іонофорами катіонного введення таким саме способом, як описано для не-ПЕГлікованих ліпосом. Після того, як температура реакційної суміші після етапу навантаження досягла кімнатної температури, ліпосомну суспензію дезоксигенували до додавання фолату-Fab' для одержання концентрації білка 0,30,5мг/мл. Ліпідна концентрація становила 1-3мМ, що визначили шляхом фосфорного аналізу за Barlett (Barlett, 1958). Фолат-Fab' та ліпосоми залишили реагувати протягом 2 годин при кімнатній температурі. Реакційну суміш потім нанесли, застосовуючи колонку PD-10, урівноважену PBS. Кон'юговані з фолат-Fab’ ПЕГ-ліпосоми зберігали при 4°С протягом 12-15 годин до початку застосування в аналізах зв'язування фолату-рецептора. Зв'язану з ліпосомами радіоактивність вимірювали детектором з лунками з Nal, що коректує перебільшення у відповідних каналах, з двічі споряджених зразків. Зразки з єдиним нуклідом та суміші нуклідів застосовували як контрольні. Завдяки вимірюванням радіоактивності концентрацію білка перетворили у кількість Fab’ на ліпосому, припускаючи розмір ліпосом становив 100нМ та 8-104 фосфоліпідів/пухирців (Kirpotin та інші, 1997), та молекулярна вага Fab'-антитіла мієломи становила 52000. Зв'язану з клітинами радіоактивність вимірювали із застосуванням Nal-детектора (концентрації у три рази більші для Y-90) та рідинного сцинтиляційного рахування після додавання Insta-Gel plus (Таблиця 3). Таблиця 3 Зв'язування 90У-ліпосом, кон'югованих з антитілами з або без фолату, з клітинами OVCAR Додані ліпосоми/клітини 1*105 1*104 1*103 1*102 10 % зв'язаних з клітинами ліпосом без фолату