Захист домінантним негативним мутантним krp-білком інгібування активного циклін-cdk-комплексу krp-білком дикого типу

Реферат: Винахід належить до ізольованих мутантних поліпептів-інгібіторів рослинних циклін-залежних кіназ (CKI), які містять амінокислотну послідовність CKI, яка має принаймні одну модифікацію відносно рослинного CКI-поліпептиду дикого типу, причому зазначений CКI-поліпептид дикого типу містить ділянку зв’язування з цикліном, яка надає афінність зв’язування з цикліном та ділянку зв’язування з циклін-залежної кіназою (CDK), яка надає афінність зв’язування з CDK, причому зазначена принаймні одна модифікація знаходиться в межах ділянки зв’язування CDK а мутантний СКІ-поліпептид може конкурувати із зазначеним СКІ дикого типу за зв’язування з UA 97787 C2 (12) UA 97787 C2 комплексом циклін/CDK і не інгібує активність кінази CDK. Зазначені мутантні білки використовуються для модулювання цитокінезу в клітинах і, зокрема, в рослинних клітинах. UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Дана заявка претендує на пріоритет заявки на патент США № 60/703,999, поданої 29 липня 2005 р. і включеної тут в усій її повноті шляхом посилання. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Основний клітинний цикл у рослин є таким самим, що й у еукаріотів. Отже, не дивно, що рослини, так само, як і еукаріоти, мають кінази, що звуться циклін-залежними (CDK: cyclin dependent kinases) і регулюють переходи між різними фазами клітинного циклу. Arabidopsis, рослинна модель, що використовується для вивчення клітинного циклу, має декілька CDKпідгруп. Серед них підгрупа CDKA є найбільш подібною підгрупі cdc2 (CDK1) у ссавців і містить висококонсервативну амінокислотну послідовність Pro Ser Thr Ala ІІe Arg Glu (PSTAIRE) (SEQ ID NO:1) на ділянці, що опосередковує взаємодію з їхнім цикліновим партнером. Arabidopsis також має специфічну рослинну групу CDK, що зветься CDKB і у вищих тварин є неконсервативною. Але в рослин немає такого, як у ссавців, аналога кіназ G1 CDK-CDK4 і CDK6. На роль G1 CDK (що активується рослинними циклінами D-типу) пропонувалася CDKA кіназа, у той час як CDKB продемонструвала свою переважну експресію на S-фазі і пізніше і, отже, може бути ідентифікована як Gz/M-специфічна CDK. Активація/інактивація цих CDK-кіназ проводить клітини через клітинний цикл і, отже, вказує їм на те, коли вони повинні із цього циклу вийти. Arabidopsis містить до 49 циклінів, згрупованих у 10 підкласів (Wang et al., Plant Physiol 135:1084-1099, 2004). На свою участь у клітинному циклі вказують лише класи A, B і D, що активують CDK-кінази (Wang et al., Plant Physiol. 135:10841099, 2004). При цьому CDKA активується циклінами D-типу, а CDKB активується циклінами A- і B-типу. У тварин CDK-кінази негативно регулюються двома сімействами інгібіторів CDK (CKI). Одне з них асоціюється з інгібуванням CDK4-кінази (INK4) і складається із 4 членів (p15, р16, p18 і p19), які зв’язуються з G1 CDK-кіназами, тобто з CDK4 і CDK6, та інгібують їхнє зв’язування з цикліном. До іншої групи належать так звані білкові інгібітори кіназ (KІP: Kinase Inhibitor Proteins) або CIP-білки (CDK Interacting Proteins: білки, що взаємодіють з CDK), які в усіх тварин є висококонсервативними. Сімейство CIP/KIP інгібує, головним чином, циклін-A- і E-CDK2-кіназну активність. У рослин були ідентифіковані передбачувані CKI-інгібітори (Wang et al., Nature 386:451-452,1997; Wang et al., Plant J. 15:501-510,1998; De Veylder et al., Plant Cell 13:1653-1667, 2001; Jasinski et al., Plant Physiol 130:1871-1882, 2002), які продемонстрували здатність інгібувати очищений циклін/CDK-кіназну активність in vitro (Wang et al., 1997, supra; Wang et al., Plant J. 24:613-623, 2000; Lui et al., Plant J. 21:379-385, 2000). Експресія рослинних CKI-інгібіторів показала зниження росту з меншими органами, що містять крупніші клітини (Wang et al., 2000, supra; Jasinski et al., J. Cell Sci. 115:973-982,2001; De Veylder et al., supra; Zhou et al., Plant Cell Rep. 20:967-975, 2002; Zhou et al., Plant J. 35:476-489, 2003; Schnittger et al., Plant Cell 15:303315,2003). В Arabidopsis ці CKI-інгібітори звуться інгібіторами CDK-кіназ (ICK: Inhibitors of CDK) або білками, спорідненими з KIP (KRP: KIP related proteins). Було ідентифіковано сім членів ICK сімейства, які є найближчими до CIP/KIP сімейства CKI-інгібіторів. Усі ці члени ICK/KRPKIP1 сімейства мають високу ідентичність своїх амінокислотних послідовностей з p27 , але ця ідентичність обмежується найбільш C-кінцевими 30 амінокислотами. На сьогоднішній день у жодній рослині не було ідентифіковано INK-споріднених CKI-інгібіторів. Надекспресія циклінів або нокаути CKI-інгібіторів показують, що добре збалансований механізм клітинного циклу у ссавців може бути легко порушений. Цей розбаланс кінець кінцем може призводити до прискорення клітинних циклів, збільшення розмірів тварин і/або до розвитку пухлин. Зниження або повне виключення CKI-інгібіторної "активності" дозволяє підвищувати циклін/CDK кіназну активність. У результаті такого підвищення активності відбувається фосфорилювання подальших у цьому процесі мішеней, потрібних для розвитку клітинного циклу, і у тварин кінець кінцем виникає гіперпроліферація клітин (Coats et al., Science КР1 272:877-880,1996). Делеція гена р27 у мишей викликає збільшення розмірів тварин внаслідок надмірної циклін/cdk активності, що призводить до надмірної проліферації клітин (Fero et al., Cell 85:733-744,1996; Kiyokawa et al., Cell 85:721-732,1996; Nakayama et al., Cell 85:707720,1996). Існують механізми пригнічення експресії різноманітних членів KRP сімейства. Посттранскрипційне мовчання генів (PTGS: post-transcriptional gene silencing) у рослинах є механізмом деградації РНК, подібним інтерференції РНК (РНКi) у тварин. У результаті інтерференції РНК відбувається специфічна деградація двониткових РНК (днРНК) на короткі 2123 п.н. фрагменти днРНК, котрі в кінцевому рахунку відіграють певну роль у деградації популяції гомологічних РНК. В рослинах у механізмі транскрипційного мовчання генів використовується стратегія інвертованих повторів (IR: inverted repeats) для пригнічення експресії генів у багатьох 1 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 видах рослин, включаючи, наприклад, такі культури, як кукурудза, соя і рапсове насіння. Але IRтехнологія має такі недоліки, як ефективність послідовності IR, регуляція нецільових генів (Jackson et al., Nature Biotech. 21:635-637,2003), перехідне мовчання, загальна стабільність IR тощо. У випадку, що розглядається, ці недоліки ускладнюються ще й необхідністю мовчання одразу більше одного генів. Головною рушійною силою для підвищення врожаїв протягом останніх 75 років було звичайне розведення рослин (J. Fernandez-Cornejo, Agriculture Information Bulletin No. (AIB786) 81 pp, February 2004). Останнім часом доступними стали трансгенні культури, які, наприклад, є стійкими до комах-шкідників і гербіцидів. Проте, ці трансгенні культури несуть з собою проблему зниження врожайності (Elmore et al., Agron. J. 93:408-412,2001; Elmore et al., Agron. J. 93:404407,2001). На сьогоднішній день не є відомими продажні трансгенні культури, які б мали збільшених розмірів насіння або підвищену врожайність. Таким чином, у даній галузі існує потреба в поліпшені таких процесів модифікації певних товарних сільськогосподарських культур, як, наприклад, підвищення врожайності, збільшення розмірів насіння, підвищення швидкості проростання, збільшення кореневої маси тощо. Задовольнити цій потребі, як описано нижче, дозволяє даний винахід. СУТЬ ВИНАХОДУ Даним винаходом пропонується варіантний поліпептид-інгібітор рослинних циклін-залежних кіназ (CKI), який має принаймні одну модифікацію, споріднену з CKI-поліпептидом дикого типу. У деяких варіантах здійснення винаходу це є модифікація (або модифікації) на ділянці зв’язування з CDK. Таким чином, вона надає модифіковану відносно CKI-білка дикого типу афінність зв’язування з CDK-білком, практично повністю зберігаючи при цьому афінність зв’язування з цикліновим білком. Варіантні CKI-поліпептиди згідно з винаходом мають домінантну негативну антагоністичну активність проти функції CKI дикого типу. Якщо даний варіант експресований у клітині, що експресує відповідний CKI-білок дикого типу, або в клітині, що експресує CKI дикого типу, який є гетерологічним відповідному білку дикого типу, але має практично еквівалентну функцію дикого типу по відношенню, поряд з іншим, до зв’язування з цикліном і CDK, то біологічна CKI-активність дикого типу інгібується, призводячи до прискорення розвитку клітинного циклу і збільшення проліферації клітин. Винаходом пропонується також рекомбінантна нуклеїнова кислота, що кодує варіантний CKI-поліпептид, або вектор, який містить таку рекомбінантну нуклеїнову кислоту. Нуклеїнова кислота або вектор, що кодують варіантний CKI-поліпептид, можуть уводитися в клітину-хазяїн для ампліфікації або експресії цієї нуклеїнової кислоти. Клітини-хазяїни можуть використовуватися, наприклад, у процесах згідно з винаходом для виробляння варіантних CKIполіпептидів. Крім того, експресія варіантного CKI-поліпептиду в клітині може використовуватися у процесах згідно з винаходом для модулювання поділу клітин. Наприклад, експресія варіантного CKI-поліпептиду в клітині може вести до прискорення розвитку клітинного циклу та збільшення проліферації клітин. Крім того, винаходом пропонується трансгенна рослина, яка містить трансген, що кодує варіантний CKI-поліпептид. Експресія варіантного CKI-поліпептиду в трансгенних рослинах може використовуватися у процесах згідно з винаходом, наприклад, для підвищення потужності рослин, збільшення кореневої маси, збільшення розмірів рослин, підвищення раннього проростання тощо. ВИЗНАЧЕННЯ ТЕРМІНІВ За винятком деяких специфічних термінів, котрі одержують тут спеціальні визначення, вся інша використовувана в даному описі науково-технічна термінологія є загальноприйнятою фахівцями галузі, до якої належить даний винахід. Слід зауважити також, що в тексті даного опису розглядаються лише типові процеси та матеріали, підходящі для реалізації даного винаходу та пов’язаних з ним випробувань на практиці. Цілком зрозуміло, що вони жодним чином не обмежують можливостей застосування будь-яких інших процесів та матеріалів, аналогічним згадуваним у даному описі. Нижче з метою уникнення різночитання викладеного тут матеріалу дані загальні зауваження та спеціальні визначення деяких специфічних термінів для цілей даного винаходу. Якщо із контексту явно не випливає іншого, то підмети, вказані в однині, слід сприймати також як такі, що не виключають їхні значення в множині. Використовуваний у даному описі термін "інгібітор циклін-залежної кінази" (який зветься тут також "інгібітором CDK" або "CKI") означає приналежність відповідного матеріалу до класу білків, які негативно регулюють циклін-залежні кінази (CDK кінази). CKI інгібіторами, що охоплюються сферою застосування даного винаходу, є інгібітори, які мають відокремлені поліпептидні ділянки, здатні незалежно зв’язувати циклін і CDK. До числа таких CKI інгібіторів 2 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 входять, наприклад, ідентифіковані сімейства рослинних CKI інгібіторів (сім ідентифікованих CKI інгібіторів виду Arabidopsis), котрі мають гомологію з білковими інгібіторами кіназ (KIP) у тварин і звуться тут KIP-спорідненими білками (KRP) (відомими також як інгібітори "CDK-кіназ" або "ICK"). Використовувані тут як взаємозамінні терміни "поліпептид" і "білок" означають полімер амінокислотних залишків. Термін "нуклеїнова кислота" охоплює своїм значенням дезоксирибонуклеотиди, рибонуклеотиди та їхні полімери як в одноланцюговій так і в дволанцюговій формі. За винятком спеціальних обмежень, цей термін охоплює своїм значенням нуклеїнові кислоти, які містять відомі аналоги природних нуклеотидів, котрі мають такі самі властивості зв’язування, що й базова нуклеїнова кислота, і піддаються метаболічним перетворенням шляхом, подібним тому, що проходять нуклеотиди природного походження. Якщо не зазначено іншого, то конкретна нуклеїнокислотна послідовність повністю охоплює також її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміщення виродженого кодону). Зокрема, заміщення виродженого кодону можуть здійснюватися шляхом генерування послідовностей, в котрих третє положення одного чи більше вибраних (або всіх) кодонів є заміщеним змішано-основними і/або дезоксиінозиновими залишками, див., наприклад, (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608,1985; Rossolini et al., Mol, Cell Probes 8:91-98,1994). Термін нуклеїнова кислота використовується тут у взаємозамінному значенні з термінами ген, кДНК і мРНК, кодована геном. Термін "природного походження" в контексті застосування до CKI-поліпептидів і нуклеїнових кислот, означає поліпептид або нуклеїнову кислоту, що має амінокислотну або нуклеотидну послідовність, виявлену в природі, тобто амінокислотну або нуклеотидну послідовність, котра може бути відокремлена від природного джерела (організму) і котра не була навмисно модифікована людиною. У контексті даного опису лабораторні штами рослин, які можливо раніше піддавалися селекції за допомогою методів класичної генетики, вважаються рослинами природного походження. Використовувані тут терміни "CKI ген дикого типу" і "CKI нуклеїнова кислота дикого типу" означають послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає генетичному локусу CKI в геномі організму, яка кодує генний продукт, що виконує нормальну функцію CKI-білка, кодованого нуклеотидною послідовністю природного походження, що відповідає даному генетичному локусу. Генетичний локус може мати більше однієї послідовності або одного алеля у популяції індивідуумів, а ознакою "дикого типу" охоплюються всі такі алелі природного походження, що кодують генний продукт, який виконує нормальну функцію. Ознакою "дикого типу" охоплюються також послідовності генів, які не обов’язково є природного походження, але які є здатними кодувати генний продукт з нормальною функцією (наприклад, гени, які мають мутації, що мовчать, або гени, які кодують білки з консервативними заміщеннями). Термін "CKI-поліпептид дикого типу" або "CKI-білок дикого типу" означає CKI-поліпептид, що кодується геном дикого типу. Генетичний локус може мати більше однієї послідовності або одного алеля в популяції індивідуумів, і терміном "дикого типу" охоплюються всі такі алелі природного походження, що кодують генний продукт, який виконує нормальну функцію. Термін "мутантний" або "варіантний" у контексті застосування до CKI-поліпептидів і нуклеїнових кислот згідно з винаходом означає поліпептид або нуклеїнову кислоту, що є модифікованими відносно відповідного поліпептиду або відповідної нуклеїнової кислоти дикого типу. Термін "базовий CKI-поліпептид" використовується в даному описі в цілях визначення того чи іншого CKI-поліпептиду як мутантного або варіантного; цей термін означає CKI-поліпептид з яким даний мутантний CKI-поліпептид порівнюється з метою визначення модифікацій в його амінокислотній послідовності. Таким чином, мутантний CKI-поліпептид, "який містить амінокислотну послідовність CKI, що має принаймні одну модифікацію відносно базового CKIполіпептиду", означає, що, за винятком однієї чи більше амінокислотних модифікацій, мутантний CKI-поліпептид в усьому іншому має амінокислотну послідовність базового поліпептиду. При здійсненні даного винаходу згідно з даним описом базові CKI-поліпептиди є наперед визначеними. Базовим CKI-поліпептидом може бути, наприклад, CKI-поліпептид дикого типу і/або природного походження або CKI-поліпептид, який був навмисне модифікований. Термін "модифіковане зв’язування" або "змінене зв’язування" застосовується до мутантного CKI-поліпептиду, що кодується геном дикого типу, базовий CKI-поліпептид якого зв’язується з циклін/CDK-комплексом. Термін "модифіковане зв’язування" або "змінене зв’язування" в даному описі застосовується до зв’язування мутантного CKI з циклін/CDK-кіназним комплексом. Термін "модифіковане зв’язування" або "змінене зв’язування" означає відносне зв’язування мутантного 3 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 CKI-поліпептиду у порівнянні з базовим CKI-поліпептидом. Термін "модифіковане зв’язування" або "змінене зв’язування" може застосовуватися до мутантного CKI-поліпептиду, який має таке саме зв’язування, зменшене зв’язування або еквівалентне зв’язування з циклін/CDKкомплексом порівняно з базовим CKI-поліпептидом. Термін "рекомбінантний" у контексті даного опису застосовується як ознака амінокислотної послідовності або нуклеотидної послідовності, яка була навмисне модифікована за допомогою рекомбінантних методів. Термін "рекомбінантна нуклеїнова кислота" у контексті даного опису означає нуклеїнову кислоту, яка у загальному випадку спочатку була створена в умовах in vitro шляхом обробки певної нуклеїнової кислоти ендонуклеазами і має форму, котрої у нормальних у мовах у природі не існує. Таким чином, як відокремлена мутантна або варіантна CKI нуклеїнова кислота в лінійній формі, так і вектор експресії, створений in vitro шляхом лігування молекул ДНК, які в нормальних умовах не об’єднуються, в контексті даного винаходу вважаються рекомбінантними. Цілком зрозуміло, що рекомбінантна нуклеїнова кислота, виготовлена штучно і введена в клітину-хазяїн або в організм, буде відтворюватися нерекомбінантним шляхом, тобто за допомогою клітинного апарату in vivo клітини-хазяїна, а не шляхом in vitro маніпуляцій. Проте такі нуклеїнові кислоти, коли вони були створені рекомбінантним шляхом, хоча й в наступному відтворювалися нерекомбінантно, все одно в контексті даного винаходу вважаються рекомбінантними. "Рекомбінантним білком" є білок, одержаний за допомогою рекомбнантних методів, тобто шляхом експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти, як окреслено вище. Рекомбінантний білок відрізняється від білка природного походження принаймні однією характеристикою. Стосовно амінокислот термін "неконсервативна" модифікація означає модифікацію, в котрій залишок дикого типу і мутантний залишок значно відрізняються один від одного принаймні однією фізичною властивістю, наприклад, гідрофобністю, зарядом, розмірами, формою тощо. Наприклад, модифікації з перетворенням полярного залишку на неполярний і навпаки, модифікації з перетворенням позитивно заряджених залишків на негативно заряджені і навпаки, модифікації з перетворенням великих залишків на малі і навпаки - всі є неконсервативними. Так, заміщення можуть давати більш значні зміни в таких властивостях: структурі поліпептидного остову в зоні змін, наприклад альфа-спіральна або бета-листова структура; заряді або гідрофобності молекули в сайті-мішені; об’ємі бічного ланцюга тощо. Заміщеннями, які в загальному випадку повинні викликати найбільші зміни властивостей поліпептиду, є такі, при котрих: (a) гідрофільний залишок, наприклад серил або треоніл, заміщує (або заміщується на) гідрофобний залишок, наприклад, лейцил, ізолейцил, фенілаланіл, валіл або аланіл; (b) цистеїн абопролін заміщує (або заміщується на) будь-який інший залишок; (c) залишок, який має позитивно заряджений бічний ланцюг, наприклад лізил, аргініл або гістидил, заміщує (або заміщується на) негативно заряджений залишок, наприклад глутаміл або аспартил; або (d) залишок, який має об’ємний бічний ланцюг, наприклад фенілаланін, заміщує (або заміщується на) залишок, який не має бічного ланцюга, наприклад гліцин. Консервативними в загальному випадку є модифікації наведені нижче. Але добре відомо, що консервативними можуть вважатися також інші заміщення. Ala: Ser Arg: Lys Asn: Gln, His Asp: Glu Cys: Ser Gln: Asn Glu: Asp Gly: Pro His: Asn, Gln ІІe: Leu, Val Leu: Ile, Val Lys: Arg, Gin, Glu Met: Leu, Be Phe: Met, Leu, Tyr Ser: Thr Thr: Ser Trp: Tyr Tyr: Trp, Phe Val: Ile, Leu 4 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "домінантний негативний" у контексті білкового механізму дії або генного фенотипу означає мутантний або варіантний білок чи ген, що кодує мутантний чи варіантний білок, який практично відвертає можливість виконання функції дикого типу відповідним білком, який має цю функцію дикого типу. Використовуваний тут вираз "антагоніст CKІ інгібітора дикого типу" означає, що даний мутантний CKI-поліпептид значною мірою знижує (інгібує) здатність CKI-поліпептиду дикого типу інгібувати кіназну активність CDK/циклінових комплексів у порівнянні з інгібуванням кіназної активності CKI-поліпептидом дикого типу в умовах відсутності цього антагоніста. Нуклеїнова кислота зветься "оперативно зв’язаною", коли вона приведена у функціональне співвідношення з іншою нуклеїнокислотною послідовністю. Наприклад, промотор або енхансер є оперативно зв’язаним з кодувальною послідовністю, якщо остання впливає на транскрипцію цієї послідовності. Іншим прикладом є сайт зв’язування рибосоми, який є оперативно зв’язаним з кодувальною послідовністю, якщо він розташований таким, щоб полегшувати трансляцію. Термін "рослина" може означати як ту чи іншу рослину в цілому, так і її окремі органи (наприклад, листя, стеблини, квітки, коріння тощо), насіння, рослинні клітини (включаючи клітини тканинних культур) та їхнє потомство. Клас рослин, котрі можуть використовуватися у процесах згідно з даним винаходом, є таким самим широким, як і клас вищих рослин, придатних до сучасних методів трансформування, і включає у себе голонасінні та покритонасінні рослини, як односім’ядольні, так і двосім’ядольні, а також деякі нижчі рослини, такі як водорості. Це можуть бути також рослини різноманітних рівнів плоїдності, включаючи поліплоїди, диплоїди і гаплоїди. Так наприклад, підходящими для використання у процесах згідно з даним винаходом односім’ядольними покритонасінніми рослинами можуть бути спаржа, польова і цукрова кукурудза, ячмінь, пшениця, рис, сорго, цукрова тростина, цибуля, просо, кукурудза, овес та інші хлібні злаки. Підходящими двосім’ядольними покритонасінніми рослинами є, наприклад, томати, тютюн, бавовна, рапсове насіння, камелія, кінські боби, соєві боби, перець, салат-латук тощо. Підходящими деревними видами є, наприклад, тополя, сосна, кедр, дуб, ялина тощо. "Гетерологічною послідовністю" є послідовність, що походить від різних видів або із одного виду, але в суттєво зміненій відносно початкової формі. Наприклад, гетерологічний промотор, оперативно зв’язаний зі структурним геном, є із виду, відмінного від того, із якого цей структурний ген був виведений, або, якщо із одного й того самого виду, то в суттєво зміненій відносно початкової формі. Термін "вектор" означає частину ДНК, як правило дволанцюгової, котра може мати вставлену в неї частину чужорідної ДНК. Вектор або реплікон може мати, наприклад, плазмідне або вірусне походження. Вектори містять "реплікони", полінуклеотидні послідовності, що полегшують автономну реплікацію вектора в клітині-хазяїні. Термін "реплікон" у контексті даного опису означає також ділянку полінуклеотидної послідовності, що націлює або іншим чином полегшує рекомбінацію векторних послідовностей у хромосомі-хазяїні. Крім того, у той час як чужорідна ДНК може бути вставлена початково, наприклад, у ДНК вірусний вектор, трансформація цієї вірусної векторної ДНК у клітину-хазяїн може приводити до перетворення даної вірусної ДНК у векторну молекулу вірусної РНК. Чужорідною ДНК є гетерологічна ДНК, котра в природі є відсутньою в даній клітині-хазяїні і, наприклад, реплікує дану векторну молекулу, кодує маркер або трансген, який може піддаватися селекції та скринінгу. Даний вектор використовується для переносу чужорідної або гетерологічної ДНК у підходящу клітинухазяїн. Опинившись у клітині-хазяїні, вектор може реплікувати незалежно від хромосомної ДНКхазяїна або узгоджено з нею, і може генеруватися декілька копій даного вектора та його вставленої ДНК. В альтернативному варіанті вектор може націлювати вставляння (інсерцію) чужорідної гетерологічної ДНК у хромосому-хазяїна. Крім того, вектор може містити також необхідні елементи, які дозволяють здійснювати транскрипцію вставленої ДНК у молекулу мРНК або іншим чином викликати реплікацію вставленої ДНК у численні копії РНК. Деякі вектори експресії, крім того, містять елементи послідовності, що є сусідніми до вставленої ДНК і дозволяють здійснювати трансляцію мРНК у білкову молекулу. Таким чином можна швидко синтезувати багато молекул мРНК і поліпептиду, кодованих вставленою ДНК. Термін "трансгенний вектор" означає вектор, який містить вставлений сегмент ДНК, "трансген," що транскрибується в мРНК або реплікується як РНК у клітині-хазяїні. Термін "трансген" означає не тільки ту частину вставленої ДНК, що перетворюється на РНК, але також ті частини вектора, що є необхідними для транскрипції або реплікації РНК. Крім того, для трансгена не є обов’язковим мати полінуклеотидну послідовність, що містить відкриту рамку зчитування, здатну виробляти білок. Терміни "трансформована клітина-хазяїн", "трансформований" і "трансформація" означає введення ДНК у клітину. Така клітина зветься "клітиною-хазяїном" і може бути прокаріотичною 5 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або еукаріотичною. Типовими прокаріотичними клітинами-хазяїнами є, наприклад, різноманітні штами Е. coli. Типовими еукаріотичними клітинами-хазяїнами є рослинні клітини (наприклад, клітини рапсового насіння, сої, рису, кукурудзи тощо), дріжджові клітини, клітини комах і тваринні клітини. Введена ДНК зазвичай є у формі вектора, що містить вставлену частину ДНК. Послідовність уведеної ДНК може бути від того ж самого виду, що і клітина-хазяїн, або від виду, відмінного від клітини-хазяїна. Або ж це може бути гібридна послідовність ДНК, що містить певну чужорідну ДНК і певну ДНК, що походить із виду хазяїна. В основу „відповідності” послідовності CKI-поліпептидів і нуклеїнових кислот іншій послідовності (наприклад, ділянок, фрагментів, положень нуклеотидів або амінокислот і т.п.) покладена умовна нумерація згідно з номером положення нуклеотиду або амінокислоти. За цією нумерацією проводять порівняльний аналіз послідовностей таким чином, щоб кількість нуклеотидів або амінокислот, що збігаються в кожному положенні, була максимальною, тобто щоб максимізувати відсоток ідентичності послідовностей. При цьому оскільки не всі положення повинні бути ідентичними даній "відповідній ділянці", положення, що не збігаються, в межах тої чи іншої відповідної ділянки, можуть вважатися "відповідними положеннями". Отже, відсилання в тексті даного опису до "положення амінокислоти, що відповідає положенню Х амінокислоти" певного CKI-поліпептиду означає відсилання до певної сукупності еквівалентних положень в інших розпізнаних CKI-поліпептидах, структурних гомологіях і сімействах. В одному з типових варіантів здійснення винаходу, що стосується KRP надсімейства CKIполіпептидів і нуклеїнових кислот, "відповідність" положень амінокислот або нуклеотидів як правило визначається по відношенню до амінокислот на ділянці зв’язування з CDK або до нуклеотидів, що кодують ділянку зв’язування з CDK. У загальному випадку порівняно з іншими ділянками KRP-поліпептидів ділянки зв’язування з CDK KRP-CKI-інгібіторів мають практично ідентичні або подібні поміж собою послідовності. Таким чином, одним із підходящих методів визначення ділянки зв’язування з CDK KRP-CKI-поліпептиду може бути ідентифікація амінокислотної ділянки, що є практично ідентичною або подібною відомій ділянці зв’язування з CDK другого KRP-CKI-інгібітора (наприклад, приблизно від положень 145-168 амінокислот білка Krp1 Brassica napus (Bn Krp1)), (див., наприклад, Фіг. 1, де показано порівняння амінокислотних послідовностей кількох членів CKI сімейства з BnKrp1). Коли послідовність, що відповідає ділянці зв’язування з CDK, була визначена шляхом порівняльного аналізу, то можуть бути визначені і відповідні положення амінокислот або нуклеотидів. "Відсоток ідентичності послідовностей" при оптимальному порівнянні двох послідовностей у контексті даного винаходу визначається шляхом порівняння двох оптимальним чином зіставлених послідовностей у межах вікна порівняння, де частина цієї послідовності у вікні порівняння може містити добавки або делеції (тобто, пробіли) у порівнянні з базовою послідовністю (яка немістить добавок або делецій). Цей відсоток обчислюють таким чином: визначають кількість положень, у котрих виявляються ідентичні нуклеїнокислотні основи або амінокислотні залишки в обох послідовностях, тобто кількості положень збігу; одержану кількість положень збігу ділять на загальну кількість положень у даному вікні порівняння, і частку від ділення множать на на 100. Терміни "ідентичний" та відсоток "ідентичності" використовуються в даному описі для характеризації двох і більше нуклеїнокислотних або поліпептидних послідовностей чи субпослідовностей, які є однаковими або мають певний відсоток нуклеотидів або амінокислотних залишків, що є однаковими (наприклад, 60% ідентичність або, в разі потреби, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% чи 95% ідентичність в межах певної ділянки) за результатами порівняльного аналізу на максимальну відповідність у межах вікна порівняння або зазначеної ділянки при застосуванні однієї із зазначених тут програм порівняльного аналізу послідовностей або шляхом ручного порівняльного аналізу та візуального спостереження. Послідовності вважаються "практично ідентичними" одна одній, якщо вони є ідентичними на принаймні 25%, принаймні 30%, принаймні 35%, принаймні 40%, принаймні 45%, принаймні 50% або на принаймні 55%. Ці визначення є правомірними також для комплементу послідовності, що аналізується. У разі потреби ідентичність існує в межах поліпептидної ділянки, довжина якої визначається приблизно принаймні 6 амінокислотними залишками, принаймні 15 амінокислотними залишками, принаймні 25 амінокислотними залишками, принаймні 35 амінокислотними залишками, принаймні 50 амінокислотними залишками або принаймні 100 і більше амінокислотними залишками, або в межах нуклеїнокислотної ділянки, що кодує таку поліпептидну ділянку. У деяких кращих варіантах здійснення даного винаходу зазначеною ділянкою для порівняльного аналізу є ділянка зв’язування з CDK CKI-поліпептиду, ділянка поліпептиду, що містить частину такої ділянки зв’язування з CDK, або ділянка поліпептиду, що містить таку ділянку зв’язування з CDK. 6 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терміни "подібність" і "відсоток подібності" використовуються в даному описі для характеризації двох і більше поліпептидних послідовностей або субпослідовностей, які мають певний відсоток амінокислотних залишків, що є однаковими або подібними відповідно до визначеного консервативним амінокислотним заміщенням (наприклад, 60% подібність або, в разі потреби, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% чи 95% подібність в межах певної ділянки) за результатами порівняльного аналізу на максимальну відповідність у межах вікна порівняння або зазначеної ділянки при застосуванні однієї із зазначених тут програм порівняльного аналізу послідовностей або шляхом ручного порівняльного аналізу та візуального спостереження. Послідовності вважаються "практично подібними" одна одній, якщо вони є подібними на принаймні 20%, принаймні 25%, принаймні 30%, принаймні 35%, принаймні 40%, принаймні 45%, принаймні 50% або на принаймні 55%. У разі потреби подібність існує в межах певної ділянки, довжина якої визначається приблизно принаймні 6 амінокислотними залишками, принаймні 15 амінокислотними залишками, принаймні 25 амінокислотними залишками, принаймні 35 амінокислотними залишками, принаймні 50 амінокислотними залишками або принаймні 100 і більше амінокислотними залишками. У деяких варіантах здійснення винаходу для визначення ідентичності або подібності послідовностей призначеною для порівняльного аналізу ділянкою є ділянка зв’язування з CDK CKI-поліпептиду, ділянка поліпептиду, що містить частину такої ділянки зв’язування з CDK, або ділянка поліпептиду, що містить таку ділянку зв’язування з CDK. При порівнянні послідовностей зазвичай одна з цих послідовностей служить базовою, з якою порівнюється послідовність, що піддається аналізу. При застосуванні програми для порівняння послідовностей базову послідовність і послідовність, що піддається аналізу, вводять у комп’ютер, у разі потреби задають координати послідовностей і встановлюють параметри програми. При цьому можуть використовуватися параметри програми за умовчанням або задаватися її альтернативні параметри. Після цього запускають алгоритм порявняння послідовностей та обчислюють відсоток ідентичності або подібності послідовності, що піддається аналізу, відносно базової послідовності відповідно до заданих параметрів програми. Використовуваний тут термін "вікно порівняння" охоплює своїм значенням сегмент суміжних положень амінокислот або нуклеотидів, у котрих послідовність, що піддається аналізу, може порівнюватися з базовою послідовністю такої ж кількості суміжних положень після оптимального зіставляння цих двох послідовностей. Для порівняльного аналізу CKI-поліпептидів відповідно до даного винаходу вікно порівняння зазвичай лежить у межах приблизно від 6 до 200 і більше суміжних амінокислот, і як правило становить приблизно від 6 до 50, від 6 до 25, від 15 до 100, від 15 до 50, від 15 до 30, від 20 до 50 або від 25 до 50 суміжних амінокислот. Методи зіставляння послідовностей для їх порівняльного аналізу є добре відомими в даній галузі. Оптимальне зіставляння послідовностей для порівняльного аналізу може здійснюватися, наприклад, за допомогою програми локальної гомології Сміта-Уотермана (Smith and Waterman, Adv. Appl Math. 2:482,1970), програми гомологічного зіставляння Нідлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48:443,1970), мотоду аналізу подібності Пірсона-Ліпмана (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988), шляхом комп’ютеризованого застосування цих програм (наприклад, GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA у програмному пакеті Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) або шляхом ручного зіставляння і візуального спостереження, як описано, наприклад, у публікації (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)). Однією із підходящих програм зіставляння є PILEUP. Програма PILEUP дозволяє проводити порівняльний аналіз множини об’єктів із групи споріднених послідовностей шляхом прогресивного, попарного зіставляння з визначенням їхньої спорідненості і відсотка ідентичності. Ця програма, крім того, будує графіки дерева або дендограми, що показують об’єднувальні співвідношення, які використовуються для проведення зіставляння. У програмі PILEUP використовується спрощений метод зіставляння Фенга-Дулітла (Feng and Doolittle, J. Mol Evol 35:351-360,1987). Це є метод, подібний описаному Хігінсом і Шарпом (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989). Дана програма дозволяє зіставляти до 300 послідовностей, кожна з яких має максимальну довжину 5000 нуклеотидів або амінокислот. Першою стадією цієї методики множинного зіставляння є попарне зіставляння двох найбільш подібних одна одній послідовностей і створення сукупності із двох зіставлених послідовностей. Далі ця сукупність зіставляється з наступною найбільш спорідненою послідовністю або сукупністю зіставлених послідовностей. Дві сукупності послідовностей зіставляються шляхом простого розширювання попарного зіставляння двох індивідуальних послідовностей. Завершальною стадією цєї програми є низка прогресивних, попарних зіставлянь. Програма для її роботи потребує задавання певних специфічних послідовностей та координат їхніх амінокислот або нуклеотидів 7 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на ділянках порівняння послідовностей. Потребується задавати також параметри програми. За допомогою програми PILEUP базову послідовність порівнюють з послідовністю, що піддається аналізу, визначаючи відсоток ідентичності при таких параметрах: вага пробілів за умовчанням (3,00), вага довжини пробілів за умовчанням (0,10) і зважені кінцеві пробіли. Програма PILEUP може бути отримана із пакета GCG програм аналізу послідовностей, наприклад, версії 7.0 (Devereaux et al., Nucl Acids Res. 12:387-395,1984). Підходящими для визначення відсотків ідентичності і подібності послідовностей є також програми BLAST і BLAST 2.0, описані в роботах, відповідно, (Altschul et al., Nucl Acids Res. 25:3389-3402,1977) та (Altschul et al., J. Mol Biol 215:403-410,1990). Програма для проведення BLAST аналізів є загальнодоступною через Національний центр інформації з біотехнології (National Center for Biotechnology Information). Ця програма спочатку ідентифікує пари послідовностей з високим рахунком (HSP: high scoring sequence pairs) шляхом ідентифікації коротких слів завдовжки W у досліджуваній послідовності, які або збігаються в рахунку або задовольняють певному пороговому рахунку Τ позитивної величини при порівнянні зі словом такої самої товщини у послідовності із бази даних. Величина Τ приймається за пороговий рахунок сусіднього слова (Altschul et al., supra). Ці початкові збіги сусідніх слів служать зародками для ініціації пошуків HSP-пар більшої довжини, що їх містять. Ці збіги слів поширюються в обох напрямках уздовж кожної послідовності доти, аж поки накопичений рахунок зіставляння не зможе бути підвищений. Накопичені рахунки обчислюються, використовуючи, у випадку нуклеотидної послідовності, параметри Μ (заохочувальний рахунок для пари залишків, що збігаються; завжди > 0) і Ν (штрафний рахунок для залишків, що не збігаються; завжди < 0). При порівняльному аналізі амінокислотних послідовностей для обчислення накопиченого рахунку використовується лічильна матриця. Поширення збігу слів у кожному з напрямків зупиняється в таких випадках: коли накопичений рахунок зіставляння зменшується на величину параметра X від його максимального досягнутого рівня; коли накопичений рахунок досягає нуля і стає від’ємним внаслідок накопичення результатів зіставляння одного чи більше залишків з від’ємним рахунком; і коли досягається кінець будьякої із послідовностей, що порівнюються. Параметри W, T і X програми BLAST визначають чутливість і швидкість порівняльного аналізу. Програма BLASTN (для нуклеотидних послідовностей) використовує за умовчанням довжину слова (W) 11, очікування (E) 10, параметри Μ = 5, Ν = -4 і проводить порівняння обох ланцюгів. Програма BLASTР (для амінокислотних послідовностей) використовує за умовчанням довжину слова 3 та очікування (E) 10, і лічильну матрицю BLOSUM62 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:1091510919, 1992) у зіставлянні (B) 50, очікування (E) 10, параметри Μ = 5, Ν = -4, і здійснює порівняння обох ланцюгів. Програма BLAST проводить також статистичний аналіз подібності між двома послідовностями, див., наприклад, (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5887, 1993). Одним із показників подібності, що виробляється програмою BLAST, є імовірність (P(N)) найменшої суми, тобто імовірність, з якою може відбуватися випадковий збіг між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями. Наприклад, досліджувана нуклеїнова кислота вважається подібною базовій послідовності, якщо імовірність найменшої суми у порівнянні досліджуваної нуклеїнової кислоти з базовою нуклеїновою кислота складає менше, ніж приблизно 0,2, у типовому випадку – менше, ніж приблизно 0,01, а переважно – менше, ніж приблизно 0,001. Гомологи та ортологи генів також можуть бути ідентифіковані за допомогою ресурсу HomoloGene Національного центра інформації з біотехнології (NCBI: National Center for Biotechnology Information). Гомолог або ортолог першого гена може кодувати генний продукт, який має таку саму або подібну функцію, що і генний продукт, кодований першим геном. Іншою ознакою того, що дві нуклеїнокислотні послідовності або поліпептиди є ортологами, є те, що гетерологічний ген може доповнювати (наприклад, рятувати) нульовий алель андогенного гена в системі експресії еукаріотичної клітини. ПЕРЕЛІК ФІГУР КРЕСЛЕННЯ На Фіг. 1 ілюстроване зіставляння амінокислотних послідовностей членів KRP-сімейства Arabidopsis з членами Krp-сімейства Brassica. Послідовності KRP-білків Arabidopsis були отримані із загальнодоступної бази даних: AtKrp1 (Genbank № U94772) (SEQ ID NO:2); AtKrp2 (Genbank № CAB76424) (SEQ ID NO:3); AtKrp3 (Genbank № CAC41617) (SEQ ID NO:4); AtKrp4 (Genbank № CAC41618) (SEQ ID NO:5); AtKrp5 (Genbank № CAC41619) (SEQ ID NO:6); AtKrp6 (Genbank № CAC41620) (SEQ ID NO:7); і AtKrp7 (Genbank № CAC41621) (SEQ ID NO:8). Послідовності для KRP-білків Brassica (BnKrp1 (SEQ ID NО:68), BnKrp3 (SEQ ID NO:69), BnKrp4 (SEQ ID NO:70), BnKrp5 (SEQ ID NO:71) і BnKrp6 (SEQ ID NO:72)) були отримані так, як описано 8 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у Прикладі 1 нижче. На цій ілюстрації також показана амінокислотна послідовність для p27 (SEQ ID NO:73). На Фіг. 2 показане зіставляння амінокислотних послідовностей кукурудзи (SEQ ID NO:9), рапсового насіння, сої (SEQ ID NO: 11), тополі (SEQ ID NO: 12), тютюну (SEQ ID NO: 13), пшениці, рису (SEQ ID NO: 15) і картоплі (SEQ ID NO: 16) на ділянках зв’язування цикліну і CDK, що ілюструє високий ступінь ідентичності послідовностей у межах ділянки зв’язування з CDK. На Фіг. 3 показані нуклеїнокислотні послідовності мутантного білка BnKrp1, які були кодоноптимізованими для експресії в кукурудзі, кодування на BnKrp1 F151A; 153A (SEQ ID NO:74) або на BnKrp1 Y149A; F151A; F153A (SEQ ID NО:75). ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даним винаходом пропонуються склади і процеси для модулювання цитокінезу в рослинах. Зокрема, пропонуються поліпептиди що діють антагоністично по відношенню до функції CKIбілка дикого типу шляхом домінантного негативного механізму, а також споріднені з ними полінуклеотиди, клітини-хазяїни, трансгенні рослини, і процеси для їх застосування. У практичному здійсненні даного винаходу можуть використовуватися найрізноманітніші трансгенні вектори, які містять полінуклеотид, що кодує варіантний, домінантний негативний CKI-поліпептид. При введенні та експресії CKI-трансгенів згідно з винаходом в рослини в цих рослинах відбувається модулювання цитокінезу. Модулювання цитокінезу може відбуватися в усій рослині, в її тканині чи органі залежно специфічним чином від типу промоторної послідовності, оперативно зв’язаної з даним варіантним CKI-трансгенном. Зокрема, запропоновані тут склади і процеси можуть використовуватися для прискорення розвитку рослинних клітин в клітинному циклі, з супровідним підвищенням клітинної проліферації. За допомогою запропонованих складів і процесів можна, наприклад, одержувати підвищені врожаї і/або збільшувати розміри насіння найрізноманітніших рослин. Підвищені врожаї можуть одержуватися, наприклад, у формі збільшення листяної тканини, фруктової маси, квіткової маси, кореневої маси і т. п. У деяких конкретних формах здійснення винаходу варіантним CKI-поліпептид є членом сімейства KRP-білків. Цей аспект даного винаходу винаходом ґрунтується, принаймні частково, на виявленні того факту, що за інгібування циклін-CDK-комплексів відповідальною є, головним чином, ділянка зв’язування з CDK членів КRP-сімейства. Отже, націлювання ділянки зв’язування з CDK у членів KRP-сімейства (як антагоністів ділянці зв’язування з цикліном) дозволяє виробляти мутантні білки, що є особливо ефективними, домінантними негативними антагоністами функції CKI дикого типу. Мутантні CKI-поліпептиди. Нуклеїнові кислоти і вектори CKI-поліпептиди згідно з винаходом є мутантними або варіантними білками, які відрізняються від CKI-білків природного походження або дикого типу. Варіантні CKI-поліпептиди містять принаймні одну модифікацію відносно базового CKI-поліпептиду (наприклад, CKI-білка дикого типу) на ділянці зв’язування цього білка з CDK або цикліном. Типовими формами модифікацій при цьому можуть бути амінокислотні заміщення, вставки, і/або делеції у порівнянні з відповідною послідовністю дикого типу. Особливо підходящими модифікаціями є амінокислотні заміщення. У деяких варіантах здійснення винаходу варіантний CKI-поліпептид містить принаймні одну неконсервативну модифікацію (наприклад, заміщення). Мутантні CKI-поліпептиди згідно з винаходом є домінантними негативними білками. Домінантний негативний підхід є особливо підходящим для CKI-поліпептидів, які мають дві поліпептидні ділянки, залучені до зв’язування з CDK і цикліном окремо одна від одної. Загальний метод створення домінантного негативного мутанта згідно з винаходом передбачає модифікування однієї із індивідуальних ділянок зв’язування з CDK і цикліном таким чином, щоб змінити зв’язування з CDK або цикліном "дикого типу". Ця модифікована ділянка зв’язування з CDK або цикліном може давати еквівалентне, зменшене або виключене зв’язування з цикліном або CDK порівняно з поліпептидом дикого типу. У будь-якому випадку мутація повинна знижувати або виключати CKI-інгібіторну активність. Для конструювання домінантного негативного CKI-поліпептиду, здатного перешкоджати функції дикого типу, мутантний поліпептид повинен (1) значною мірою зв’язуватися з циклін/CDK-комплексами; (2) практично не інгібувати циклін/CDK-комплекси навіть при високих концентраціях; і (3) конкурувати з CKIполіпептидом дикого типу за зв’язування з циклін/CDK-комплексом. В умовах in vivo мутантні CKI-поліпептиди, які задовольняють усім цим вимогам, підвищують циклін/CDK-кіназну активність у клітинах, що в свою чергу приводить до збільшення проліферації клітин і більш високого мітотичного індексу і, кінець кінцем, до створення рослин підвищеної врожайності, збільшення розмірів насіння та підвищення деяких інших характеристик, асоційованих з підвищенням циклін/CDK-кіназної активності на одній і більше ділянках даної рослини. 9 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У випадку KRP-поліпептидів мішенню для модифікування є ділянка зв’язування з CDK, яка є головним чинником, відповідальним за інгібування циклін/CDK-кіназ у цьому сімействі CKIполіпептидів. Особливо підходящими формами модифікацій є амінокислотні заміщення, вставки та делеції. Наприклад, амінокислотні заміщення можуть створюватися на ділянці зв’язування з CDK або цикліном як модифікації, що зменшують або виключають зв’язування. Подібним чином амінокислот заміщення можуть створюватися на ділянці зв’язування з CDK або цикліном як модифікації, що зменшують або виключають CKI-інгібіторнy активність. У типових варіантах здійснення даного винаходу створюють принаймні одну модифікацію у формі неконсервативного амінокислотного заміщення, вставки або делеції на ділянці зв’язування з CDK або цикліном для руйнування або модифікування зв’язування CKI-поліпептиду з CDK або цикліновим білком. Створюваним шляхом заміщення CKI-поліпептидними мутантами є такі, котрі в базовій послідовності CKI-білка мають принаймні один видалений амінокислотний залишок, а замість нього в цьому ж положенні вставлену іншу амінокислоту. Такі заміщення можуть бути поодинокими, тобто такими, при котрих у молекулі стає заміщеною лише одна амінокислота, або множинними, при котрих у тій самій молекулі стають заміщеними дві і більше амінокислот. Значні зміни в активності CKI-білкових молекул згідно з винаходом можуть бути отримані шляхом заміщення: однієї амінокислоти іншою, бічний ланцюг якої суттєво відрізняється зарядом і/або структурою від нативної амінокислоти; амінокислотою, яка має електричний заряд, протилежний заряду нативної амінокислоти; або амінокислотою, гідрофільність якої є протилежною властивості цього типу у нативної амінокислоти, і т. п. Ці типи заміщень повинні впливати на структуру поліпептидного остову і/або на заряд або гідрофобність молекули на ділянці заміщення. У деяких типових варіантах здійснення винаходу CKI-мутанти створюються шляхом заміщення не-аланінового залишку на аланін. В інших варіантах CKI-мутанти створюються шляхом заміщення одного амінокислотного залишку, наприклад, на амінокислоту з електричним зарядом протилежного знаку, на один амінокислотний залишок з більшим бічним ланцюгом, на амінокислоту з протилежною гідрофільній властивістю, на малу неполярну амінокислоту (наприклад, Cys, Thr, Ser, Ala або Gly) або на полярну амінокислоту (наприклад, Pro, Glu, Asp, Asn або Gln). Інсерційними CKI-поліпептидними мутантами є такі, що містять одну чи більше амінокислоти, вставлені безпосередньо поряд з амінокислотою в конкретному положенні базової CKI-білкової молекули. Вставка безпосередньо поряд з амінокислотою з’єднується з функціональною α-карбоксильною або α-аміногрупою даної амінокислоти. Ці вставки можуть бути одноамінокислотними і багатоамінокислотними і складатися, наприклад, із однієї або двох консервативних амінокислот. Амінокислоти, що є подібними за зарядом і/або структурою з амінокислотою, суміжною з місцем вставки, визначаються як консервативні. В альтернативному варіанті мутантні CKI-поліпептиди містять вставку амінокислоти з зарядом і/або структурою, що суттєво відрізняються від заряду і структури амінокислоти, суміжної з місцем вставки. Делеційними є CKI-поліпептидні мутанти, створені шляхом видалення однієї чи більше амінокислот у базових CKI-білкових молекулах. У деяких варіантах здійснення винаходу делеційні мутанти мають одну, дві і більше амінокислот, видалених на певній ділянці CKIбілкової молекули. Делеційними можуть бути, наприклад, мутанти, котрі мають усічені аміноабо карбоксильні кінці. Процеси згідно з винаходом можуть застосовуватися до будь-якого розпізнаного члена сімейства CKI-білків, у котрих індивідуальні ділянки є залученими до зв’язування CDK і циклінових білків для інгібування CDK-кіназної функції. В одному з варіантів здійснення винаходу мутантними CKI-білками є мутації або варіанти білків, що належать до KRP-сімейства CKІ-поліпептидів. Як зазначалося вище, ділянка зв’язування з CDK членів KRP-сімейства є головним чинником, відповідальним за інгібування кіназ. Отже ділянка зв’язування з CDK є кращою мішенню для модифікації при конструюванні варіантних KRP CKI-поліпептидів. Ділянка зв’язування з CDK KRP-білків у загальному випадку відповідає амінокислотам 145-168 білка Krp1 (BnKrp1) (SEQ ID ΝΟ. 17) виду Brassica napus. У деяких варіантах здійснення винаходу модифікація ділянка зв’язування з CDK члена KRP-сімейства включає у себе модифікацію принаймні одного амінокислотного положення, двох і більше амінокислотних положень у межах ділянки, що відповідає положенням 145-168 білка BnKrp1. (Відповідна ділянка в білку Krp1 виду Arabidopsis thaliana містить амінокислоти 167-190). Особливо підходящими амінокислотними положеннями для модифікації є такі, що відповідають амінокислотам 145, 148, 149, 151, 153, 155, 163, 164, 165 і/або 167 білка Krp1 виду Srassica napus (BnKrp1). Відповідні амінокислотні 10 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 залишки в інших CKІ поліпептидах можна легко визначити шляхом порівняльного аналізу послідовностей добре відомими методами, як більш докладно описано нижче. У будь-якому випадку згадані вище амінокислоти у ссавців p27 є консервативними і контактують з CDK у кристалічній структурі p27, об’єднаній в комплексі з Цикліном A і CDK2. В одному з варіантів здійснення винаходу модифікація ділянки KRP зв’язування з CDK включає у себе модифікацію амінокислот, що відповідають амінокислотним положенням 151 і 153 білка BnKrp1 (наприклад, амінокислотне заміщення на аланін або на амінокислоту з протилежним зарядом у кожному з цих місць). В інших типових варіантах здійснення винаходу в додаток до модифікації амінокислот, що відповідають положенням 151 і 153 білка BnKrp1, модифікація ділянки KRP зв’язування з CDK включає у себе також модифікацію (або модифікації) в положенні (або положеннях), що відповідає амінокислоті (або амінокислотам) 149, 164 і/або 165 білка BnKrp1 (наприклад, додаткове амінокислотне заміщення в положенні, що відповідає амінокислоті 149 білка BnKrp1; або два додаткові амінокислотні заміщення в положеннях, що відповідають обом амінокислотам 164 і 165 білка BnKrp1). Такі модифікації у KRP CKIполіпептиді змінюють афінність зв’язування з CDK-білком, практично повністю зберігаючи при цьому здатність варіантного білка зв’язуватися з цикліновим білком. Серед особливо цікавих модифікацій ділянок Krp зв’язування з CDK можна назвати, наприклад, модифікації, що відповідають будь-якому із таких амінокислотних заміщень: BnKrp1 F145A; Y149A BnKrp1 F145A; Y149A; F151A BnKrp1 F145A; Y149A; F151A; F153A BnKrp1 Y149A; F151A BnKrp1 Y149A; F153A BnKrp1 F151A; F153A BnKrp1 F151A; F153A; Y149A BnKrp1 F151A; F153A; E164A BnKrp1 F151A; F153A; W165A BnKrp1 F151A; F153A; E164A; W165A BnKrp1 F151A; F153A; Y149A; E164A BnKrp1 F151A; F153A; Y149A; W165A BnKrp1 F151A; F153A; Y149A; E164A; W165A BnKrp1 E164A; W165A У деяких варіантах здійснення винаходу модифікованим як описано вище CKI-поліпептидом є BnKrp1. В інших варіантах модифікованим як описано вище CKI-поліпептидом не є BnKrp1 (наприклад, Arabidopsis thaliana), з заміщеними амінокислотами, що відповідають зазначеним вище. Інші модифікації (наприклад, заміщення, вставки, делеції), які впливають на зв’язування з CDK або цикліном, включаючи додаткові модифікації в членах KRP-сімейства, можуть бути ідентифіковані за допомогою різноманітних методів, включаючи методи структурного порівняльного аналізу, методи порівняльного аналізу послідовностей тощо. Мутантні або варіантні білки можуть створюватися, наприклад, за допомогою пристрою PDA™, докладно описаного в патентах США (U.S. Pat. Nos. 6,188,965; 6,296,312; 6,403,312); методами сканування аланіну (U.S. Pat. No. 5,506,107), перестановки генів ((WO 01/25277), сайтнасиченого мутагенезу, середнього поля, гомології послідовностей та іншими методами, добре відомими фахівцям у даній галузі, що проводять селекцію сайтів і типів точкової мутації, як більш докладно описано нижче. Варіанти CKI-поліпептидів згідно з винаходом можуть бути сконструйовані шляхом мутації послідовностей ДНК, що кодують відповідні CKI-інгібітори дикого типу або інші відповідні CKIінгібітори, із котрих виводиться даний варіант, наприклад, за допомогою методів, загальновідомих під назвою сайт-спрямованого мутагенезу. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують CKI-білки, можуть бути мутовані за допомогою різноманітних методів полімеразноланцюгової реакції (PCR: polymerase chain reaction), добре відомих фахівцям у даній галузі, див., наприклад, (PCR Strategies, M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA, Chapter 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990). Крім того, для індукування мутацій на кодувальних ділянках білків, що є членами KRP-сімейства, можуть використовуватися добре відомі хімічні і/або радіаційні методи мутагенезу. За допомогою скринінгу можуть виявлятися рослини, котрі можуть містити бажану нуклеотидну послідовність, що кодує мутантні або варіантні Krp-білки згідно з винаходом. Рослини можуть добиратися за 11 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 змінами в амінокислотній послідовності CKI-білка, змінами кіназної активності або за очікуваними змінами фенотипу з наступним аналізом послідовності. Наприклад, для введення сайт-спрямованих мутантів у ген, що кодує CKI-білок, може використовуватися двопраймерна система із комплекту „Transformer Сайт-спрямован Mutagenesis” виробництва фірми Clontech. У цій системі після денатурації плазміди-мішені у плазміду одночасно ренатурують два праймери. Один із цих праймерів містить бажану сайтспрямовану мутацію, а інший містить мутацію в іншій точці плазміди, в результаті чого відбувається видалення сайта рестрикції. Після цього проводять синтез другого ланцюга, щільно зшиваючи ці дві мутації, а отримувані в результаті плазміди трансформуються у штам mutS виду E. coli. Плазмідну ДНК відокремлюють від трансформованої бактерії, обмежують відповідним ферментом рестрикції (лінеаризуючи цим немутовані плазміди), а потім повторно трансформують у E. coli. Дана система дозволяє створювати мутації безпосередньо в плазміді експресії без необхідності субклонування або генерування одноланцюгових фагемід. Щільна зшивка двох мутацій і наступна лінеаризації немутованих плазмід дають високу ефективність мутації при мінімальному скринінгу. Після синтезу початкового праймера сайта рестрикції цей метод потребує використання лише одного типу нового праймера на сайт мутації. Замість того, щоб готувати окремо кожний позиційний мутант, цей метод дозволяє синтезувати групу "сконструйованих вироджених" олігонуклеотидних праймерів для введення в даний сайт одночасно всіх бажаних мутацій. Скринінг трансформантів може здійснюватися шляхом секвенування плазмідної ДНК через піддану мутагенезуділянку для ідентифікації і сортування мутантних клонів. Після цього кожна мутантна ДНК може піддаватися рестрикції та аналізу методом електрофорезу, наприклад, на гелі Бейкера (J. T. Baker) підсилення детектування мутацій для підтвердження того, що в даній послідовності не відбулося інших змін, окрім бажаних, (шляхом порівняння зсуву смуг з контролем, що не піддавався мутагенезу). В альтернативному варіанті для підтвердження того, що за межами цільової ділянки не відбулося жодних мутаційних подій, секвенуванню може піддаватися вся ділянка ДНК. Для трансформування штамів E. coli, таких як E. coli BL21 (DE3) pLysS, з метою одержання високих рівнів вироблення мутантного білка можуть використовуватися перевірені мутантні дуплекси у векторі надекспресії рЕТ (або іншому) та очистка за стандартними протоколами. Для швидкої перевірки правильності мутантної експресії може використовуватися метод FAB-MS картування. Цей метод передбачає сегменти секвенування по всьому білку і дає необхідну вірогідність у розподілі послідовності. В експерименті з картування цього типу білок піддають гідролізу протеазою (вибір залежить від конкретної ділянки, що модифікується, оскільки цей сегмент має головне значення, а решта карти повинна бути ідентичною карті білка, що не піддавався мутагенезу). Групу фрагментів розщеплення поділяють на фракції, наприклад, за допомогою мікроколонкової HPLC-хроматографії (оберненофазової або іонообмінної рідинної хроматографії високої розрізнювальної спроможності, також в залежності від конкретної ділянки, що модифікується), отримують у кожній фракції декілька пептидів і за допомогою стандартних методів на зразок FAB-MS визначають молекулярні маси цих пептидів. Визначені маси кожного із фрагментів порівнюють з молекулярними масами пептидів, які очікується отримати в результаті гідролізу прогнозованої послідовності, і швидко встановлюють коректність цієї послідовності. Оскільки метод мутагенезу в модифікації білків є спрямованим, то проводити секвенування зміненого пептиду не потребується, якщо дані мас-спектроскопії (MS) узгоджуються з прогнозом. У разі необхідності перевірити той чи інший змінений залишок можна проводити секвенування пептидів отриманої суміші, застосовуючи для цього комп’ютеризований тандем мас-спектроскопії MS/MS, або ж цільовий пептид можна очистити для його субтрактивної деградації за Едманом (Edman) або гідролізу карбоксипептидазою Υ в залежності від локусу модифікації. При проектуванні сайт-спрямованого мутагенезу у загальному випадку бажано спочатку провести неконсервативне заміщення і визначити (a) чи послабляється цим цільова CDK- або циклін-зв’язувальна активність і (b) чи не погіршує це значною мірою ту чи іншу нецільову активність (наприклад, зв’язування з цикліном, коли мішенню модифікації є ділянка зв’язування з CDK). Якщо отримані таким чином результати показують, що даний залишок є важливим для нецільової біологічної активності, то можна проводити консервативне заміщення. До нуклеотидних послідовностей CKI-білків можуть застосовуватися також інші методи сайтспрямованого мутагенезу. Наприклад, для створення делеційних варіантів CKI-білків може застосовуватися гідроліз ДНК ендонуклеазою рестрикції з наступним лігуванням, як узагально описано в розділі 15.3 лабораторного підручника (Sambrook et al., Molecular Cloning: A nd Laboratory Manual, 2 Ed., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY). Аналогічна стратегія може застосовуватися в конструюванні інсерційних варіантів, як описано в розділі 15.3 12 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цитованого вище підручника (Sambrook et al., supra). Трохи пізніше був розроблений підходящий для даного винаходу метод ціленаправленої мутації рослинних генів in vivo за допомогою химерних РНК/ДНК олігонуклеотидів (Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:87688773, 1999). Існує декілька підходящих методів створення мутантних поліпептидів з більш ніж одним амінокислотним заміщенням. Якщо потрібні амінокислоти в поліпептидному ланцюзі розташовані близько одна до одної, то мутація їх може здійснюватися одночасно за допомогою одного олігонуклеотиду, що кодує всі бажані амінокислотні заміщення. Але якщо потрібні амінокислоти розташовані на деякій відстані одна від одної (розділені, наприклад, більш ніж десятьма амінокислотами), то створити єдиний нуклеотид, який би кодував усі бажані зміни, є справою досить складною. У цьому випадку можуть бути застосовані два альтернативні методи. В одному з них для кожної заміщуваної амінокислоти створюють свій окремий олігонуклеотид. Створені олігонуклеотиди всі одночасно відпалюють в одноланцюгову матричну ДНК, а другий ланцюг ДНК, синтезований із цього темплату, кодує всі бажані амінокислотні заміщення. Альтернативний метод складається з двох і більше циклів мутагенезу, продуктом якого є бажаний мутант. Перший цикл є таким, як описано вище для одержання поодиноких мутантів: у матричну ДНК CKI дикого типу відпалюють олігонуклеотид, що кодує перше бажане амінокислотне заміщення (або амінокислотні заміщення), і після цього створюють молекулу гетеродуплексної ДНК. У другому циклі мутагенезу як темплат використовують мутовану ДНК, одержану в першому циклі. Таким чином, цей темплат містить одну чи більше мутацій. У нього відпалюють олігонуклеотид, що кодує додаткове амінокислотне заміщення (або додаткові амінокислотні заміщення), і отриманий у результаті ланцюг ДНК вже кодує мутації із обох – першого і другого – циклів мутагенезу. Отриману в результаті ДНК можна використовувати тепер як темплат у третьому циклі мутагенезу, і т. д. Одним із особливо підходящих методів проведення ідентифікації потрібних модифікацій включає у себе вивіряння CKI-білків шляхом порівняльного аналізу послідовностей. Існує низка описаних вище методологій порівняльного аналізу послідовностей. Серед комп’ютерних програм, підходящих для проведення такого аналізу, можна назвати, наприклад: SmithWaterman searches, Needleman-Wunsch, Double Affine Smith-Waterman, frame search (рамковий пошук), Gribskov/GCG profile search (профільний пошук), Gribskov/GCG profile scan, profile frame search (профільне сканування, профільний рамковий пошук), Bucher generalized profiles (узагальнені профілі Батчера), Hidden Markov models, Hframe, Double Frame, Blast, Psi-Blast, Clustal і GeneWise, див., наприклад, публікації (Altschul et al., J. Mol Biol. 215:403-410, 1990; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997), включені тут шляхом посилання. Амінокислотні послідовності споріднених CKI-поліпептидів можуть зіставлятися в порівняльному аналізі множини послідовностей (MSA: multiple sequence alignment), як показано, наприклад, на Фіг. 1. MSA аналіз може застосовуватися також для поширення структурної інформації, відомою стосовно одного чи більше CKI-поліпептидів, на додаткові CKI-поліпептиди (як правило, на CKI-поліпептиди, що мають практично ідентичні поміж собою послідовності), котрі поки що не могли бути ідентифіковані. Завдяки високому ступеню структурної гомології між різними CKI-поліпептидами MSA аналіз може використовуватися як надійний засіб прогнозування ефектів модифікації в різноманітних положеннях у межах зіставляння послідовностей. Таким чином, стосовно членів KRP-сімейства, наприклад, послідовність і нумерація CKI-білків, показані на Фіг. 1, можуть використовуватися як MSA еталонна точка для білкової послідовності будь-якого іншого члена KRP-сімейства. Як зазначалося вище, особливо підходящими для модифікацій положеннями амінокислот є такі, що відповідають положенням 145, 148, 149, 151, 153, 155, 163, 164, 165 і/або 167 амінокислотної послідовності виду Brassica napus KRP1 (BnKrp1). Використовуючи зіставлення послідовностей, наведене на Фіг. 1, і/або відомі в даній галузі програми порівняльного аналізу, включаючи згадані в даному описі, можна як еталон використовувати систему нумерації даної програми порівняльного аналізу і по ньому корелювати відповідні положення CKI-поліпептиду за еквівалентними положеннями в інших розпізнаних членах CKI-білків або структурних гомологів і сімейств. Аналогічними прийомами можна користуватися при порівняльному аналізі амінокислотних послідовностей CKIполіпептидів, які ще потрібується секвенувати. У деяких випадках амінокислоти в CKI-поліпептидах, що взаємодіють з CDK цикліновим білком, можна ідентифікувати безпосередньо за тримерною структурою CKI/CDK або CKI/циклінового комплексу. Таку саму інформацію можна отримувати шляхом аналізу CKI/CDK або CKI/циклінового комплексу спорідненого CKI-поліпептиду. Отже, порівняльний аналіз первинної структури може використовуватися для створення варіантних CKI-поліпептидів згідно з даним винаходом. Існують численні програми порівняльного аналізу первинної структури, 13 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 див., наприклад, публікації: VAST від NCBI website; SSAP (Orengo and Taylor, Methods Enzymol. 266:617-635,1996); SARF2 (Alexandrov, Protein Eng. 9:727-732, 1996) CE (Shinydyalov and Bourne, Protein Eng. 11:739-747,1998); (Orengo et al., Structure 5:1093-108, 1997; Dali (Holm et al., Nucl Add Res. 26:316-9, 1998), включені тут шляхом посилання. Таким чином, корисні модифікації на інтерфейсах CKI/CDK або CKI/циклін можуть вибиратися за допомогою таких програм проектування або моделювання білків, як PDA™ technology (Патенти США №№ 6,188,965; 6,269,312 і 6,403,312), включені тут шляхом посилання. У програмах цього класу у загальному випадку для оцінки сумісності амінокислотних послідовностей із загальною третинною та четвертинною структурою білка використовуються функції підраховування на атомному рівні або амінокислотному рівні. Отже, алгоритми цього класу можуть використовуватися для добору CDK- або циклін-зв’язувальних модифікацій і/або розривів, які практично не погіршують здатності варіантних CKI-білків утворювати правильні складчасті структури і взаємодіяти з мішенями природного походження відповідно до немодифікованих ділянок білка. У цих методах вхідними даними зазвичай служить структурна інформація високого розрізнювання щодо білка-мішені. В одному з варіантів здійснення винаходу вхідними даними служить експериментально визначена структура відповідного CKIбілка. В інших варіантах для конструювання гомологічних моделей атомного рівня для СКІчленів може використовуватися MSA аналіз на базі підмножини сімейства, тримірні структури якого були визначені за допомогою кристалографічних та інших подібних методів. Можливими є також варіанти, в котрих для прогнозування контактного амінокислотного залишку для рослинних CKI-інгібіторів може використовуватися структурна модель інтерфейсу p27/циклін ссавця. Ідентифікація мутантних CKI-поліпептидів з модифікованою, наприклад, зниженою спроможністю зв’язуватися з CDK або цикліновим білком, може здійснюватися також найрізноманітнішими іншими методами, включаючи, наприклад, методи спрямованої еволюції (наприклад, схильної до помилок полімеразно-ланцюгової реакції PCR, перестановок ДНК тощо), односайтового мутагенезу насичення та аланін-сканувального мутагенезу. У випадку KRP CKI-білків, наприклад, застосування цих або інших методів може дозволити здійснювати ідентифікацію додаткових модифікацій, що знижують CDK-зв’язувальну активність і лежать поза межами описаної тут ділянки зв’язування з CDK. Крім того, для автоматизованого добору послідовностей шляхом індивідуальних обчислень рахунків мутантних послідовностей і складання переліку послідовностей можуть використовуватися молекулярно-динамічні обчислення. Поряд з цим, для обчисленя рахунків послідовностей при автоматизованому скринінгу можуть використовуватися потенціали пар залишків (Miyazawa et al., Macromoleculs 18: 534-552,1985), включена тут шляхом посилання. В альтернативному варіанті для проведення тестування можуть створюватися бібліотеки варіантних CKI-білків. Наприклад, бібліотека варіантних амінокислотних послідовностей CKIбілків може використовуватися для конструювання нуклеїнових кислот, що кодують варіантні послідовності CKI-білків і після цього можуть були клоновані у клітини-хазяїни, експресуватися і піддаватися аналізу. Добір кодонів, підходящих векторів експресії і клітин-хазяїнів, як правило, залежить від низки факторів і, в разі потреби, може бути легко оптимізований. В одному з особливо підходящих методів скринінгу бібліотеки мутантів проводять тестування на домінантну негативну антагоністичну активність і/або інші бажані активності згідно з окресленим у даному описі, численні PCR реакції зі згрупованими олігонуклеотидами. Синтезують олігонуклеотиди, що перекриваються і відповідають гену повної довжини. Ці олігонуклеотиди можуть представляти всі різноманітні амінокислоти в усіх варіантних положеннях або підмножинах. Ці олігонуклеотиди можуть групуватися в однакових пропорціях і можуть проводитися численні PCR реакції для створення послідовностей повної довжини, що містять комбінації мутацій, визначених бібліотекою. Крім того, це може здійснюватися за допомогою схильними до помилок PCR-методами. Кожний із олігонуклеотидів, що перекриваються, як правило, містить лише одне положення, яке піддається варіації. В альтернативному випадку варіантні положення розташовані одне до одного занадто близько для того, щоб це дозволити, у зв’язку з чим для того, щоб здійснювати повну рекомбінацію всіх можливостей використовують множину варіантів на (тобто, кожний олігонуклеотид може містити кодон для одного положення, що піддається мутації, або для більш ніж одного положень, що піддаються мутаціям). Множина положень, що піддаються мутаціям, у кращому варіанті розташовані в послідовності близько одне до одного для запобігання тому, щоб довжина олігонуклеотиду виявилася практично невигідною. Для мутації множини положень в олігонуклеотиді у бібліотеці можуть включатися або виключатися конкретні комбінації мутацій шляхом включення або виключення олігонуклеотиду, що кодує дану 14 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комбінацію. Наприклад, як показано в даному описі, можуть існувати кореляції між варіабельними ділянками; тобто коли положенням X є певний залишок, положенням Υ повинен бути (або не бути) конкретний залишок. Ці множини варіабельних положень іноді в даному описі звуться "кластерами". Коли кластери складаються із залишків, розташованих близько один до одного і, таким чином, можуть перебувати на одному олігонуклеотидному праймері, ці кластери можуть бути "добре" корельованими і виключати погані комбінації, котрі можуть знижувати ефективність бібліотеки. Проте, якщо залишки кластера далеко дистанційовані в послідовності один від одного і, таким чином, для синтезу будуть перебувати в різних олігонуклеотидах, то може бути бажаним чи то привести ці залишки в "добру" кореляцію, чи то повністю вилучити їх як варіабельні об’єкти. В альтернативному варіанті бібліотека може створюватися в декілька стадій таким чином, щоб кластерні мутації з’являлися тільки разом. Ця процедура, тобто процедура ідентифікації кластерів мутації і розміщення їх в одних і тих самих олігонуклеотидах або вилучення їх із бібліотеки, або ж створення бібліотеки в декілька стадій при збереженні кластерів, може значно збагатити бібліотеку правильно складеним в багатомірну структуру білком. Ідентифікація кластерів може проводитися різноманітними шляхами, включаючи, наприклад, відомі методи розпізнавання рисунків, порівняння частот виникнення мутацій або енергетичного аналізу послідовностей, які планується створювати експериментальним шляхом (наприклад, якщо енергія взаємодії є високою, то положення є корельованими). Це можуть бути кореляції положень (наприклад, варіабельні положення 1 і 2 завжди змінюються разом або ніколи не змінюються разом) або кореляції послідовностей (наприклад, якщо залишок A є в положенні 1, то залишок Β завжди займає положення 2), див., наприклад, публікації (Pattern Discovery in Biomolecular Data; Tools, Techniques, and Applications; (Jason T. L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shasha eds., New York, Oxford University, 1999); Andrews, Introduction to Mathematical Techniques in Pattern Recognition (New York, Wiley-lnterscience, 1972); Applications of Pattern Recognition (K. S. Fu ed., Boca Raton, FL, CRC Press, 1982); Genetic Algorithms for Pattern Recognition (Sankar K. Pal and Paul P. Wang eds., Boca Raton, FL, CRC Press, 1996); Pandya, Pattern Recognition with Neural Networks in C++ (Boca Raton, FL, CRC Press, 1996; Handbook of Pattern Recognition & Computer Vision (C. H. Chen, L. F. Pan, and P. S. P. Wang, eds., nd 2 ed. Singapore; River Edge, N.J., World Scientific, c1999); Friedman, Introduction to Pattern Recognition: Statistical Structural, Neural, and Fuzzy Logic Approaches (River Edge, N.J., World Scientific, 1999, Series title: Series in machine perception and artificial intelligence; vol. 32), включені тут безпосередньо шляхом посилання. Крім того, можуть використовуватися також програми для пошуку консенсусних мотивів. Для створення бібліотек, що експресують білки різних довжин, можуть використовуватися олігонуклеотиди з вставками або делеціями кодонів. Зокрема, автоматизований скринінг послідовностей за вставками або делеціями може давати вторинні бібліотеки, що визначають білки різних довжин, котрі можуть експресовуватися бібліотекою згрупованого олігонуклеотиду різних довжин. В іншому варіанті здійснення винаходу мутантні CKI-поліпептиди згідно з даним винаходом створюються шляхом перестановок певного сімейства (наприклад, множини мутантів); тобто певна множина вищих послідовностей (якщо використовується рангований перелік) може переставлятися схильними до помилок PCR реакціями або без них. Термін "перестановка" в даному контексті означає у загальному випадку безладну рекомбінацію споріднених послідовностей. "Перестановка" може бути такою, як описано в (Патентах США №№ 5,830,721; 5,811,238; 5,605,793; 5,837,458 і PCТ US/19256), включених тут шляхом посилання. Це може бути також штучна множина послідовностей; наприклад, із таблиці імовірностей (наприклад, створеної за допомогою SCMF) або множиною Монте Карло (Monte Carlo). Подібним чином "сімейством" можуть бути вищі 10 і нижчі 10 послідовностей, вищі 100 послідовностей і т. п. Сімейство може створюватися також за допомогою схильних до помилок PCR реакцій. Таким чином, перестановка in silico може здійснюватися за допомогою описаних тут автоматизованих методів (наприклад, починаючи двома бібліотеками або двома послідовностями, можуть створюватися та оцінюватися безладні рекомбінації цих послідовностей). Бібліотеки варіантних CKI-поліпептидів можуть створюватися за допомогою схильних до помилок PCR реакцій, див. (Патенти США №№ 5,605,793, 5,811,238 і 5,830,721), включені тут шляхом посилання. Це може здійснюватися на оптимальній послідовності або на вищих членах бібліотеки, або на певній іншій множині чи на іншому сімействі. За допомогою цього методу може бути синтезований ген для оптимальної послідовності, знайденої шляхом автоматизованого скринінгу первинної бібліотеки. Після цього проводять схильні до помилок PCR реакції на гені з оптимальною послідовністю при наявності олігонуклеотидів, що кодують 15 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мутації у варіантних положеннях бібліотеки (олігонуклеотиди зсуву). Добавки олігонуклеотидів створюють зсув, що сприяє включенню мутації в бібліотеку. В альтернативному варіанті для зсуву бібліотеки можуть використовуватися лише олігонуклеотиди для певних мутацій. Для створення бібліотеки послідовністей ДНК, що віддзеркалює пропорцію мутацій у бібліотеці CKI-білків, може здійснюватися перестановка генів за допомогою схильних до помилок PCR реакцій на гені для оптимальної послідовності при наявності олігонуклеотидів зсуву. Олігонуклеотиди зсуву можуть добиратися різноманітними шляхами. Один з них оснований на частоті олігонуклеотидів, де можуть використовуватися, наприклад, олігонуклеотиди, що кодують положення високої частоти мутацій. В альтернативному варіанті можуть використовуватися олігонуклеотиди, котрі містять найбільш варіабельні положення, щоб таким чином збільшити різноманітність мутацій. Якщо вторинна бібліотека є рангованою, то для створення олігонуклеотидів зсуву може використовуватися певна кількість положень вищого рахунку. Можуть вибиратися також випадкові положення. Можуть вибиратися декілька положень вищого рахунку і декілька положень нижчого рахунку, і т. п. При цьому важливо створювати нові послідовності на основі кращих варіабельних положень і послідовностей. В іншому варіанті, де застосовується PCR реакція, може використовуватися ген дикого типу або інший ген. У цьому випадку використовують первинний ген (наприклад, ген дикого типу, ген, що кодує всю оптимізовану послідовність або консенсусну послідовність, отриману, наприклад, в результаті зіставляння гомологічних послідовностей із різних організмів). У цьому варіанті використовують олігонуклеотиди, які відповідають варіантним положенням і містять різні амінокислоти із бібліотеки. PCR реакцію проводять, використовуючи на кінцях PCR-праймери. Це дає подвійний виграш: по-перше, в загальному випадку це потребує меншу кількість олігонуклеотидів і може давати менше помилок, а по-друге, має переваги у проведенні експерименту, оскільки при використанні гену дикого типу відпадає необхідність його синтезувати. Мутантні CKI-поліпептиди можуть братися від будь-якої кількості організмів, причому особливо кращими є CKI-поліпептиди від рослин. До числа підходящих для цього рослин належать, наприклад, вищі рослини, котрі можуть використовуватися в методах трансформації, включаючи односім’ядольні і двосім’ядольні рослини, а також деякі нижчі рослини, наприклад водорості. Це можуть бути також рослини різноманітних рівнів плоїдності, включаючи поліплоїдні, диплоїдні і гаплоїдні. У деяких конкретних варіантах здійснення винаходу підходящими рослинами є Brassica napus, Arabidopsis thaliana, Glycine max, кукурудза, рис, пшениця, люцерна, бавовна, тополя і т. п. Як зазначалося вище, мутантні CKI-поліпептиди згідно з даним винаходом є домінантними негативними антагоністами CKI-поліпептидів дикого типу. У деяких варіантах здійснення винаходу мутантний CKI-поліпептид фізично взаємодіє лише з одним або обома його відповідними білками – CDK або цикліном (тобто, з ендогенним, природного походження CDK або цикліновим білком від виду, із котрого був створений даний CKI-мутант) таким чином, що мутантний CKI-білок, котрий міститься в CDK/цикліновому комплексі, захищає інгібування CDK/циклінкінази, яке чинить CKI-білок дикого типу. В альтернативному варіанті, що не є взаємовиключним, мутантний CKI-поліпептид фізично взаємодіє лише з одним або обома гетерологічними білками – CDK або цикліном (тобто, з CDK або цикліновим білком природного походження від виду, який відрізняється від виду, із якого був створений даний CKI мутант), таким чином, що гетерологічний CDK/цикліновий комплекс, котрий містить даний мутантний CKI, захищається від інгібування CDK/циклінкінази, яке чиніть CKI-білок дикого типу, котрий відповідає CDK і цикліновому білкам у цьому комплексі (тобто, CKI-білок дикого типу, ендогенний до CDK і циклінового білків). У деяких варіантах здійснення винаходу мутантні CKI-поліпептиди згідно з даним винаходом є високоспецифічними антагоністами відповідного CKI-білка дикого типу. В альтернативних варіантах мутантні CKI-поліпептиди згідно з даним винаходом є специфічними антагоністами більш ніж одного CKI-поліпептиду дикого типу. Наприклад, мутантний CKI-поліпептид виду Arabidopsis може бути специфічним антагоністом лише CKI-поліпептиду дикого типу виду Arabidopsis або специфічим для CKI-поліпептидів дикого типу таких видів, як Arabidopsis, Brassica napus, Glycine max, кукурудза, рис, бавовна і/або тополя. Мутантний CKI-поліпептид виду Brassica також може бути специфічним антагоністом лише CKI-поліпептиду дикого типу виду Brassica або є антагоністом для Arabidopsis, Brassica napus, Glycine max, кукурудзи, рису, пшениці, люцерни, бавовни і/або тополі дикого типу. Мутантні CKI-поліпептиди демонструють суттєво знижену біологічну активність порівняно з CKI-поліпептидами дикого типу, включаючи, наприклад, модифіковане зв’язування з CDK або цикліновим білком і знижене інгібування CDK/циклінкіназних комплексів. Така знижена 16 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біологічна активність може бути перевірена та оцінена за допомогою випробувань in vivo і/або in vitro. Підходящими для цього видами випробувань є, наприклад, випробування на CDK/циклінкіназну активність, випробування на зв’язування з CDK або цикліном та випробування на клітинну проліферацію. Значне зниження біологічної активності порівняно з CKI-поліпептидом дикого типу означає, що біологічна активність варіантного CKI-поліпептиду є меншою принаймні 80%, меншою принаймні 70%, у кращому варіанті – меншою 60 % або меншою 50%, у ще кращому варіанті – меншою 40% або меншою 30%, а в ще кращому варіанті – меншою 20% або меншою 10% активності відповідного CKI-поліпептиду дикого типу. У деяких варіантах здійснення винаходу мутантний CKI-поліпептид може містити модифікацію порівняно з CKI-поліпептидом дикого типу, яка є додатковою до тих, що окреслені в даному описі (тобто, мутантні CKI білки можуть містити додаткові модифікації порівняно з відповідним CKI-білком дикого типу, відмінні від тих, що використовуються для створення домінантних негативних білків). Такими модифікаціями можуть бути, наприклад, амінокислотні заміщення, введені для того, щоб зробити можливою експресію в розчиненому стані в E. Coli, та амінокислотні заміщення, введені для оптимізації властивостей розчину. Крім того, як зазначено в даному описі, будь-яка із окреслених тут мутацій може бути скомбінована будь-яким чином для створення додаткових варіантних CKI-поліпептидів. Крім того, мутантні CKI-поліпептиди згідно з винаходом можуть створюватися більшої довжини, ніж відповідний білок дикого типу, наприклад, шляхом додавання епітопу або міток очистки, додавання інших злитих послідовностей і т. п., або ж можуть мати меншу довжину. Ідентифікація мутантних CKI-поліпептидів може проводитися також в тому їхньому стані, який вони мають після кодування мутантними CKI нуклеїновими кислотами. У випадку нуклеїнової кислоти загальна ідентичність нуклеїнокислотної послідовності є співрозмірною з ідентичністю амінокислотної послідовності, але приймає в розрахунок виродженість у генетичному коді і зсув кодонів різних організмів. Відповідно до цього, ідентичність нуклеїнокислотної послідовності може бути як нижчою, так і вищою, але як правило є нижчою ідентичності білкової послідовності. Цілком зрозуміло, що завдяки виродженості генетичного коду може виготовлятися дуже велика кількість нуклеїнових кислот, що кодують мутантні CKI-поліпептиди згідно з винаходом. Отже, ідентифікувавши певну амінокислотну послідовність, можна виготовити будь-яку кількість різних нуклеїнових кислот, що кодують мутантний білок, шляхом простої модифікації послідовності одного чи більше кодонів таким чином, щоб не змінювати амінокислотну послідовність мутантного CKI-поліпептиду. Мутантні CKI-поліпептиди і нуклеїнові кислоти згідно з винаходом у кращому варіанті є рекомбінантними (якщо вони не одержуються шляхом синтезу). Як зазначалося вище, мутанти як правило одержують шляхом сайт-специфічного мутагенезу нуклеотидів у ДНК, що кодує відповідний CKI-білок за допомогою кластерного або PCR-мутагенезу чи іншого методу, добре відомого фахівцям у даній галузі, в результаті чого виготовляють ДНК, що кодує мутант, а потім експресують цю ДНК у рекомбінантній клітинній культурі. Амінокислотні послідовності мутантів характеризуються передбачуваною природою мутації, тобто ознакою, що відокремлює їх від алельних або міжвидових варіацій амінокислотної послідовності мутантного CKI-білка природного походження. Як у загальних рисах зазначалося вище, ці варіанти зазвичай демонструють подібне зв’язування як з CDK-, так і з цикліновим білком (відповідно до цього, порівняно з відповідним CKI-білком дикого типу, мутант показує значне зниження його інгібіторної активності; хоча можуть бути вибрані також варіанти, які мають додаткові варіантні характеристики). У той час як сайт або ділянка для введення варіації амінокислотної послідовності є наперед заданими, мутація по суті не потребує попереднього визначення. Наприклад, для оптимізації виконання мутації в заданому сайті може проводитися безладний мутагенез на цільовому кодоні або цільовій ділянці, а експресовані варіантні CKI-білкі можуть піддаватися скринінгу за оптимальною комбінацією бажаної активності. Методи для виконання мутацій шляхом заміщень у цільових сайтах у ДНК з відомою послідовністю є добре відомими фахівцям у даній галузі; це є, наприклад, мутагенез з праймером M13 і PCR-мутагенез. Скринінг мутантів проводять шляхом випробувань мутантних CKI-білків на оптимальність їхніх характеристик активності. У деяких варіантах здійснення винаходу амінокислотні заміщення проводять на поодиноких залишках. В інших варіантах заміщують множину амінокислотних залишків (де можуть заміщуватися, наприклад, 2, 3, 4 і більше амінокислот). У вставках зазвичай бере участь від 1 до 20 амінокислот, хоча цілком припустимою є і більша їх кількість. Кількість делецій лежить в інтервалі, як правило, від 1 до 20 залишків, або від 1 до 30 залишків, хоча в деяких випадках делецій може бути набагато більше. У деяких варіантах здійснення винаходу мутантними CKI 17 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептидами є химери, одержані із двох і більше CKI-білків дикого типу принаймні з однією модифікацією на ділянці зв’язування з CDK або цикліном, як зазначено в даному описі. Для одержання бажаного мутанта застосовуються заміщення, делеції, вставки або будь-які. У загальному випадку модифікацію (або модифікації) проводять на порівняно невеликій кількості амінокислот для того, щоб звести до мінімуму зміну даної молекули. Проте в деяких випадках можливими є і більші зміни. Використовуючи згідно з винаходом нуклеїнову кислоту, що кодує мутантний CKIполіпептид, можуть створюватися найрізноманітніші вектори. У практичному здійсненні даного винаходу може використовуватися будь-який вектор, що містить реплікон і контрольну послідовність, виведені із виду, сумісного з клітиною-хазяїном. Це можуть бути або екстрахромосомні вектори, що самореплікуються, або вектори, що інтегруються в геном-хазяїн. У загальному випадку вектори експресії містять транскрипційну і трансляційну регуляторні нуклеїнокислотні ділянки, оперативно зв’язані з нуклеїновою кислотою, що кодує мутантний CKI-поліпептид. Термін "контрольні послідовності" означає послідовності ДНК, необхідні для експресії оперативно зв’язаної кодувальної послідовності в конкретному організмі-хазяїні. Контрольні послідовності, які є підходящими для прокаріотів, містять, наприклад, промотор, у разі потреби – операторну послідовність, і сайт зв’язування з рибосомою. Транскрипційна і трансляційна регуляторна ділянки нуклеїнової кислоти у загальному випадку є підходящими для клітини-хазяїна, що використовується для експресії поліпептиду. У деяких варіантах здійснення винаходу нуклеїнові кислоти CKI-білка є модифікованими для підсилення експресії гена у клітині-хазяїні за допомогою оптимізації кодону, яка залучає у себе заміщення послідовності кодона трансляційним кодоном (що відповідає тій самій амінокислоті), який широко використовується у виді клітини в котрій повинна експресуватися дана молекула ДНК. На Фіг. 3 показані приклади послідовностей кодування BnKrp1 мутанта (BnKrp1 F151A; F153A і Y149A; F151A; F153A), які були оптимізовані для експресії в кукурудзі. Загальні процедури оптимізації кодонів є добре відомими в даній галузі і можуть ефективно використовуватися для одержання інших кодон-оптимізованих послідовностей Krp1-мутантів відповідно до даного винаходу. Відомо чимало типів векторів експресії і регуляторних послідовностей, підходящих для різноманітних клітин-хазяїнів. У загальному випадку транскрипційні і трансляційні регуляторні послідовності можуть включати у себе, наприклад, промоторні послідовності, рибосомні зв’язувальні сайти, транскрипційні старт- і стоп-послідовності, трансляційні старт- і стоппослідовності, а також енхансерні або активаторні послідовності. У типових варіантах здійснення даного винаходу регуляторні послідовності містять промоторні і транскрипційні старт- і стоп-послідовності. Вектори зазвичай включають у себе також полілінкерну ділянку, що містить декілька сайтів рестрикції для інсерції чужорідної ДНК. Конструкцію підходящих векторі, що містять ДНК, яка кодує послідовності реплікації, регуляторні послідовності, гени добору за фенотипом і потрібні варіантні ДНК CKI-білків, створюють за допомогою стандартних методів рекомбінантних ДНК. Відокремлені плазміди, вірусні вектори і фрагменти ДНК розщеплюють, складають одни з одним і з’єднують у специфічному порядку для створення бажаних векторів, використовуючи для цього звичайні засоби і процеси, добре відомі фахівцям у даній галузі, див., наприклад, (Maniatis, supra, and Sambrook et al., supra). Промоторні послідовності кодують конститутивні або індуцибельні промотори. Промотори можуть бути природного походження або гібридними. Відомими є також гібридні промотори, які об’єднують у собі елементи більш ніж одного промотора і які також можуть використовуватися в даному винаході. В одному з типових варіантів здійснення винаходу використовуються сильні промотори, що дозволяють проводити високу експресію в клітинах і, зокрема, в клітинах рослин. Нижче описані промотори, котрі є особливо підходящими для застосування відповідно до даного винаходу. Вектор експресії, крім того, може містити додаткові елементи. Так, наприклад, вектор експресії може мати дві системи реплікації, дозволяючи таким чином підтримувати процеси реплікації у двох організмах, наприклад, в рослинних клітинах або клітинах комах для експресії і в прокаріотичному хазяїні для клонування та ампліфікації. Крім того, для інтегрування векторів експресії вектор експресії містить принаймні одну послідовність, гомологічну геному клітинихазяїна, а в кращому варіанті – дві гомологічні послідовності, що фланкують конструкцію експресії. Вектор інтегрування може бути спрямований на специфічний локус у клітині-хазяїні шляхом добору підходящої гомологічної послідовності для включення її у даний вектор. Конструкції для інтегрування векторів є добре відомими в даній галузі. У деяких варіантах здійснення винаходу вектор експресії містить маркерний ген селекції, який дозволяє проводити добір трансформованих клітин-хазяїнів. Гени селекції є добре 18 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відомими в даній галузі і можуть бути різними в залежності від використовуваної клітинихазяїна. Підходящими генами селекції можуть бути, наприклад, гени, що кодують на стійкість до ампіциліну і/або тетрацикліну, яка дозволяє трансформованим цими векторами клітинам рости при наявності цих антибіотиків. В одному з варіантів здійснення даного винаходу мутантну нуклеїнову кислоту CKI-білка вводять у клітину відокремлено або в комбінації з вектором. Під виразом "введений у..." та іншими його граматичними еквівалентами тут мається на увазі, що дані нуклеїнові кислоти вводяться в клітини шляхом, підходящим для наступної інтеграції, ампліфікації і/або експресії даної нуклеїнової кислоти. Вибір відповідного методу введення визначається, головним чином, типом клітини-мішені. Серед підходящих для такої операції методів можна назвати, наприклад, CaPO4 преципітацію, злиття ліпосом, метод ліпофектину®, електропорацію, вірусне інфікування тощо. Методи, що є особливо підходящими для введення нуклеїнових кислот у рослинні клітини, добре відомі фахівцям у даній галузі і більш докладно описані нижче (див. Розділ ІІ, "Трансгенні рослини"). До числа цих методів входять, наприклад, бомбардування клітин мікрогарматами, зарядженими ДНК. Нуклеїнові кислоти мутантних CKI-білків можуть інтегруватися в геном клітини-хазяїна або ж можуть існувати в перехідному чи стабільному стані у цитоплазмі (наприклад, при застосуванні традиційних плазмід і стандартних регуляторних послідовностей, маркерів селекції і т.п.) Прокаріоти можуть використовуватися в ролі клітин-хазяїнів для проведення початкових стадій клонування згідно з винаходом. Вони є особливо підходящими для швидкого продукування великих кількостей ДНК, для продукування одноланцюгових матричних ДНК, що використовуються в сайт-спрямованому мутагенезі, в одночасному скринінгу великої кількості мутантів і в секвенуванні ДНК створених мутантів. Серед підходящих прокаріотичних клітинхазяїнів можна назвати, наприклад, E. coli K12 штам 94 (ATCC No. 31,446), E. coli штам W3110 (ATCC No. 27,325) E. coli X1776 (ATCC No. 31,537) і E. coli B. Проте в ролі хазяїнів можуть використовуватися також багато інших штамів E. coli, включаючи такі штам, як HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, а також багато інших видів і родів прокаріотів, включаючи бацили на зразок Bacillus subtilis, інші кишечні бактерії, такі як Salmonella typhimurium і Serratia marcesans, та інші види Pseudomonas species. Прокаріотичні або інші клітини-хазяїни з жорсткими клітинними стінками є зазвичай трансформованими за допомогою хлориду кальцію, як описано в розділі 1.82 книги (Sambrook et al., supra). В альтернативному варіанті для трансформації цих клітин можна використовувати метод електропорації. Методи трансформації прокаріотів описані, наприклад, в роботах (Dower, in Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. EnymoL, 204:63, 1991). Серед плазмід, які зазвичай використовуються для трансформування клітин E. coli, можна назвати, наприклад, pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCIlS, pUCl 19 і Bluescript M13, опис котрих можна знайти в розд. 1.121.20 праці (Sambrook et al., supra). Поряд з переліченими вище доступними є також багато інших підходящих векторів. Мутантні CKI-поліпептиди згідно з винаходом отримують як правило шляхом культивування клітини-хазяїна, трансформованої вектором експресії, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує мутантний CKI-поліпептид, в умовах, що відповідають індукуванню або викликанню експресії мутантного CKI-поліпептиду. Для модулювання цитокінезу, CKI-білок експресують в його нормальній внутрішньоклітинній формі. Для застосувань даного винаходу, до котрих входить збирання або відокремлення мутантного CKI-поліпептиду, CKI-мутант можна експресувати у формі внутрішньоклітинного білка або, в альтернативному варіанті, у формі, що секретується із клітини-хазяїна. Багато еукаріотичних білків у природному стані секретуються клітинами, які містять ендогенну сигнальну послідовність секреції у формі частини амінокислотної послідовності. Таким чином, білки, котрі в нормальному стані зустрічаються в цитоплазмі, можуть вибиратися як мішені для секреції шляхом зв’язування сигнальної послідовності з даним білком. Це легко здійснюється шляхом лігування ДНК, що кодує сигнальну послідовність, з 5'кінцем ДНК, що кодує даний білок, а потім експресування цього злитого білка у відповідній клітині-хазяїні. ДНК, що кодує сигнальну послідовність, може отримуватися як фрагмент рестрикції із будь-якого гена, що кодує білок з сигнальною послідовністю. Таким чином, прокаріотичні, дріжджові та еукаріотичні сигнальні послідовності можуть використовуватися в цих цілях залежно від типу клітини-хазяїна, що використовується в конкретному застосуванні даного винаходу. Відомими є ДНК та амінокислотна послідовність, що кодують частину сигнальної послідовності декількох еукаріотичних генів, включаючи, наприклад, людський гормон росту, проінсулін і проальбумін (Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman and Company, New York, NY, 1988, p.769), і можуть використовуватися як сигнальні послідовності у відповідних еукаріотичних клітинах-хазяїнах. Дріжджові сигнальні послідовності, такі як кисла фосфатаза 19 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Arima et al., Nuc. Acids Res. 11:1657,1983), α-фактор, лужна фосфатаза та інвертаза можуть використовуватися для прямої секреції із дріжджових клітин-хазяїнів. Прокаріотичні сигнальні послідовності із генів, що кодують, наприклад, LamB або OmpF (Wong et al., Gene 68:193,1988), MalE, PhoA або бета-лактамазу, а також інших генів, можуть використовуватися для націлювання на білки, що експресуються у прокаріотичних клітинах у культуральне середовище. Умови, підходящі для екпресії мутантного CKI-поліпептиду, можуть варіювати в широких межах у залежності від вибраних вектора експресії і клітини-хазяїна і можуть були легко скориговані фахівцем у даній галузі шляхом рутинного експериментування. Наприклад, використання конститутивних промоторів у векторі експресії потребує оптимізації росту і проліферації клітини-хазяїна, в той час як використання індуцибельного промотора потребує умов росту, що відповідають індукції. Крім того, у деяких варіантах здійснення винаходу важливою є синхронізація збирання продукту. Наприклад, бакуловірусні системи, що використовуються в експресії в клітинах комах, є літичними вірусами, у зв’язку з чим вибір відповідного часу збирання продукту може бути важливим чинником продуктивності процесу. Промоторами, які найбільш широко застосовуються в прокаріотичних векторах, є pлактамазні (пеніциліназні) і лактозні промоторні системи (Chang et al., Nature 375:615, 1978; Itakura et al., Science 198:1056, 1977; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), а також триптофанова (trp) промоторна система (Goeddel et al., Nucl Acids Res. 8:4057, 1980; EPO Appl. Publ. No. 36,776) і лужнофосфатазні системи. Поряд з цими, найбільш популярними, промоторними системами застосування на практиці знаходять також інші мікробні промотори. Опубліковані дані стосовно нуклеотидних послідовностей цих систем дозволяють здійснювати їх функціональне лігування в плазмідні вектори (Siebenlist et al., Cell 20:269, 1980). Ілюстрацією чутливої до зовнішніх сигналів промоторної системи, яка може використовуватися при практичному здійсненні даного винаходу, є глутатіон-S-трансферазна (GST) система у кукурудзі. GST-ферменти є здатними детоксифікувати цілий ряд гідрофобних електрофільних сполук, які часто використовуються як досходові гербіциди (Weigand et al., Plant Molecular Biology 7:235-243, 1986). Дослідження показують, що GST-ферменти безпосередньо залучаються до надання цієї збільшеної гербіцидної толерантності. Даний ефект опосередковується в першу чергу специфічним 1.1 п.н. продуктом транскрипції мРНК. Кількома словами поясненням цьому є те, що кукурудза має вже наявний у неї ген природного походження, що мовчить, який може відповідати на зовнішні стимули і може бути індукований на вироблення генного продукту. Цей ген на сьогоднішній день ідентифікований і клонований. Таким чином, в одному з варіантів здійснення даного винаходу промотор видаляють із чутливого GST-гена і приєднують до послідовності, що кодує мутантний CKI-білок. Якщо мутантний CKI-ген виводять із геномної ДНК, то необхідно видаляти нативний промотор під час конструювання химерного гена. Таким чином, цей рекомбінований ген складається із промотора, що реагує на зовнішній хімічний стимул, і гена, відповідального за успішне продукування мутантного CKI-білка. Індуцибельним промотором є такий промотор, який є здатним прямо чи непрямо активувати транскрипцію принаймні однієї послідовності ДНК або гена у відповідь на сигнал індуктора. За відсутності індуктора послідовності ДНК або генів не транскрибуються. Як правило, білковий фактор, котрий зв’язується з індуцибельним промотором для активації транскрипції, перебуває в неактивній формі, яка після цього прямо чи непрямо перетворюється на активну форму індуктором. Індуктором може бути хімічний агент, такий як білок, продукт обміну речовин, регулятор росту, гербіцид або фенольна сполука чи фізіологічний стрес, викликаний безпосередньо теплом, холодом, сіллю або токсичними елементами, або непрямо – дією патогена чи хвороботворного агента, наприклад вірусу. Рослинна клітина, що містить індуцибельний промотор, може піддаватися дії індуктора зовнішнім його впливом на клітину або рослину, наприклад розпорошуванням, поливом, нагрівом тощо. Активувати експресію генамішені бажано до певного часу протягом розвитку рослини і, таким чином, індуктор може вчиняти свою дію у цей час. Такого роду індуцибельними промоторами можуть бути, наприклад, теплоударні промотори, такі як індуцибельний 70KD теплоударний стимулятор із Drosphilia melanogaster (Freeling et al., Ann. Rev. of Genetics 19:297-323); холодоіндуцибельні промотори, такі як холодоіндуцибельний стимулятор із B. napus (White et al., PlantPhysiol 106,1994); або алкоголь-дегідрогеназний промотор, який індукується етанолом (Nagao et al., Surveys of Plant Molecular and Cell Biology Vol. 3, p 384-438, BJ. Miflin ed., Oxford University Press, Oxford, 1986). Конститутивним є промотор, здатний прямо або непрямо активувати транскрипцію принаймні однієї послідовності ДНК або гена в усіх тканинах трансгенної рослини. Зазвичай як конститутивний використовують промотор 35 S CaMC (Odell, Nature 313:810-812,1985). 20 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 Конститутивними промоторами для рослин можуть служити також актиновий промотор рису (Elroy et al., Plant Cell 2:163-171,1990), гістон HE кукурудзи (Lepetit et al., Mol Gen. Genet 231:276285, 1992) і т. п. CKI-трансгени згідно з винаходом можуть експресуватися при використанні такого промотора, як BCEA (B. campestris embryo), котрий є здатним спрямовувати високі рівні експресії на дуже ранніх стадіях розвитку насінини (тобто, транскрибується перед напіновим промотором). Це є період перед збиранням продукту для зберігання але швидкого біосинтезу пігменту в насінині Brassica (виведеної із Johnson-Flanagan et al., J. Plant Physio I. 136:180, 1989; Johnson-Flanagan et al., Physiol Plant 81:301, 1991). Було також показано, що промотори запасних білків насінини спрямовують високий рівень експресії специфічним для насінини чином (Voelker et al., Plant Cell 1:95, 1989; Altenbach et al., Plant Mol. Biol. 13:513, 1989; Lee et al., Proc, Natl Acad. Sci. USA 99:6181, 1991; Russell et al., Transgenic Res. 6:157-68, 1997). Повідомлялося, що тенапіновий промотор спрямовує експресію олеозинового гена в трансгенній Brassica таким чином, що олеозин акумулюється приблизно до 1 % від загального білка насінини (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 99:6181, 1991). При вибиранні промотора може бути бажаним використовувати тканино-специфічний або регульований у процесі розвитку промотор, який дозволяє на супресію або надекспресію в одних тканинах, не впливаючи на експресію в інших тканинах. "Тканино-специфічні промотори" стосуються кодувальних ділянок, котрі спрямовують експресію гена в першу чергу в специфічні тканини, такі як корені, листя, стеблини, маточки, пиляки, пелюстки квіток, оболонку насінини, ядро насінини або в епідермальні шари. Стимулятори, енхансери або активатори транскрипції можуть бути інтегровані у тканино-специфічні промотори і таким чином створювати промотори з високим рівнем активності, що зберігає специфічність тканини. Наприклад, бажано, щоб промотори, використовувані в надекспресії, були тканино-специфічними. Надекспресія в тканинах, в яких вона є непотрібною, наприклад у листі, в разі спроб здійснювати надекспресію в місцях зберігання насіння, може бути руйнівною. Особливо підходящими є такі промотори, які дозволяють, наприклад, здійснювати насінино-специфічну, коренево-специфічну, листяноспецифічну, плідо-специфічну та інші специфічні форми експресії. Це може бути особливо корисним, оскільки насіння, коріння, листя і плоди є особливо цікавими об’єктами рослинництва. На сьогоднішній день вже є доступними або можуть бути виділені за допомогою добре відомих методів деякі промотори, специфічні для різноманітних типів тканин, див., наприклад, (U. S. Patent №№ 5,792,925; 5,783,393; 5,859,336; 5,866,793; 5,898,096; 5,929,302), а також текст нижче. У Табл. 1 поданий перелік ембріон-специфічних промоторів, які можуть використовуватися на практиці в даному винаході. 35 Таблиця 1 Ембріонально-специфічні промотори Промотор Ембріон Олеозин із Arabidopsis Сильний, однорідний USP із Vicia faba Сильний, однорідний Легумін із Vicia faba Сильний, кращий у сім’ядолях Альбумін S2 Синхронізація Дуже мало даних, від високої ранньої до Ні пізньої котиледонної стадії На ранній стадії не Ні відомий, сильний на пізній котиледон. На ранній стадії не Алейроновий відомий, сильний на шар (пізній) пізній котиледон. Посилання Al et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205, 1994. Baumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225:459467, 1991. Baumlein et al., supra 1991. ? Напін із Brassica Альбумін S1 із Arabidopsis Ендосперм Тільки в головній стеблині У головній стеблині і сім’ядолях Пізня стадія Kohno-Murase, Plant Mol. Biol. 26:11151124, 1994 Ні Від ранньої до пізньої котиледонної стадії Guerche et al., Plant Cell 2:469-478, 1990 Ні Від ранньої до пізньої котиледонної стадії Guerche et al., supra, 1990. 21 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для деяких варіантів здійснення даного винаходу важливо мати в розпорядженні насіниноспецифічний промотор, який є особливо активним під час ембріонального розвитку незрілої насінини рослини. Може потребуватися така експресія домінантного негативного мутанту згідно з винаходом, щоб на ранній стадії розвитку насінини відбувалося зростання цитокінезу. Підвищений цитокінез на цій стадії може давати ембріони більших розмірів. Ембріон на 33% складається з олії. Отже при більших розмірах ембріон буде мати і більший вміст у ньому олії. Для збільшення вмісту олії в насінині підходящим промотором був би такий, який би забезпечував експресію даного винаходу в ембріоні за низької або нульової експресії в інших тканинах рослини. У зв’язку з цим, особливо цікавими є такі промоторні послідовності, які ініціюють експресію при ранньому фазоспецифічному розвитку ембріону. Раннім фазоспецифічним промотором є такий, що ініціює експресію білка в період до 7 дня після запилення (тростиною) в Arabidopsis або на еквівалентній стадії в інших рослинних видах. Такими особливо цікавими промоторними послідовностями є, наприклад, промотор для амінокислотного пермеазного гена (AAP1) (наприклад, AAP1 промотор із Arabidopsis thaliana) промотор для олеат-12-гідроксилаза:десатуразного гена (наприклад, промотор під позначенням LFAH12 із Lesquerella fendleri), промотор для 2S2 альбумінового гена (наприклад, 2S2 промотор із Arabidopsis thaliana), промотор гена жирнокислої елонгази (FAE1) (наприклад, FAE1 промотор із Arabidopsis thaliana), промотор листяного котиледонового гена (LEC2) (наприклад, the LEC2 промотор із Arabidopsis thaliana). Промотори AAP1, LFAH12, 2S2 і FAE1 є неактивними на найранній стадії ембріонального розвитку. Вони набувають транскрипційної активності на більш пізніх стадіях розвитку по черзі, починаючи від AAP1, слідом за яким йдуть LFAH12, 2S2, а потім FAB. Після цього на більш пізніх стадіях ембріонального розвитку всі чотири промотори залишаються активними. Промотор LEC2 має інверсний профіль експресії. Він є активним на дуже ранній стадії ембріонального розвитку, після чого на більш пізніх стадіях його активність поступово знижується. Серед інших цікавих ембріон-специфічних промоторів можна зазначити промотори із таких генів: Seedstick (Pinvopich et al., Nature 424:85-88, 2003), Fbp7 і Fbpll (Petunia Seedstick) (Colombo et al., Plant Cell 9:703-715, 1997), Banyuls (Devic, Plant J., 19:387-398, 1999), ABI3 (Ng et al., Plant. Mol. Biol. 54:25-38, 2004), agl-15, Agl18 (Lehti-Shiu et al., Plant Mol. Biol. 58:89-107, 2005), Phel (Kohler, Genes Develop. 17:1540-1553, 2003), emb175 (Gushing et al., Planta. 221:424-436, 2005), Ll1 (Kwong et al., Plant Cell 15:5-18, 2003), Lec1 (Lotan, Cell 93:11951205,1998), Fusca3 (Kroj et al., Development 130:6065-6073, 2003), TT12 (Debeaujon et al., Plant Cell 13:853-871,2001), TT16 (Nesi et al., Plant Cell 14:2463-2479, 2002), A-RZf (Zou and Taylor, Gene 196:291-295, 1997), TTG1(Walker et al., Plant Cell 11:1337-1350,1999), TΤ1 (Sagasser et al., Genes Develop. 16:138-149, 2002), TT8 (Nesi et al., Plant Cell 12:1863-1878, 2000) і Gea-8 (морква) (Lin et al., J. Exp. Botany 50:1139-1147, 1999). Ембріон-специфічними промоторами із однодольних рослин є, наприклад, глобулін, Knox (рис) (Postma-Haarsma, Plant Mol. Biol. 39:257271, 1999), олеозин (Plant, Plant Mol. Biol. 25:193-205,1994), Keddie, Plant Mol. Biol. 24:327-340, 1994), пероксиредоксин (Perl) (Haslekas et al., Plant Mol. Biol. 36:833-845, 1998; Haslekas et al., Plant Mol. Biol. 53:313-326, 2003), HvGAMYB (Diaz et al., Plant J. 29:453-464, 2002) і SAD1 (IsabelLaMoneda et al., Plant J. 33:329-340, 1999) із ячменю і промотори пролінзбагачених білків кукурудзяного гібриду (Jose-Estanyol et al., Plant Cell 4:413-423, 1992; Jose-Estanyol et al., Gene 356:146-152, 2005). Особливо цікавими є також промотори запасних білків насіння, оскільки у багатьох рослин запасні білки насінини можуть складати до 90% її загального білку. Запасні білки насінини є жорстко регульованими й еспресуються майже виключно в насінні високоспецифічним чином з погляду тканин рослини і стадій її розвитку (Higgins et al., Ann. Rev. Plant Physiol 35:191-221, 1984; Goldberg et al., Cell 56:149-160, 1989). Крім того, різні запасні білки насінини можуть синтезуватися на різних стадіях розвитку насінини. Експресія насінино-специфічних генів була докладно досліджена, див. огляди в роботах (Goldberg et al., supra; Higgins et al., supra). Насінино-специфічним промотором є, наприклад, LFAH12 виду Arabidopsis та інших рослин і регуляторні 5'-ділянки олеозинового гена виду Arabidopsis, як описано в (Thomas et al., Патент США № 5,977,436), включеному тут в усій його повноті шляхом посилання. Цей промотор, перебуваючи в оперативному зв’язку з кодувальною послідовністю гетерологічного гена або з послідовністю, комплементарною до нативного рослинного гена, спрямовує експресію цього гетерологічного гена або цієї комплементарної послідовності в рослинній насінині. Підходящими промоторами запасних білків насіння двосім’ядольних рослин є, наприклад, бобовий β-фазоліновий, лектиновий і фітогемаглютиніновий промотори (Sengupta-Gopalan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-3324,1985; Hoffman et al., Plant Mol. Biol. 11:717-729, 1988; Voelker et al., EMBO J. 6:3571-3577, 1987); напіновий промотор із рапсового насіння (Radke et al., Theor. Appl. Genet. 75:685-694, 1988); гліциніновий і конгліциніновий промотори із 22 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 соєвих бобів (Chen et al., EMBO J. 7:297-302, 1988; Nielson et al., Plant Cell 1:313-328, 1989; Harada et al., Plant Cell 1:415-425, 1989; Beachy et al., EMBO J, 4:3047-3053, 1985); лектиновий промотор із соєвих бобів (Okamuro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8240-8244, 1986); промотор інгібітору трипсину Кунітца (Kunitz) із соєвих бобів (Perez-Grau et al., Plant Cell 1:10951109, 1989; Jofuku et al., Plant Cell 1:1079-1093, 1989); пататиновий промотор із картоплі (RochaSosa et al., EMBO J. 8:23-29, 1989); конвіциліновий, віциліновий і легуміновий промотори із гороху (Rerie et al., Mol. Gen. Genet. 259:148-157, 1991; Newbiginef et al., Planta 180:461-470, 1990; Higgins et al., Plant Mol. Biol. 11:683-695, 1988; Shirsat et al., Mol. Gen. Genetics 215:326331, 1989); і спораміновий промотор із солодкої картоплі (Hattori et al., Plant Mol. Biol. 14:595604, 1990). Для односім’ядольних рослин промоторами запасних білків насіння, корисними в практичному застосуванні даного винаходу, є, наприклад, зеїнові промотори із кукурудзи (Schernthaner et al., EMBO J. 7:1249-1255, 1988; Hofrman et al., EMBO J. 6:3213-3221, 1987 (15 кДа зеїн)); 18 кДа олеозиновий промотор із кукурудзи (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 888:6181-6185, 1991); восковий промотор; поморщений-1 промотор; глобуліновий-1 промотор; поморщений -2 промотор; глутеліновий промотор із рису; гордеїновий промотор із ячменю (Marris et al., Plant Mol. Biol. 10:359-366, 1988); RP5 (Su et al., J. Plant Physiol. 158:247-254, 2001); EBE1 і 2 промотори із кукурудзи (Magnard et al., Plant Mol. Biol. 53:821-836, 2003) і глутеніновий та гліадиновий промотори із пшениці (Патент США № 5,650,558; Colot et al., EMBO J. 6:35593564, 1987). Підходящими для практичного застосування даного винаходу є також промотори генів для ізоцитрателіази і малатсинтази виду B. napus (Comai et al., Plant Cell 1:293-300, 1989); дельта-9 десатурази із сафлору (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2578-2582, 1991) і кастору (Shanklin et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 88:2510-2514, 1991); білок-носій ацилу (ACP) із Arabidopsis (Post-Beittenmiller et al., Nucl. Acids Res. 17:1777,1989), B. napus (Safford et al., Eur. J. Biochem. 174:287-295, 1988) і B. campestris (Rose et al., Nucl. Acids Res. 15:7197, 1987); βкетоацил-ACP синтетаза із ячменю (Siggaard-Andersen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:41144118, 1991); та олеозин із кукурудзи (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6181-6185,1991), соєвих бобів (Генбанк, № X60773) і В. napus (Lee et al., Plant Physiol. 96:1395-1397, 1991). Фахівцям у даній галузі, без сумніву, відомі також інші промотори, котрі можуть використовуватися у практичному застосуванні даного винаходу. Крім того, для відокремлення інших промоторів, підходящих для застосування згідно з винаходом, можуть використовуватися добре відомі методи. Наприклад, для відокремлення промоторів, експресованих у специфічний час (розвитку рослини), наприклад під час розвитку плоду, можуть застосовуватися методи диференціального скринінгу. Промотори насінино-специфічних генів, оперативно зв’язані з гетерологічними кодувальними послідовностями в конструкціях химерних генів, підтримують також їхній часовий і просторовий профіль експресії в трансгенних рослинах. Прикладом цьому може служити застосування промотора гена запасного білка насіння 2S виду Arabidopsis thaliana в експресії енкефалінових пептидів у насінні Arabidopsis і B. napus (Vandekerckhove et al., Bio/Technology 7:929-932, 1989), лектинового і β-фазолінового промоторів із бобів в експресії люциферази (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57, 1989) та глутенінових промоторів із пшениці в експресії хлорамфеніколацетилтрансферази (Colot et al., supra). Для досягнення відповідного рівня експресії нуклеїнокислотних фрагментів згідно з даним винаходом може потребуватися застосування різних химерних генів, які використовують різні промотори. Такі химерні гени можна переносити в рослини-хазяїни разом в одному векторі експресії або послідовно за допомогою двох і більше векторів експресії. Крім того, для збільшення експресії гена згідно з даним винаходом часто потребуються або є корисними енхансери. Ці елементи повинні бути оперативно зв’язаними з послідовністю, що кодує бажані білки, а регуляторні елементи повинні бути операбельними. Енхансерами або енхансер-подібними елементами можуть бути нативні або химерні нуклеїнокислотні фрагменти. Для цього можуть потребуватися вірусні енхансери, наприклад такі, що спостерігалися у промоторі 35S (Odell et al., Plant Mol. Biol. 10:263-272, 1988), енхансери із відкритих генів (Fromm et al., Plant Cell 1:977-984, 1989) або енхансери із будь-якого іншого джерела, за умови, що поміщені у промотор, оперативно зв’язаний з нуклеїнокислотним фрагментом згідно з даним винаходом, вони будуть підвищувати транскрипцію. Такого роду конструкція може включати у себе, наприклад, промотор 35S із CaMV з енхансером подвоєння транскрипції, зв’язаним з нетрансльованою лідерною 5'-послідовністю вірусу тютюнового гравірування (TEV: Тютюн Etch Virus). Ця лідерна послідовність TEV діє як трансляційний енхансер, збільшуючи кількість білка, що виробляється. 23 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Підходящі промоторні елементи на зразок тих, що розглянуті в даному описі, можуть зливатися з мутантними CKI-нуклеїнокислотними послідовностями і підходящим термінатором (ділянкою поліаденілювання) згідно з добре відомою методикою. Трансгенні рослини Даним винаходом пропонуються також трансгенні рослини, що містять мутантний CKIтрансген. Трансгенні рослини, що експресують мутантний CKI-поліпептид, можуть отримуватися, наприклад, шляхом перенесення в потрібну рослину трансгенного вектора (наприклад, плазміди або вірусного вектора), що кодує мутантний поліпептид. Зазвичай коли вектором служить плазміда, цей вектор містить також маркерний ген, що піддається селекції, такий як неоміцинфосфотрансферазний II (nptIІ) ген, який кодує на стійкість до канаміціну. Найбільш поширений метод трансформації рослин здійснюється шляхом клонування цільового трансгена у вектор трансформації рослини, який після цього трансформують в Agrobacterium tumifaciens, що містить Ti-плазміду-хелпер, як описано в (Hoeckema et al., Nature 303:179-181, 1983). Клітини Agrobacterium, які містять цей трансгенний вектор, інкубують з нарізаними шматками листя рослини, що піддається трансформуванню, як описано в роботах (An et al., (Plant Physiology 81:301-305, 1986; Hooykaas, Plant Mol. Biol. 13:327-336, 1989). Трансформація культивованих рослинних клітин-хазяїнів зазвичай проводиться за допомогою Agrobacterium tumifaciens, як описано вище. Культури клітин-хазяїнів, які не мають жорстких бар’єрів із клітинних мембран, зазвичай трансформуються методом фосфату кальцію, уперше описаним у роботі (Graham et al., Virology 52:546,1978), і модифікуються, як описано в розділах 16.32-16.37 книги (Sambrook et al.,, supra). Проте для введення ДНК у клітини можуть застосовуватися також інші методи, наприклад, метод полібрену (Kawai et al., Mol. Cell. Biol. 4:1172, 1984), метод злиття протопласту (Schafmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163, 1980), метод електропорації (Neumann et al., 1982 EMBO J. 1:841, 1982) і прямої мікроін’єкції в ядро (Capecchi, Cell 22:479, 1980). Калюси трансформованої рослини можуть вибиратися за допомогою маркера, що піддається селекції, шляхом вирощування клітин на середовищі, яке містить, наприклад, канаміцин і відповідні кількості фітогормону, наприклад нафталіноцтової кислоти і бензиладеніну, для індукування калюсу і паростка. Після цього рослинні клітини піддають регенерації і отримані в результаті рослини переносять у ґрунт за допомогою добре відомих методів. У додаток до методів, описаних вище, існують також численні методи для перенесення клонованих ДНК у найрізноманітніші рослинні види, включаючи голонасінні і покритонасінні рослини, одно- і дво сім’ядольні рослини, див., наприклад, (Methods in Plant Molecular Biology, Glick and Thompson eds., CRC Press, Boca Raton, FL, 1993; Vasil, Plant Mol. Biol. 25:925937,1994; and Komari et al., Current Opinions Plant Biol 1:161-165,1998 (загальні огляди); Loopstra et al., Plant Mol. Biol. 15:1-9,1990; і Brasileiro et al., Plant Mol. Biol. 17:441-452,1991 (трансформація дерев); Eimert et al., Plant Mol. Biol. 19:485-490,1992 (трансформація культури Brassica); Hiei et al., Plant J. 6:271-282,1994; Hiei et al., Plant Mol. Biol. 35:205-218, 1997; Chan et al., Plant Mol. Biol. 22:491-506, 1993; Патенти США №№ 5,516,668 і 5,824,857 (трансформація рису); і Патенти США №№ 5,955,362 (трансформація пшениці); 5,969,213 (трансформація односім’ядольної рослини); 5,780,798 (трансформація кукурудзи); 5,959,179 і 5,914,451 (трансформація сої). Серед типових прикладів при цьому можна навести такі методи: полегшене електропорацією відбирання ДНК протопластами (Rhodes et al., Science 240:204207, 1988; Bates, Methods Mol. Biol. 111:359-366, 1999; D'Halluin et al., Methods Mol. Biol. 111:367373, 1999; Патент США № 5,914,451); обробку протопластів поліетиленгліколем (Lyznik et al., Plant Molecular Biology 13:151-161, 1989; Datta et al., Methods Mol. Biol., 111:335-334, 1999); і бомбардування клітин мікрогарматою, зарядженою ДНК (Klein et al., Plant Physiol. 91:440444,1989; Boynton et al., Science 240:1534-1538, 1988; Register et al., Plant Mol. Biol. 25:951-961, 1994; Barcelo et al., Plant J. 5:583-592,1994; Vasil et al., Methods Mol. Biol. 111:349-358, 1999; Christou, Plant Mol. Biol. 35:197-203, 1997; Finer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:59-80, 1999). Крім того, огляди щодо стратегії і методів трансформації рослин можна знайти в (Birch, Ann Rev Plant Phys Plant Mol. Biol. 48:297, 1997; Forester et al., Exp. Agric. 33:15-33, 1997). Незначні зміни в ці методи дозволяють пристосовувати їх до широкого діапазону рослинних видів. Для трансформації односім’ядольних видів найбільш широко застосовуваним є метод бомбардування частками. Проте, такі односім’ядольні, як кукурудза, можуть успішно трансформуватися також за допомогою методів Agrobacterium, описаних у (Hiei et. al., Патент США № 5,591,616). В іншому методі для трансформації односім’ядольних, наприклад, кукурудзи, змішують клітини із культур ембріогенної суспензії з суспензією волокон (5% мас./об., Silar SC-9 волокна) і плазміди ДНК (1 мкг/мл), і суміш поміщають у вертикальному положенні в 24 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 багатозразкову голівку вихорового міксера Vortex Genie II (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY, USA) або горизонтально у тримач міксера Mixomat зубної амальгами (Degussa Canada Ltd., Burlington, Ontario, Canada). Після цього проводять трансформацію шляхом перемішування на повній швидкості протягом 60 секунд (наприклад, міксером Vortex Genie ІІ) або шляхом струшування з фіксованою швидкістю впродовж 1 секунди (Mixomat). У результаті цього процесу створюються популяції клітин, із котрих відбирають стабільні трансформанти. Із цих стабільно трансформованих калюсів регенеруються рослини, і трансгенність цих рослин та їхнього потомства аналізують методом Саузерн-гібридизації. Головними перевагами цього методу є його простота і низька вартість. На відміну від бомбардування частками він не потребує застосування коштовного обладнання і витратних матеріалів. Інформацію стосовно використання волокон для трансформації рослинних клітин, зокрема кукурудзи, можна знайти, наприклад, у (Coffee et al., Патент США № 5,464,765). У патенті США (Dan et al., United States Patent № 5,968,830) описані процеси трансформування і регенерування сої. У патенті США (Hall et al., United States Patent № 5,969,215) описані методи трансформації для одержання трансформованих рослин Beta vulgaris, таких як цукровий буряк. Обидва вищезазначені методи трансформації мають свої переваги і недоліки. В обох цих методах за допомогою генної інженерії із плазміди створюють ДНК, яка містить не тільки цільовий ген, але також маркерні гени, які є придатними до їх селекції і скринінгу. Приданий до селекції маркерний ген використовується для добору лише тих клітин, які мають інтегровані копії плазмід (їхня конструкція є такою, що цільовий ген і придатні до селекції та скринінгу гени переносяться одним блоком). Придатний до скринінгу ген дає інший засіб перевірки на успішність культивування тільки тих клітин, які несуть цільові гени. Традиційна трансформація методом Agrobacterium стійкими до антибіотиків і придатними до селекції маркерами є проблематичною через публічну думку, що такі рослини несуть занадто великий ризик поширення толерантності до антибіотиків на тварин і людей. Такі антибіотичні маркери можна видалити із рослин шляхом трансформування цих рослин методами Agrobacterium, що є подібними методам, описаним в патенті США (Komari et al., United States Patent № 5,731,179). Прищеплення стійкості до антибіотиків можна також ефективно уникнути шляхом застосування кодувальних послідовностей bar або pat так, як описано в патенті США (United States Patent № 5,712,135). Ці кращі маркерні ДНК кодують другі білки або поліпептиди, що інгібують або нейтралізують дію інгібіторів глутамінсинтетази, гербіцидів фосфінотрицину (глюфозинату) і солі глюфозинатамонію (Basta, Ignite). Плазміду, що містить принаймні один із цих генів, вводять у рослинні протопласти або клітини калюсу за допомогою будь-якого із вищезгаданих методів. Якщо маркерний ген є придатним до селекції, то в умовах селекції відповідним фітотоксичним засобом виживають лише ті клітини, які мають вбудований у них пакет ДНК. Після того, як відповідні клітини ідентифіковані і поширені, рослини піддаються регенерації. Для підтвердження того, що пакет ДНК був успішно інтегрований у геном рослини, потрібно провести тестування потомства трансформованих рослин. Існує багато чинників, що впливають на успішність трансформації. Конструкція і будування егзогенного гена та його регуляторних елементів впливають на інтеграцію цієї егзогенної послідовності в хромосомну ДНК рослинного ядра і здатність трансгена експресуватися цією клітиною. Підходящий метод уведення даної конструкції егзогенного гена в ядро рослинної клітини з нелетальним результатом відіграє в цьому особливо важливу роль. Слід зауважити, що клітина, в котру вводиться дана конструкція, повинна, якщо відновленню підлягає цілком вся рослина, бути такого типу, який є придатним до регенерації, якщо в розпорядженні є відповідний протокол. Методи застосування Відповідно до іншого аспекту даного винаходу цитокінез в рослині є модульованим, наприклад, в напрямку зростання. Рослинними клітинами, придатними до модуляції, наприклад, зростання цитокінезу за допомогою описаних тут процесів, є такі, що експресують CKIполіпептид дикого типу, який має окремі ділянки зв’язування з цикліном і CDK. У загальному випадку ці методи включають у себе експресування в межах рослинної клітини мутантного CKIполіпептиду, як висвітлено в даному описі, і надання можливості мутантному CKI-поліпептиду інгібувати біологічну активність CKI дикого типу в межах рослинної клітини. Мутантний CKIполіпептид експресується із рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує мутантний білок. Крім того, у деяких варіантах здійснення винаходу запропонований метод включає у себе введення в рослинну клітину рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує мутантний CKIполіпептид. Рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що кодують мутантні CKI-поліпептиди, 25 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включаючи конструювання таких рекомбінантних молекул та їх уведення в рослинні клітини, в цілому описані вище і більш докладно розглянуті у Прикладах нижче. Модуляція цитокінезу може здійснюватися в рослинній клітині in vivo так, як описано вище стосовно трансгенних рослин. В альтернативному варіанті запропонований метод може здійснюватися в рослинній клітині in vitro. Як було зазначено вище, мутантний CKI-поліпептид містить CKI амінокислотну послідовність, котра має принаймні одну модифікацію відносно базового CKI-поліпептиду. З погляду процесу модуляції цитокінезу базовий CKI-поліпептид може бути рослинним CKIполіпептидом дикого типу, експресованим у межах рослинної клітини, в котрій повинна проводитися модуляція цитокінезу (зазвичай - ендогенним CKI-білком дикого типу). В альтернативному варіанті, оскільки використання мутантного CKI-білка згідно з даним описом може дозволити здійснювати домінантну негативну антагоністичну активність проти структурних гомологів або членів сімейства CKI-білків дикого типу, із котрих виводиться даний мутант, базовим CKI-поліпептидом може бути CKI-поліпептид дикого типу, гетерологічний CKIполіпептиду дикого типу, експресований рослинною клітиною і здатний забезпечувати практично еквівалентну функцію дикого типу. Таким чином, у деяких випадках мутантний CKIбілок, що не є одержаним із ендогенного CKI-білка, експресується в рослинній клітині для інгібування функції ендогенного CKI дикого типу (наприклад, мутантний CKI-поліпептид, виведений із KRP-білка дикого типу виду Arabidopsis thaliana, може використовуватися для інгібування функції KRP-білка дикого типу в негетерологічних рослинних клітинах таких видів, наприклад, як Brassica napus, Glycine max., кукурудза і т. п.). Можуть використовуватися також інші гетерологічні мутантні CKI-поліпептиди, виведені із інших рослин, таких як Brassica napus і т. п. Крім того, в деяких варіантах запропонованого методу за допомогою мутантного CKI згідно з винаходом у рослинній клітині одночасно інгібують множину споріднених CKI-білків. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу одночасно інгібують всі ендогенні CKI-білки, що належать до певного сімейства (наприклад, члени KRP-сімейства). Як зазначалося вище, мутантний CKI-білок згідно з викладеним у даному описі дозволяє здійснювати домінантну негативну антагоністичну активність у межах структурних гомологів або членів сімейств CKIбілків дикого типу, із котрих були одержані дані варіанти, дозволяючи цим здійснювати таке одночасне інгібування множини гомологів або членів сімейства. Таким чином, у типових варіантах втілення даного винаходу на практиці в рослинній клітині інгібуванню піддаються численні (а в кращому варіанті – всі) CKI-білки з практично ідентичними або подібними послідовностями в межах цільової ділянки зв’язування з CDK або цикліном. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу, де в межах ділянки зв’язування з CDK члени KRPсімейства за їхніми послідовностями мають високу взаємну ідентичність і де головним чином вони несуть відповідальність за інгібування циклін-CDK-кіназної активності, численні, а в кращому варіанті – всі, ендогенні члени KRP-сімейства в рослинній клітині піддаються інгібуванню шляхом експресії мутантного KRP CKI-білка таким чином, щоб модулювати цитокінез. Як зазначалося вище, модуляція цитокінезу в рослинній клітині здійснюється шляхом ефективного блокування інгібування ендогенними CKI-білками циклін/CDK-кіназної активності. Така модуляція включає у себе прискорення розвитку процесу клітинного циклу і, кінець кінцем, збільшення клітинної проліферації. Таким чином, шляхом застосування описаних тут методів in vivo (наприклад, в розділі Трансгенні рослини, див. вище) можна збільшувати вихід рослинної продукції з одиниці площі (врожайність) і/або величину зерна, підвищувати потужність рослин, збільшувати кореневу масу, величину плодів тощо. Збільшення врожайності може проявлятися в різноманітних формах залежно від специфічної рослинної тканини і рослинного виду, в котрому проводилася модуляція циклу рослинної клітини шляхом блокування інгібування ендогенними CKI-білками циклін/CDK-кіназної активності. У насіннєвих культурах, таких як кукурудза, рис, пшениця, ячмінь, соя, рапсове насіння, збільшення врожайності приймає форму збільшення загальної кількості насіння, збільшення величини зерна або збільшення того й іншого, тобто кількості насіння і величини зерна. В одному з варіантів здійснення винаходу збільшення врожаю досягають у трансгенних різновидів будь-яких насіннєвих культур шляхом експресування трансгена, що кодує мутантний CKI-білок, внаслідок чого зростає цитокінез і збільшуються загальна кількість насіння і/або величина зерен. В одному з варіантів здійснення винаходу експресію мутантного CKI-білкового трансгена регулюють за допомогою конститутивного промотора. В іншому типовому варіанті експресію мутантного CKI-білкового трансгена регулюють за допомогою насінино-специфічного 26 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 промотора, що націлює дію мутантного CKI-білка на насінину, яка з погляду агрономії є важливим компонентом даної насіннєвої культури. У випадку олійних насіннєвих культур, таких як соя, рапсове насіння, камелія, льон, кукурудза, сафлор, соняшник та інші, де кінцевим продуктом є олія, зростання врожаю приймає форму збільшення виходу олії на одну рослину. Олію отримують із ембріона в насінині. В одному з варіантів здійснення винаходу зростання виходу олії досягають у трансгенних різновидів будь-яких олійних насіннєвих культур шляхом експресування трансгена, що кодує мутантний CKI-білок, викликаючи цим зростання цитокінезу, що веде до збільшення загальної кількості насіння, збільшення величини ембріона або до того й іншого разом. У результаті збільшення загальної кількості насіння на рослину зростає і загальний вихід олії на рослину. У результаті збільшення величини ембріона зростає вміст олії в одній насінині, а отже і загальний вихід олії на одну рослину. В одному з кращих варіантів здійснення винаходу експресію мутантного CKI-білкового трансгена регулюють за допомогою ембріон-специфічного промотора, підвищуючи цим цитокінез на ранніх стадіях ембріонального розвитку, що приводить до збільшення розмірів ембріона, збільшення кількості олії в одній насінині і відповідного зростання загального виходу олії на одну рослину. Незернова біомаса є первинним продуктом виробництва таких культур, як люцерна, салат латук, тютюн, евкаліпт і тополя. Підвищення врожайності у таких культур бачиться у збільшенні загального росту рослини і в результаті цього - у збільшенні акумульованої в ній біомаси. В одному з варіантів здійснення винаходу збільшення біомаси досягається у трансгенних різновидах будь-яких культур даного спрямування шляхом експресування трансгена, що кодує мутантний CKI-білок, викликаючи цим зростання цитокінезу, що веде до збільшення росту і біомаси. В одному з варіантів здійснення винаходу експресію мутантного CKI-білкового трансгена регулюють за допомогою промотора, що дає конститутивну експресію мутантного CKI-білка, який кодує трансген у більшості тканин або в усіх тканинах даної рослини, а в кращому варіанті здійснення винаходу експресію мутантного CKI-білкового трансгена регулюють за допомогою тканино-специфічного промотора, що націлює експресію даного трансгена на важливий з погляду агрономії компонент даної рослини, такий як лист в салаті латук чи в тютюні, або стовбур в евкаліпті чи в тополі, для збільшення акумулювання біомаси в цільовій тканині. Цукор та целюлоза є первинними продуктами виробництва культур, які вирощуються для виробництва етанолу, тобто таких, як цукрова тростина, цукровий буряк, кукурудза і лозове просо. В одному з варіантів здійснення винаходу збільшення цукру в трансгенних різновидах цукроносних культур тобто таких, як цукрова тростина або цукровий буряк, досягають шляхом експресування трансгена, що кодує мутантний CKI-білок, викликаючи цим зростання цитокінезу, що веде до збільшення росту тканин, які акумулюють у рослині цукор, і збільшення загального вмісту цукру на рослину. В одному з варіантів здійснення винаходу експресію мутантного CKIбілкового трансгена в цукроносних рослинах регулюють за допомогою промотора, що дає конститутивну експресію мутантного CKI-білка, який кодує трансген у більшості тканин або в усіх тканинах даної рослини. В одному з кращих варіантів здійснення винаходу експресію мутантного CKI-білкового трансгена регулюють за допомогою тканино-специфічного промотора, що націлює експресію даного трансгена на тканини, що акумулюють у даній рослині цукор, тобто на стеблину в цукровій тростині або на корінь у цукровому буряку, збільшуючи цим проліферацію клітин і ріст запасу цукру та накопичувальної тканини рослини, що в результаті дає збільшення в ній загального вмісту цукру. В іншому варіанті здійснення винаходу збільшення целюлози досягають у трансгенних різновидах будь-яких целюлозоносних культур, таких як кукурудза або лозове просо, шляхом експресування трансгена, що кодує мутантний CKI-білок, викликаючи цим зростання цитокінезу і синтезу клітинних оболонок, що веде до збільшення вмісту целюлози, яка є компонентом цих клітинних оболонок. В одному з варіантів здійснення винаходу експресію мутантного CKI-білкового трансгена регулюють за допомогою промотора, що дає конститутивну експресію мутантного CKI-білка, який кодує трансген у більшості тканин або в усіх тканинах даної рослини. Внаслідок цього загальне зростання проліферації клітин приводить до збільшення нашаровувань в оболонках клітин і отже до збільшення загального вмісту целюлози в рослині. ПРИКЛАДИ Нижче наведені приклади, що ілюструють даний винахід, не вносячи в нього будь-яких обмежень. Приклад 1. Вироблення й очистка активного циклін:CDK-комплексу і Krp-молекул Клітини комах і живильні середовища 27 UA 97787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Бакуловірусна система експресії є багатоцільовою еукаріотичною системою для експресії гетерологічних генів. Ця система забезпечує правильну укладку білків, утворення дисульфідних зв’язків та інші важливі псоттрансляційні модифікації. Усі використовувані методики були взяті із підручника („Baculovirus expression vector system: Procedures and methods manual”, BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA. 6th ed.). Клітини Sf9 комах культивували при температурі 27°C у живильному середовищі TNM-FH для клітин комах (BD Biosciences). Слід зауважити, що фахівцям у даній галузі є відомими також альтернативні живильні середовища, які є цілком підходящими для таких досліджень. Подібним чином для продукування вірусів і білків можуть використовуватися альтернативні клітинні лінії комах, наприклад Sf21-клітини і клітини п’яти високопродуктивних торгових мрок. Аналіз методом Вестерн-блотінгу та імунопреципітація. Рекомбінантний білок, експресований у клітинах комах, контролювали шляхом аналізу методом Вестерн-блотінгу. Білкові екстракти (35 мкг) кип’ятили при наявності буфера Лемлі (Laemmli), перепускали через 10% або 12% SDS-PAGE гелі (поліакриламідні гелі для електрофорезу з добавками додецилсульфату натрію) і переносили на PVDF мембрану за допомогою апарата для перенесення в зануреному стані (BioRad). Після перенесення мембрану блокували у TBS-T буфері (25 мМ Tris pH 7,5; 75 мМ NaCl; 0,05% Tween), що містив 5% нежирного порошкового молока. Первинне антитіло використовували з розбавленням 1:1000 протягом ночі у блокувальному TBS-T буфері. Блоти промивали тричі по 15 хвилин при кімнатній температурі. Відповідне вторинне антитіло, кон’юговане з пероксидазою хріну (HRP: horse radish peroxidase) використовували з розбавленням 1:10000 у блокувальному TBS-T буфері. Блоти інкубували у вторинному антитілі впродовж 1 години, а потім тричі промивали в TBS-T по 15 хв. кожний. Після цього блоти піддавали обробці згідно з протоколом системи ECL (Amersham Biosciences). В дослідженнях використовували такі антитіла: моноклональне антиflag антитіло M2 (Sigma), моноклональне або поліклональне анти-HA антитіло (Babco), антиPSTAIR антитіло (Sigma-Aldrich), анти-myc моноклональне або поліклональне антитіло (A-14) (Santa Cruz Biotechnology). Крім того, використовували вторинні антитіла: проти миші IG-HRP і проти кроля IG-HRP (GE Healthcare). Для моніторингу утворення комплексів між молекулами AtCyclinD2;1, AtCDKA і Krp проводили звичайну преципітацію. Білкові екстракти (14 мкг) розбавляли в 0,5 мл зв’язуючого буфера (100 мМ натрійфосфатний буфер, pH 7,0, 150 мМ NaCl, 1% Triton 100 плюс інгібітори протеази). Суміш білка з антитілом обережно качали при температурі 4°C протягом приблизно двох годин, після чого до неї додавали відповідне антитіло (2 мкг анти-flag антитіла M2; 5 мкл анти-HA антитіла; 5 мкл поліклонального анти-myc антитіла). Для надання шару суміші 10 мкл об’єму додавали білок A-сефарозу. Імунопреципітати обережно перемішували протягом 1 години при 4°C, а потім тричі промивали 1 мл зв’язуючого буферу. Після цього білкові комплекси, зв’язані з білок-Α-сефарозними кульками кип’ятили при наявності буфера Лемлі (Laemmli). Білок комплекси розділяли на 10% або на 12% SDS-PAGE гелі і переносили на PVDF мембрану. Мембрани піддавали блотінг-аналізу, як описано вище. Конструювання бакуловірусного вектора Послідовності кДНК Arabidopsis CyclinD2;1 (AtCyclinD2;1) та Arabidopsis CDKA (AtCDKA) піддавали епітоп-міченню і клонували у бакуловірусний вектор переносу (BD Biosciences). При цьому можуть використовуватися також інші векторні системи переносу, відомі фахівцям у даній галузі. AtCyclinD2;1 мітили FLAG-епітопом (Sigma-Aldrich) на N-кінці шляхом додавання амінокислотної послідовності Met Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Asn Leu (MDYKAFDNL) (SEQ ID No.: 18) за допомогою полімеразноланцюгової реакції (PCR), а потім клонували у вектор переносу pAcHLT (BD Biosciences). Для цих цілей можуть використовуватися також інші системи бакуловірусних векторів переносу, наприклад, Baculodirect (Invitrogen). Амінокислотну послідовність Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 19) гемаглютинінового (HA) епітопу поміщали в рамку з 5'-кінцем AtCDKA кінази за допомогою PCRреакції, а потім клонували у вектор переносу pVL1393 (AB Vector, CA). Циклін і CDK мітили епітопом для забезпечення можливості проводити ідентифікацю шляхом Вестерн-блотінгу та експерименти з імунопреципітаці. При цьому можуть використовуватися також циклін і/або CDK без міток. Крім того, можна використовувати й інші сумісні векторні системи переносу. Продукування рекомбінантних вірусів У дослідженнях використовували геном бакуловірусу Baculogold Bright Baculovirus (BD Biosciences), але цілком можливим є використання інших геномів бакуловірусів. Шляхом гомологічної рекомбінації flag-мічену версію молекули AtCyclinD2;1 вводили в несуттєву ділянку вірусного геному бакуловірусу. Гомологічна рекомбінація відбувалася, коли вектор переносу, що містив CyclinD2;1, котрансфікувався з лінеаризованою ДНК бакуловірусу BD Baculogold 28