Спосіб індукції гепатоцелюлярної реорганізації в нащадків експериментальних тварин за умов пренатального програмування

Реферат: Спосіб індукції гепатоцелюлярної реорганізації в експериментальних тварин включає відтворення метаболічного стресу із застосуванням гепатотропної дієти. У гестаційних самиць комбінують соціально-емоційний і метаболічний стрес, при цьому як метаболічний стрес застосовують гепатотропну дієту з 45 % ккал вмістом жирів і 30 % водний розчин сахарози. UA 81947 U (54) СПОСІБ ІНДУКЦІЇ ГЕПАТОЦЕЛЮЛЯРНОЇ РЕОРГАНІЗАЦІЇ В НАЩАДКІВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ТВАРИН ЗА УМОВ ПРЕНАТАЛЬНОГО ПРОГРАМУВАННЯ UA 81947 U UA 81947 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується медицини, зокрема фізіології печінки і експериментальної гепатології, та може бути використана в гастроентерологічних доклінічних чи трансляційних дослідженнях шляхом моделювання гепатоцелюлярної реорганізації, яка співвідносна з такою, що виникає при метаболічних порушеннях печінки, зокрема при неалкогольній жировій хворобі печінки. Клінічні спостереження наукових груп [1] встановили етіопатогенетичні механізми, клінічні особливості перебігу, поширеність та лікувальну тактику при метаболічних порушеннях печінки. Проте, вони є недостатніми для вивчення факторів ризику розвитку патології печінки, донозологічних особливостей формування метаболічних порушень печінки, порушення гепатоцелюлярної резистентності тощо, підтверджуючи потребу у фундаментальних дослідженнях факторів ризику дисфункцій печінки, що можуть ініціювати неалкогольну жирову хворобу печінки. На сьогодні відомо, що вплив негативних чинників у пренатальному періоді призводить до формування в дорослому житті пренатально диспрограмованих гормонапатій, які є основою теорії "ембріонального походження хронічних хвороб дорослого віку", і, відповідно до неї, хвороби, що маніфестують у дорослих зумовлені глюкокортикоїдним імпринтингом геному фетальних клітин [2]. Інтенсивні дослідження проблеми ожиріння у вагітних засвідчили, що у жінок із центральним типом ожиріння спостерігається накопичення жирних кислот в плаценті, де, окрім стеатозу, виявляється також макрофагальна інфільтрація та ознаки хронічного запалення, наслідками яких є ліпотоксичний вплив на функціональну систему "материнський організм - плацента - плід" [3]. Також клінічні спостереження засвідчують, що висококалорійна дієта викликає у вагітних хронічну ендотоксемію і ендотеліальну дисфункцію. Сукупність цих факторів може відігравати ключову роль в програмуванні у нащадків змін метаболічного статусу і/або схильності до метаболічних порушень в дорослому віці. Сьогодні доведено, що печінка це орган-мішень, який бере активну участь у процесах розвитку і прогресуванні метаболічних порушень та маніфестує, так званою, неалкогольною жировою хворобою печінки [4], яка призводить до розвитку цирозу печінки і в окремих випадках - до формування гепатоцелюлярної карциноми [5]. Останні клінічні спостереження за особами з неалкогольною жировою хворобою печінки свідчать про патогенетичний механізм, що складається з "двох ударів": першим ударом є розвиток жирової дистрофії печінки, другим - стеатогепатит. При ожирінні, особливо вісцеральному, збільшується надходження в печінку вільних жирних кислот і розвивається стеатоз печінки, що розглядається як "перший удар". За умов інсулінорезистентності збільшується ліполіз у жировій тканині, надлишок вільних жирних кислот надходить у печінку, в результаті - кількість жирних кислот у цитоплазмі гепатоцитів різко зростає, формується жирова дистрофія гепатоцитів. Паралельно розвивається окисний стрес - своєрідний "другий удар" з формуванням запальної реакції і розвитком стеатогепатиту [6]. Відоме використання 50 % олійного розчину тетрахлоретану для індукції токсичного гепатиту [7], внутрішньошлункове введення етанолу для індукції алкогольного гепатиту [8], модель дексаметазонового токсичного гепатиту [9] та моделі з висококалорійним харчуванням з підвищеною дозозалежною часткою жирів на тлі генетично детермінованої недостатності лептину [10] і без неї [11] у генетично модифікованих тварин. До основних недоліків відомих способів належать: відсутність можливості вивчення причин метаболічних порушень печінки для визначення факторів ризику та донозологічних станів, можливі ускладнення через складність оперативної техніки, тривалість післяопераційного періоду і самого експерименту, високий кошт генетично модифікованих тварин, кормів і обладнання, залученого в дослідження тощо. Найближчим аналогом є спосіб моделювання неалкогольного стеатогепатиту у щурів шляхом гепатотропної дієти з підвищеним вмістом жирів та холестерину [12]. Недоліком його є індукція пошкоджень печінки, що є аналогом розвитку та прогресування метаболічного ураження печінки в аспекті неалкогольної жирової хвороби печінки. За цим способом неможливо визначити передумови та фактори ризику, що викликають зміни гепатоцелюлярної резистентності до метаболічного навантаження. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб пренатальної індукції гепатоцелюлярної реорганізації у нащадків, що за структурно-функціональними характеристиками буде співвідносний до функціонально-метаболічних порушень печінки, які започатковують неалкогольну жирову хворобу печінки. Поставлене завдання вирішується тим, що у способі індукції гепатоцелюлярної реорганізації в експериментальних тварин, який включає відтворення метаболічного стресу із застосуванням гепатотропної дієти, згідно з корисною моделлю, у гестаційних самиць комбінують соціальноемоційний і метаболічний стрес, при цьому як метаболічний стрес застосовують гепатотропну дієту з 45 % ккал вмістом жирів і 30 % водний розчин сахарози. 1 UA 81947 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У запропонованій корисній моделі індукція гепатоцелюлярної реорганізації відбувається шляхом зниження стрес-резистентності печінки за рахунок її експериментального пошкодження у нащадків, матері яких зазнали стресування у гестаційний період шляхом відтворення соціально-емоційного і метаболічного стресів. Як метаболічний стрес використовують гепатотропну дієту з 45 % ккал вмістом жирів і 30 % водний розчин сахарози. Запропоновано ефективний спосіб пренатальної індукції гепатоцелюлярної реорганізації в експерименті, при застосуванні якого провідне місце належить чинникам і процесам, що відіграють першорядну роль у виникненні прозапальних змін у печінці та зниженні гепатоцелюлярної резистентності. Вивчення факторів ризику дисфункцій печінки та її резистентності за впливу екстремальних чинників проводять на моделі, що реалізує механізми пренатального програмування та змін реактивності печінки як факторів ризику та передумов розвитку метаболічних порушень печінки. Запропонований спосіб здійснюють таким чином. Для відтворення в експериментальних тварин (щурів) ознак, релевантних клінічним, що формуються при метаболічних порушеннях печінки, зокрема як передумова для неалкогольної жирової хвороби печінки, у гестаційних самиць використовують комбінацію соціальноемоційного і метаболічного стресу із підвищеним нутрієнтним складом жирів і вуглеводів шляхом відтворення соціально-емоційного стресу за Pratt N.C., 1989 і метаболічного стресу висококалорійною гепатотропною дієтою з 45 % ккал вмістом жирів (за A. Lintermans, 2009) і 30 % водним розчином сахарози для пиття (за В.В. Козаром, 2009). Проведені експериментальні дослідження ілюструються мікрофотографіями, препарати фарбовано гематоксиліном та еозином (ГЕ), при збільшенні х200: на Фіг. 1 представлена паренхіма печінки щурів контрольної групи; на Фіг. 2. - мікроциркуляторне русло печінки щурів контрольної групи; на Фіг. 3 - паренхіматозні зміни, а на Фіг. 4 – судинно-стромальні зміни печінки щурів із пренатальним стресом в анамнезі, що включав соціально-емоційний стрес (СЕС) та метаболічний стрес (МС) з домінуванням вуглеводів, а на Фіг. 5 і Фіг. 6 - відповідно паренхіматозні і стромально-судинні зміни печінки щурів із пренатальним стресом в анамнезі з СЕС та МС з домінуванням жирів; на Фіг. 7 представлено паренхіматозні зміни печінки, що візуалізувались у тварин із пренатальним стресом в анамнезі, що включав соціально-емоційний стрес та метаболічний стрес за рахунок комбінації жирів і вуглеводів; на Фіг. 8 - стромальносудинні зміни печінки щурів із пренатальним стресом в анамнезі з СЕС та МС за рахунок комбінації жирів і вуглеводів. Серійні модельні експериментальні дослідження проведено відповідно до положень та дозволу університетського комітету з біоетики (№ 4 від 11.04.2011 р.) та Міжнародних принципів "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментів та в інших наукових цілях" (Страсбург, 1986) які утримувались згідно з правилами "належної лабораторної практики" (GLP). В експеримент залучено білих нелінійних щурів самців (n=92, m=211±24 г) групи контролю (інтактні, 1 група) і нащадків матерів, яким під час вагітності індукували "соціально-емоційний" стрес за Pratt N.C. and all, 1989 і метаболічний стрес за такими моделями висококалорійного харчування: 2 група - з домінуванням вуглеводів за В.В. Козаром та ін., 2009; 3 група - з домінуванням жирів за A. Lintermans, 2009; 4 група - за умов бінарної дії означених екстремальних чинників. Для оцінки гепатоцелюлярної стрес-резистентності 3-місячним щурам (нащадкам) індукували неерозивні пошкодження печінки за широковживаною моделлю водноіммобілізаційного стресу (ВІС) за Takagi, 1964 та застосовували моделювання природньої цитопротекції завчасним введенням неселективного блокатора циклооксигенази (ЦОГ) І та II індометацину ("Фармацевтична компанія "Здоров'я", м. Харків, Україна), розділяючи кожну групу тварин на підгрупи: підгрупа А - інтактні; підгрупа В - ВІС з введенням плацебо (1,0 мл 0,9 % розчину NaCl) внутрішньочеревно; підгрупа С - комбінація ВІС з одноразовим внутрішньочеревним введенням індометацину у дозі 5 мг/кг, попередньо застосовуючи 24годинну харчову депривацію з необмеженим доступом до води. Для гістоморфологічного дослідження тканина печінки фіксувалась у 10 % забуференому розчині формаліну, після чого підлягала рутинній обробці із введенням матеріалу у парафін та виготовленням зрізів товщиною 4-5 мкм. Основні гістологічні зміни досліджували при забарвленні гематоксилін-еозином. Для достовірної оцінки виявлених гістоморфологічних змін печінки розроблено візуально-аналогові напівкількісні шкали з ранжуванням від 0 до 3 балів. Візуально-аналогова шкала для оцінки паренхіматозних змін: 0 - без патологічних змін; 1 паренхіматозні клітини збережені, виявляються лише окремі гепатоцити із просвітленням цитоплазми; 2 - гепатоцити з нерівномірно забарвленою цитоплазмою за рахунок відмінностей у вмісті глікогену, дискомплексація балок; 3 - виражена дискомплексація балок за рахунок 2 UA 81947 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розповсюджених мікро-макровакуольних змін гепатоцитів, поодинокі клітини з ознаками некрозу, гіперемія центральної вени. Візуально-аналогова шкала для оцінки судинно-стромальних змін: 0 - в поодиноких гепатоцитах виявлялись вакуольні зміни, нерівномірний розподіл глікогену у цитоплазмі клітин; 1 - гіперемія центральної вени та незначне розширення центролобулярних синусоїдів; 2 - виражена дилятація та гіперемія перипортальних синусоїдів; 3 - гепатоцити з просвітленням цитоплазми за рахунок нерівномірного нагромадження глікогену; нерівномірна дилятація синусоїдів; портальний тракт з помірно вираженою лейкоцитарною інфільтрацією. На основі шкал проводився розрахунок гістологічних індексів в балах: гістологічний індекс згідно із візуально-аналоговою шкалою паренхіматозних змін (ГІ ВАШПЗ) та гістологічний індекс згідно із візуально-аналоговою шкалою судинно-стромальних змін (ГІ ВАШССЗ). Відеоаналіз мікропрепаратів печінки виконано на мікроскопі Leica DM 750/4 (Німеччина) з використанням ліцензованої системи відеозапису Leica Application Suit Version 3.8 (Німеччина). Тварин виводили з експерименту під ефірним наркозом і здійснювали забір печінки для гістоморфологічного аналізу та крові - для визначення вмісту інтерлейкіну-1β і інтерлейкіну-8 у сироватці крові за допомогою твердофазного методу імуноферментного аналізу (ELISA) та відповідних діагностичних наборів ("Enzo Life Science", Великобританія). Морфологічну картину тканини печінки вивчено з використанням загальноприйнятих методів макроскопічних досліджень, світлової мікроскопії (гістологічні препарати були пофарбовані гематоксилін-еозином). При цьому виняткова увага надавалась стандартизації отриманих результатів у кількісному та якісному вигляді: у балах відносно попередньо визначеної візуально-аналогової шкали. Під час гістологічного дослідження печінки оцінювали стан клітинних елементів печінки та мікроциркуляторного русла. У підгрупах контрольної групи спостерігались незначні зміни, які відображали фонові ефекти гострого стресу (підгрупа 1В) та цитоагресивного впливу індометацину (підгрупа 1С): паренхіма печінки без ознак пошкодження, в поодиноких гепатоцитах виявлялись вакуольні зміни, нерівномірний розподіл глікогену у цитоплазмі клітин та незначна гіперемія синусоїдів. У тварин підгрупи 1А тканина печінки була звичайної гістологічної будови: гепатоцити без альтеративних змін (Фіг. 1), судинно-стромальних порушень також не виявлено (Фіг. 2). Гістологічні індекси становили 0 балів. У підгрупі 1В паренхіматозні елементи печінки не виявляли ознак пошкодження ні на тканинному, ні на клітинному рівнях. Лише у частини тварин спостерігались незначні гемодинамічні розлади у тканині печінки - нерівномірна гіперемія синусоїдів, які можуть бути пов'язані із особливостями функціональної активності органу, що було потрактовано як ГІ ВАШПЗ - 0 балів, ГІ ВАШССЗ - 1 бал. У підгрупі 1С в тканині печінки виявлялись ознаки пошкодження незначного ступеня вираженості: поодинокі гепатоцити з вакуольними змінами, нерівномірний розподіл глікогену у цитоплазмі клітин, в більшості препаратів виявлялась нерівномірна гіперемія синусоїдів: ГІ ВАШПЗ - 1 бал, ГІ ВАШССЗ - 1,5 бали. У другій групі переважали морфологічні зміни помірного ступеня вираженості: паренхіматозні клітини збережені, виявлялися лише окремі гепатоцити із просвітленням цитоплазми (Фіг. 3), візуалізувалася гіперемія центральної вени та незначне розширення центролобулярних синусоїдів (Фіг. 4). У підгрупах 2А та 2В балково-часточкова структура печінки незначно змінена за рахунок порушення обміну тканинної рідини та нерівномірно виражених дистрофічних змін гепатоцитів - мікровакуольні зміни цитоплазми, помірно виражені нагромадження глікогену, нерівномірно розподілені у різних відділах часточки. ГІ ВАШПЗ підгрупи 2А становили 1,5 бали, ГІ ВАШССЗ - 1 бал; ГІ ВАШПЗ підгрупи 2В становили 1,5 бали, а ГІ ВАШССЗ - 2 бали. У підгрупі 2С зміни були більш вираженими. У паренхімі виявлялись множинні ділянки з макро- та мікровезикулярними змінами, нагромадженням глікогену у ядрах та цитоплазмі гепатоцитів, окремі клітини з ознаками некрозу. Спостерігалась часткова дискомплексація балок за рахунок нагромадження тканинної рідини у просторах Діссе та вогнищевих скупчень еритроцитів. Синусоїди нерівномірно розширені. У портальних трактах виявлялись набряк та вогнищеві лейкоцитарні інфільтрати. ГІ ВАШПЗ становили 2,5 бали, ГІ ВАШССЗ - 2 бали. У третій групі переважали морфологічні зміни незначного ступеня вираженості: гепатоцити з нерівномірно забарвленою цитоплазмою за рахунок відмінностей у вмісті глікогену, дискомплексація балок (Фіг. 5), виражена дилятація та гіперемія перипортальних синусоїдів (Фіг. 6). У підгрупі 3А не виявлено виразних альтеративних змін, спостерігався незначний поліморфізм гепатоцитів. ГІ ВАШПЗ становили 0,5 балів, ГІ ВАШССЗ - 0 балів. У підгрупі 3В відбулися паренхіматозні зміни, подібні до підгрупи 3А, а також нерівномірна гіперемія центральних вен і прилеглих центролобулярних відділів синусоїдів. ГІ ВАШПЗ становили 0,5 бали, ГІ ВАШССЗ - 1 бал. У підгрупі 3С у більшості тварин балково-часточкова структура 3 UA 81947 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 печінки була збережена. Місцями в гепатоцитах спостерігалось нерівномірне нагромадження глікогену та поодинокі клітини з великими цитоплазматичними вакуолями. ГІ ВАШПЗ становили 1 бал. Судинно-стромальні зміни теж обмежувались проявами гіперемії центральної вени та незначно дилятованих синусоїдів. Лише у 25 % тварин виявлялись незначні інфільтрати в окремих портальних трактах. ГІ ВАШССЗ становили 1,5 бали. Для четвертої групи була характерна найбільш виражена гепатоцелюлярна реорганізація. У всіх трьох її підгрупах виявлялись ознаки пошкодження гепатоцитів та гемодинамічних розладів у мікроциркуляторному руслі: виражена дискомплексація балок за рахунок розповсюджених мікро-макровакуольних змін гепатоцитів з поодинокими клітинами з ознаками некрозу (Фіг. 7), візуалізувалася гіперемія центральної вени, гепатоцити з просвітленням цитоплазми за рахунок нерівномірного нагромадження глікогену, виявлялася нерівномірна дилятація синусоїдів, портальний тракт з помірно вираженою лейкоцитарною інфільтрацією (Фіг. 8). У підгрупі 4А виявлялись зміни незначного та помірного ступеня. Балково-часточкова структура переважно збережена. Гепатоцити з ознаками незначно вираженого пошкодження: у поодиноких гепатоцитах спостерігались мікро-макровакуольні зміни, у більшості - нерівномірне нагромадження глікогену та дискомплексація балок. П ВАШПЗ становили 1,5 бали. Ознаки набряку інтерстицію були переважно у центролобулярних відділах часточок, скупчення лейкоцитів визначались лише в частині портальних трактів. Спостерігалась нерівномірно виражена гіперемія та дилятація синусоїдів. П ВАШССЗ становили 2 бали. У підгрупах 4В переважали зміни помірного ступеня. Балково-часточкова структура в більшої частини тварин збережена. Гепатоцити з ознаками помірного вираженого пошкодження: у поодиноких гепатоцитах спостерігались мікро-макровакуольні зміни, у більшості - нерівномірне нагромадженя глікогену та дискомплексація балок. ГІ ВАШПЗ становили 2 бали. Ознаки набряку інтерстицію у центролобулярних відділах часточок, скупчення лейкоцитів визначались в більшості портальних трактів. Спостерігалась нерівномірно виражена гіперемія та дилятація синусоїдів. ГІ ВАШССЗ становили 2,5 бали. У підгрупі 4С ураження були значними. Балковочасточкова структура порушена за рахунок альтерації паренхіматозних елементів та виражених гемодинамічних змін. У багатьох гепатоцитах містилися інтрацитоплазматичні вакуолі великого розміру, в деяких клітинах виявлялася "піниста цитоплазма" та ознаки апоптозу. ГІ ВАШПЗ становили 3 бали. Нерівномірно виражений набряк просторів Діссе та дилятація гіперемованих синусоїдів зумовили дискомплексацію балок гепатоцитів. Портальні тракти нерівномірно розширені за рахунок набряку та скупчення клітин запального інфільтрату. ГІВАШССЗ становили 2,5 бали. Серед чинників, що визначають резистентність епітеліального бар'єру печінки, належать численні хемокіни, відповідальні за пластичну відбудову та фізіологічну регенерацію, ангіогенез тощо, які, воєдино з іншими неспецифічними факторами, формують захисні властивості печінки. Важливими біомаркерами запальних реакцій є інтерлейкіни ІЛ-ір і ІЛ-8 [13]. У групі контролю підгрупі 1А концентрація ІЛ-1β у сироватці крові склала 28,29±2,06 пг/мл, ІЛ-8-321±2,85 пг/мл, що потрактовано нами як вихідний базальний рівень, що відповідав "умовній нормі" (100 %). Абсолютні значення рівнів цитокінів у підгрупах експериментальних тварин із пренатальним стресом в анамнезі та стресованими постнатально представлені у таблиці та віддзеркалюють наступну тенденцію - у щурів з пренатальним стресом в анамнезі рівні досліджуваних цитокінів збільшились у порівнянні з контрольною групою, так у 2А підгрупі: ІЛ8 - на 56 %, ІЛ1β - на 100 % (р