Нестероїдні антиандрогени, спрямовані на 12-спіраль рецептора антиандрогенів

Реферат: UA 97786 C2 (12) UA 97786 C2 Сполуки, які мають представлену структуру, або їхні солі застосовуються для лікування або зниження ймовірності виникнення андрогензалежних хвороб, таких як рак простати, доброякісна гіперплазія простати, полікістозний синдром яєчників, вугрове висипання (запалення сальних залоз), гірсутизм (надлишкове оволосіння), себорея, андрогенне облисіння та чоловічі залисини. Сполуки готуються у вигляді лікарських форм разом із фармацевтично прийнятними розчинниками або носіями або в будь-якій іншій фармацевтичній лікарській формі. Також розкриваються комбінації з іншими активними фармацевтичними агентами. UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка на винахід заявляє претензії на користь пріоритету попередньої заявки No. 60/691,391 від 17 червня 2005, зміст якої включено до даного винаходу у повному обсязі як посилання. Даний винахід стосується нових інгібіторів активності статевих стероїдів, наприклад, сполук, які проявляють антагоністичну активність щодо рецепторів статевих стероїдів. Більш конкретно даний винахід стосується певних сполук, які мають специфічні бічні ланцюги, які взаємодіють з 12-ою спіраллю рецептора андрогенів, та їхніх метаболітів, які блокують дію андрогенів, діючи, окрім інших механізмів, через рецептори андрогенів, хоча вони самі не активують такі рецептори в деяких або у всіх андроген-чутливих тканинах. Під час лікування певних андроген-залежних хвороб важливо значно зменшити або, якщо це можливо, усунути андроген-індуковані ефекти. Із цією метою бажано як заблокувати доступ до рецепторів андрогенів за допомогою "антиандрогенів", перешкоджаючи, таким чином, зв'язуванню андрогенів із такими рецепторами та їхній активації, так і зменшити концентрацію андрогенів, доступних для активації рецепторів. Можливо, що навіть за відсутності андрогенів, незайняті рецептори андрогенів можуть проявляти біологічну активність. Отже, антиандрогени, які зв'язуються з рецепторами та блокують їх, можуть забезпечити кращі терапевтичні результати, ніж терапія, яка тільки інгібує продукування андрогенів. Антиандрогени можуть мати істотний терапевтичний ефект в уповільненні або зупинці розвитку андроген-залежних хвороб, наприклад хвороб, у виникненні або розвитку яких бере участь рецептор андрогенів, або активація модуляторів рецептора андрогенів. Бажано, щоб антиандроген, який застосовується у терапії для зменшення активації рецептора андрогенів, мав як високу спорідненість до рецептора андрогенів, так і не проявляв би значною мірою власної андрогенної активності в розглядуваній(них) тканині(ах). Перше стосується здатності антиандрогену зв'язуватися з рецептором андрогенів, і, таким чином, блокувати доступ андрогенів до їхнього рецептора. Друге має відношення до того впливу, який має антиандроген на рецептор після зв'язування з ним. Деякі антиандрогени можуть проявляти власну андрогенну активність ("агоністична активність"), яка, що є небажаним, активує ті самі рецептори андрогенів, для запобігання активації яких вони (антиандрогени) і призначені. Інакше кажучи, антиандроген із такою небажаною власною андрогенною активністю може успішно зв'язуватися з рецепторами андрогенів, блокуючи, що є бажаним, доступ до цих рецепторів природних андрогенів, але в той же час, і це небажано, може сам активувати рецептор у тканинах, в яких бажана винятково антиандрогенна дія. Відомі нестероїдні антиандрогени, такі як флутамід (flutamide), казодекс (casodex) і анандрон (anandron), позбавлені небажаної андрогенної активності, але вони можуть мати низьку спорідненість до рецепторів у порівнянні зі стероїдними антиандрогенами (тобто, похідними андрогенів, які мають стероїдне ядро, яке модифіковане таким чином, щоб забезпечити антиандрогенну активність). Однак стероїдні антиандрогени, як вважається, більш часто проявляють небажані агоністичні властивості, ніж нестероїдні антиандрогени. Недавно були описані деякі нові нестероїдні антиандрогени, які містять довгі замісники та мають кращу активність у порівнянні з вищезгаданими нестероїдними антиандрогенами (Kawaminami et al., 2005, Kinoyama et аl., 2004, Tucker et al., 2004), розкрите в (US 5,411,981, US 6,071,957, US 2004/0077605, US 2004/0077606, EP 0100172, FR 91 00185, FR 92 08431, EP 002 892, EP 0 494 819, EP 0 578 516, EP 0 580 459, WO 95/18794, WO 96/19458, WO 97/00071, WO 97/19064, WO 97/23464, WO 98/53826, Japonese Р2002-88073А), WO 00/37430 WO 01/16108, WO 01/16133, WO 02/24702, WO 2004/099188, WO 2004/111012, WO 2004/113309, WO 2005/040136. Однак стероїдні антиандрогени з дуже високою спорідненістю до рецептора андрогенів і позбавлені небажаної агоністичної активності були розкриті в заявці на патент US серійний No 11/030,850, яка ґрунтувалась на попередній заявці No 60/535,121. Ці сполуки мають специфічні бічні ланцюги в положенні 18, які взаємодіють зі спіраллю 12 молекули рецептора андрогенів. Селективні модулятори рецептора андрогенів (SARMs), які проявляють антагоністичну активність в деяких тканинах, у той же час не проявляють активності або агоністичної активності в інших тканинах, були описані в WO 02/00617, WO 2005/120483, US 2005/0033074, US 2005/0250741, US 2006/0014739, US 2006/0009529. Деякі із цих SARMs проходять клінічні випробування при нарощуванні м'язів і стимуляції росту кісток (Ostarine, розроблений GTx у Сполучених Штатах), недорозвинення статевих залоз, доброякісної гіперплазії простати, остеопорозу та жіночої статевої дисфункції (LGD 2226 2941, розроблений Ligand у Сполучених Штатах) або вікового зниження (статевої функції) (BMS 564929, розроблений Bristol-Myers Squibb у Сполучених Штатах). Таким чином, у даній галузі техніки існує потреба в нестероїдних антиандрогенах, які мають високу спорідненість до рецептора андрогенів, і в той же час значною мірою позбавлені 1 UA 97786 C2 5 10 15 небажаних агоністичних властивостей і таких, що мають гарну парентеральну або пероральну біодоступність для системного застосування. Мета даного винаходу - запропонувати антиандрогени, які б проявляли високу спорідненість до рецептора андрогенів, і в той же час були б значною мірою позбавлені андрогенної активності. Ці антиандрогени можуть бути корисні при лікуванні та запобіганні андрогензалежних хвороб, як це більш докладно описано нижче. Ціль даного винаходу - запропонувати сполуку, яка б: а) зв'язувалася з рецептором андрогенів; б) взаємодіяла безпосередньо або опосередковано зі спіраллю 12 рецептора андрогенів за рахунок ланцюга, досить вузького і довгого, щоб пройти крізь канал, який з'єднує активний центр зв'язування стероїдів зі спіраллю 12; в) і блокувала нормальне розташування в просторі спіралі 12 після зв'язування агоніста з рецептором андрогенів. В одному втіленні даний винахід пропонує сполуку з наступною схематичною молекулярною формулою або її сіль: де є ядром, здатним зв'язуватися з активним центром зв'язування стероїдів рецептора андрогенів; і де R є ланцюгом, розташованим приблизно перпендикулярно до площини ядра 20 яке містить ароматичне кільце або кільце гетероарилу, який є досить вузьким і довгим, щоб пройти крізь канал, який з'єднує активний центр зв'язування стероїдів зі спіраллю 12; який має, щонайменше, одну полярну функціональну групу, віддалену від ядра 25 30 35 ангстрем, і обрану зі списку, який складається з карбонілу, сульфону або сульфоксиду, сульфіміду, аміну, аміду, N-оксиду та четвертинної солі амонію. Метою даного винаходу було запропонувати фармацевтичну композицію, яка включає фармацевтично прийнятний розчинник або носій і терапевтично ефективну кількість, щонайменше, однієї сполуки, яка: а) зв'язується з рецептором андрогенів; б) взаємодіє прямо або опосередковано зі спіраллю 12 рецептора андрогенів за рахунок ланцюга, досить вузького і довгого, щоб пройти крізь канал, який з'єднує активний центр зв'язування стероїдів зі спіраллю 12; в) і блокує нормальне розташування в просторі спіралі 12 після зв'язування агоніста з рецептором андрогенів. В одному втіленні даний винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка включає в себе фармацевтично прийнятний розчинник або носій і терапевтично ефективну кількість, щонайменше, однієї сполуки з наступною молекулярною формулою, або її солі: де 40 на 6-10 є ядром, здатним зв'язуватися з активним центром зв'язування стероїдів рецептора андрогенів; і де R є ланцюгом, розташованим приблизно перпендикулярно до площини ядра 2 UA 97786 C2 , яке містить ароматичне кільце або кільце гетероарилу, який є досить вузьким і довгим, щоб пройти крізь канал, який з'єднує активний центр зв'язування стероїдів зі спіраллю 12; який має, щонайменше, одну полярну функціональну групу, віддалену від ядра 5 на 6-10 ангстрем, і обрану із групи, яка складається з карбонілу, сульфону або сульфоксиду, сульфіміду, аміну, аміду, N-оксиду та четвертинної солі амонію. В одному втіленні ядро 10 15 20 25 30 має наступну структуру: де пунктирні лінії є необов'язковими зв'язками; де D обирається із групи, яка складається з ароматичного залишку, гетероциклічного залишку та циклічного залишку; де R2 обирається із групи, яка складається з водню та (C1-C3) нижчого алкілу; де R3 та R4 незалежно обираються із групи, яка складається з водню, галогену, нітрилу, COCH3, -SO2CH3, метилу, та галогенованого метилу; де, щонайменше, один з R3 та R4 є не воднем. В іншому втіленні, R має наступну структуру: де n є цілим числом, обраним із поміж чисел від 0 до 3; де пунктирні лінії є необов'язковими зв'язками; де E обирається із групи, яка складається з ароматичного залишку та гетероарильного залишку; де Y є вставною групою, яка має від одного до чотирьох атомів; де Z1 є залишком вуглеводню, який додатково має, щонайменше, одну карбонільну, сульфонну або сульфоксидну групу або атом азоту, відділені від E за допомогою від одного до чотирьох вставних атомів, і де названий атом азоту є аміном, амідом, N-оксидом, сульфімідом або четвертинною сіллю амонію, і Z1, не обов'язково, містить інші атоми кисню, сірки або азоту; де Z2 обирається із групи, яка складається з водню, фтору, хлору, брому, йоду, ціано, нітро, трифторметилу, алкокси, C1-C5 лінійного або розгалуженого алкілу, C2-C5 лінійного або розгалуженого алкенілу, та C2-C5 лінійного або розгалуженого алкинілу. В іншому втіленні даний винахід пропонує сполуку, яка має наступну схематичну молекулярну формулу, або її сіль: 3 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 де n є цілим числом, обраним із поміж чисел від 0 до 3; де пунктирні лінії є необов'язковими зв'язками; де D обирається із групи, яка складається з ароматичного залишку, гетероциклічного залишку та циклічного залишку; де E обирається із групи, яка складається з ароматичного залишку та гетероарильного залишку; де R2 обирається із групи, яка складається з водню або нижчого (С1-С3) алкілу; де R3 та R4 незалежно обираються із групи, яка складається з водню, галогену, нітрилу, COCH3, -SO2CH3, NO2, OCH3, SCH3, метилу та галогенованого метилу; де, щонайменше, один з R3 та R4 є не воднем; де Y є вставною групою, яка має від одного до чотирьох атомів; де Z1 є залишком вуглеводню, який додатково містить, щонайменше, одну карбонільну, сульфонну або сульфоксидну групу або атом азоту, відділені від E за допомогою від одного до чотирьох вставних атомів, і де названий атом азоту є аміном, амідом, N-оксидом або четвертинною сіллю амонію, і Z1, не обов'язково, має інші атоми кисню, сірки або азоту; де Z2 обирається із групи, яка складається з водню, фтору, хлору, брому, йоду, ціано, нітро, трифторметилу, алкокси, С1- С 5 лінійного або розгалуженого алкілу, C 2-C5 лінійного або розгалуженого алкенілу, та C2-C5 лінійного або розгалуженого алкинілу. В іншому втіленні даний винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка включає в себе фармацевтично прийнятний розчинник або носій і терапевтично ефективну кількість, щонайменше, однієї сполуки з наступною молекулярною формулою, або її солі: де n є цілим числом, обраним із поміж чисел від 0 до 3; де пунктирні лінії є необов'язковими зв'язками; де D обирається із групи, яка складається з ароматичного залишку, гетероциклічного залишку та циклічного залишку; де E обирається із групи, яка складається з ароматичного залишку та гетероарильного залишку; де R2 обирається із групи, яка складається з водню або нижчого (C 1-C3) алкілу; де R3 та R4 незалежно обираються із групи, яка складається з водню, галогену, нітрилу, COCH3, -SO2CH3, NO2, OCH3, SCH3, метилу та галогенованого метилу; де, щонайменше, один з R3 та R4 не є воднем; де Y є вставною групою, яка містить від одного до чотирьох атомів; де Z1 є залишком вуглеводню, який додатково має, щонайменше, одну карбонільну, сульфонну або сульфоксидну групу або атом азоту, прямо зв'язані або відділені від E за допомогою від одного до чотирьох вставних атомів, і де названий атом азоту є аміном, амідом, N-оксидом або четвертинною сіллю амонію, і Z1, не обов'язково, містить інші атоми кисню, сірки або азоту; де Z2 обирається із групи, яка складається з водню, фтору, хлору, брому, йоду, ціано, нітро, трифторметилу, алкокси, C1-C5 лінійного або розгалуженого алкілу, C2-C5 лінійного або 4 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розгалуженого алкенілу, та C2-C5 лінійного або розгалуженого алкинілу. В іншому втіленні даний винахід надає місцеві або системні фармацевтичні композиції, які містять сполуки даного винаходу разом із фармацевтично прийнятними розчинниками або носіями. В іншому аспекті сполуки даного винаходу або фармацевтичні композиції, які їх містять, застосовуються в лікуванні або запобіганні таких шкірних хвороб, що посилюються андрогенами, як вугрове висипання (запалення сальних залоз), гірсутизм (надлишкове оволосіння), себорея, андрогенне облисіння, чоловічі залисини, тощо. В іншому втіленні, сполуки даного винаходу застосовуються в лікуванні або запобіганні таких системних хвороб, що посилюються андрогенами, як рак простати або доброякісна гіперплазія простати, раннє статеве дозрівання, полікістозний синдром яєчників, гіперандрогенні синдроми, тощо. В іншому втіленні способи лікування та запобігання хвороб, що посилюються андрогенами передбачають застосування сполук, розкритих тут, як частину комбінованої терапії, яка додатково використовує інші активні сполуки, обрані із групи, яка складається з інгібітору 5-редуктази, інгібіторів 17--гідроксистероїддегідрогенази типів 5 і 13, простати та інших інгібіторів біосинтезу андрогенів. В іншому аспекті сполуки даного винаходу, які мають тканиноспецифічну антиандрогенну активність і тканино-специфічну андрогенну активність, можуть застосовуватися для лікування або зменшення ризику розвитку хвороб, пов'язаних із втратою андрогенної стимуляції. Ще одна мета - надати селективні модулятори рецептора андрогенів для лікування (або зменшення ймовірності виникнення) хвороб, пов'язаних із втратою андрогенної симуляції. В іншому аспекті сполуки даного винаходу застосовуються при виготовленні ліків для лікування хвороб, обговорюваних тут. Ще одна мета - запропонувати фармацевтичні сполуки з гарною системною біодоступністю. Фіг. 1 показує схематичне подання принципу дії нестероїдних антагоністів рецептора андрогенів даного винаходу. Фіг. 2 (А: вигляд збоку, В: вигляд зверху), показує електронну щільність навколо молекули ЕМ-5744. Карта 2Fo-Fc, розрахована з розрізненням в 1,75 А, показана на рівні 1. Фіг. 3 показує електростатичну поверхню, яка є порожниною зв'язування ліганда в структурі комплексу hAR(LBD)-ЕМ-5744. Фіг. 4 показує взаємодії антагоніста ЕМ-7105 з амінокислотними залишками порожнини зв'язування ліганда в структурі комплексу hAR (LBD)-EM-7105. Фіг. 5 показує взаємодії бічного ланцюга антагоніста ЕМ-7105 зі спіраллю 12 рецептора андрогенів. Фіг. 6 показує електростатичну поверхню, яка представляє собою канал, який з'єднує порожнину зв'язування ліганда та ділянку, зайняту спіраллю 12 у структурі комплексу hAR (LBD)-ЕМ-7105. Взаємодія атома азоту бічного ланцюга ЕМ-7105 із залишком глутаміну 709 підкреслена. Можна бачити, що розташування спіралі 12 заблоковано кінцем бічного ланцюга. Здійснення кращих втілень. Попередні структурні дослідження кристалічного комплексу hER (LBD)-ралоксифен виявили структурну основу механізму антагонізму ралоксифену. Тоді було показано, що антагоніст зв'язується на тій же самій ділянці, де зв'язується агоніст, у межах ядра LBD, але ці два ліганди демонструють різні типи зв'язування. Дійсно, кожний клас лігандів індукує різні конформації в трансактиваційному домені, які характеризуються різним розташуванням спіралі 12. Наша робота з молекулярного моделювання, яка ґрунтується на кристалографічній структурі комплексу hAR (LBD)-R1881 (див. Ishioka et al.. Novel Non-Steroidal/Non-Anilide Type Androgen Antagonists with Isoxazolone Moiety, Bioorganic & Medicinal Chemistry 10 (2002) 1555-1566; 9 Muddana et al. 11-alkyl- -19-Nortestosterone Derivatives: High-Affinity Ligands and Potent Partial Agonists of the Androgen Receptor, J. Med, Chem. 2004, 47, 4985-4988), виявила наявність вузького каналу між ділянкою зв'язування стероїду та ділянкою, зайнятою спіраллю 12. Ми виявили що цей вузький канал, головним чином сформований бічними ланцюгами 5 залишків (Asn705, Trp741, Met742, Thr877, та Phe 891 ) рецептора андрогенів, може прийняти бічний ланцюг, тільки якщо він приєднаний до вуглецю 18 стероїдного ядра андрогену. Із цього положення стероїдного ядра тонкий бічний ланцюг, який проходить крізь цей отвір, може досягти поверхні рецептора та порушити розташування спіралі 12. Із залученням нестероїдних сполук ми виявили, що сполуки з ядром, які здатні зв'язуватися з деякими амінокислотними залишками активного центру зв'язування стероїдів в hAR (LBD) і які мають бічний ланцюг у правильному положенні, щоб мати змогу пройти крізь вищезгаданий виявлений канал, можуть бути придатними кандидатами на роль гарного антагоніста рецептора андрогенів людини. hER (LBD) 5 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 та hAR (LBD) позначають ліганд-з'єднуючий домен рецептора естрогенів типу  людини та ліганд-з'єднуючий домен рецептора андрогенів людини відповідно. Наш винахід ґрунтується на вище описаному відкритті та пропонує сполуки та фармацевтичні композиції, які містять такі сполуки. Відповідно до цього, сполуки, які здатні зв'язуватися з рецептором андрогенів і які мають ланцюг, досить вузький і довгий, щоб пройти крізь цей вищезгаданий канал, повинні взаємодіяти зі спіраллю 12 і блокувати її нормальне розташування, тобто повинні бути гарними антагоністами. Всі заявлені тут переваги, можуть бути присутніми одночасно. Наприклад, більш бажані замісники в будь-якому положенні описаних молекулярних структур можуть застосовуватися з більш бажаними замісниками у будь-якому іншому положенні. Багато сполук із довгими замісниками були синтезовані в нашій лабораторії та протестовані на їхню здатність зв'язувати рецептор андрогенів і інгібувати DHT-стимульований ріст андрогенчутливих клітин карциноми молочної залози мишей лінії Shionogi. У більшості випадків ці молекули зв'язують рецептор із високою спорідненістю, але залишаються сильними агоністами. Однак ми також одержали багато дуже сильних антагоністів, які мають високу спорідненість до рецептора, що говорить про те, що структура бічного ланцюга має основне значення. Щоб зрозуміти молекулярну основу агоністичних і антагоністичних властивостей цих різних молекул, і переконатися у тому, що бічний ланцюг, розташований відповідно до передбачень, дійсно в стані пройти крізь канал і досягти спіралі 12, ми спробували закристалізувати деякі із цих молекул (андрогени та антиандрогени) у комплексі з ліганд-з'єднуючим доменом рецептора андрогенів людини (hAR(LBD)), щоб визначити та порівняти тривимірні структури цих комплексів. У даний момент ми одержали повну структуру для одного з них (hAR (LBD)-ЕМ5744), визначену з розрізненням в 1,75 А. ЕМ-5744 є лігандом на основі DHT, який має високу спорідненість із рецептором андрогенів людини, незважаючи на його довгий замісник у вигляді бічного ланцюга, прикріпленого до атома вуглецю в положенні 18 (див. показану нижче структуру). Дійсно, ліганд ЕМ-5744 зв'язується з відносною спорідненістю 540 до hAR дикого типу в порівнянні зі значенням 180 для DHT і 100 для R1881. Цей ліганд може розглядатися як агоніст, тому що він не в змозі сповільнити DHTстимульований ріст клітин Shionogi при додаванні до культурального середовища при -6 -7 концентрації 10 M і проявляє значну агоністичну активність при 10 М. Як показано на фігурах 2 і 3, у кристалографічній структурі, яка була визначена, ядро стероїду ЕМ-5744 розташовано всередині порожнини зв'язування ліганда, та існує, в цілому, 18 амінокислотних залишків в hAR LBD, які взаємодіють зі зв'язаним лігандом (d  3,9 Å). Більшість із цих залишків є гідрофобними та взаємодіє, головним чином, зі стероїдним каркасом, тоді як деякі є полярними та можуть формувати водневі зв'язки з полярними атомами молекули ліганда. Атом кисню (O-3) з Å кільцевої групи карбонілу формує водневий зв'язок з Arg 752 (2,9 Å до Arg752 N2). Є також молекула води біля O-3 (3,2 Å), яка зв'язана водневими зв'язками із двома іншими залишками (Arg752 N2 та Met745 О). 17 гідроксильна група ЕМ-5744 формує Y водневі зв'язки з ASN705 O1 (2,8 Å) та Thr877 O (2,8 Å), вона має таке ж розташування, яке спостерігається в структурі комплексу hAR(LBD)-R1881. Нарешті, бічний ланцюг С-18 також добре стабілізований, головним чином, численними контактами з гідрофобними залишками, та, як і передбачено, виходить із кишені, яка з'єднує стероїд крізь канал. Однак бічний ланцюг ЕМ5744 не розташований досить добре, щоб досягти порожнини, зайнятої спіраллю 12 і, отже, не може порушити її розташування. Це спостереження дуже гарно пояснює, чому ця сполука діє як агоніст, незважаючи на наявність її великого бічного ланцюга С-18. Цікаво, що несподівана взаємодія спостерігалася між одним з атомів фтору у вилученій частині бічного ланцюга ЕМ5744 і атомом N2 залишку His874. До цієї взаємодії також може бути залучено молекулу води, 6 UA 97786 C2 5 10 15 виявлену в безпосередній близькості від цих двох атомів. Ця взаємодія, імовірно, пояснює більш високу спорідненість ЕМ-5744 з hAR у порівнянні з DHT або R1881, які не мають цього третього зв'язку з рецептором. Для того, щоб розташувати замісник С-18 ЕМ-5744 подібним чином, бічний ланцюг залишку Trp741, залишку, який формує канал, повертається на 180° Y навколо його C і приймає конформацію, яка дуже відрізняється від тієї, яка спостерігається для того ж самого залишку в структурі комплексу hAR(LBD)-R1881. Інші залишки, які формують порожнину ліганда, також приймають різні конформації, що, можливо, є наслідком руху бічного ланцюга Trp741. Дані спостереження ілюструють чудову пластичність як з'єднуючої ліганд порожнини, так і вузького каналу, крізь який бічний ланцюг С-18 ЕМ-5744 виходить із кишені. Як представлено на Фіг. 1, зв'язування рецепторів андрогенів зі даними сполуками може змінити зв'язування до-активаторів, і до-репресорів із рецептором андрогенів, таким чином, приводячи до прискореного апоптозу в андроген-чутливих тканинах. Антиандрогени можуть навіть приводити до смерті клітин. Фіг. 4-6 показують моделювання комплексу hAR(LBD)-ЕМ-7105, де ЕМ-7105 є нестероїдним антиандрогеном даного винаходу. Ядро ЕМ-7105 розташоване в межах ліганд-з'єднуючої порожнини, як показано на фігурі 4. Більшість залишків hAR(LBD) у цій області є гідрофобними та взаємодіють головним чином з 20 25 30 формувати водневий зв'язок із полярними атомами залишку глютаміну 709. На Фіг. 5 і 6 можна бачити, що переміщення спіралі 12 заблоковане, коли виникає цей водневий зв'язок. Антиандрогени даного винаходу та фармацевтичні композиції, які містять їх, можуть застосовуватися відповідно до даного винаходу при лікуванні андроген-чутливих хвороб, у розвиток яких вносить свій внесок активація рецепторів андрогенів. Їхній перелік (хвороб) включає, але не обмежуються вказаними, рак простати, доброякісну гіперплазію простати, вугрове висипання, себорею, гірсутизм, андрогенне облисіння, чоловічі залисини, раннє статеве дозрівання, полікістозний синдром яєчників, тощо. За певних умов (наприклад, при певних концентраціях), сполуки даного винаходу та фармацевтичні композиції, які їх містять можуть бути андрогенними та можуть застосовуватися відповідно до даного винаходу для запобігання та лікування хвороб, у відношенні яких андрогени є корисними, таких, як м'язова атрофія, нагромадження черевного жиру, атрофія шкіри, анемія, втрата кісткової маси, остеопороз, атеросклероз, серцево-судинні захворювання, діабет типу 2, втрата енергії або гарного самопочуття. Переважно, щоб ядро 35 ядром, тоді як азот на бічному ланцюзі може вибиралося з наступних залишків: де пунктирні лінії є необов'язковими зв'язками; де R3 та R4 незалежно обираються із групи, яка складається з водню, галогену, нітрилу, COCH3, -SO2CH3, -NO2, -OCH3, -SCH3, метилу та галогенованого метилу; де, щонайменше, один з R3 і R4 є не воднем; де R9 та R10 незалежно обираються із групи, яка складається з водню, гідроксилу, галогену та метилу; 7 UA 97786 C2 5 10 де W 1 обирається із групи, яка складається з -CH2-, кисню та сірки. Бажано, щоб Y обирався із групи, яка складається з -MCH2CH2-CH2MCH2- та -CH2CH2M- (M обирається із групи, яка складається з -O-, -S-, -SO2- і -CH2-), ще краще -CH2CH2O-. Бажано, щоб E обирався із групи, яка складається з фенілену, і однозаміщеного піридилу, і де Z1 розташований у пара-положенні щодо групи Y, і атом азоту Z1 відділений від фенілену або однозаміщеного кільця піридилу одним із вставних атомів, краще, щоб Z1 обирався з поміж наступних залишків: (Z'1 є воднем, нижчим С1-С6 алкілом, алкіленом або арилом), або Z1, зливаючись із Циклом Е, формує біциклічний залишок, обраний із групи, яка складається з: (Z'1 та Z'2 незалежно є воднем, нижчим С1-С6 алкілом, алкіленом або арилом) Бажано, щоб D обирався із групи, яка складається з: 8 UA 97786 C2 5 де W 1 та W 2 незалежно обираються із групи, яка складається з -CH2-, кисню та сірки; де R5, R6, R7 та R8 незалежно обираються із групи, яка складається з водню та ( С 1 - С 3 ) нижчого алкілу; і де R9 та R10 незалежно обираються із групи, яка складається з водню, гідроксилу, галогену та метилу. Кращими є сполуки з наступними молекулярними формулами, або їхні солі, та їхні фармацевтичні композиції, перелік яких включає: 9 UA 97786 C2 5 10 15 20 де n є цілим числом від 1 до 3; де Ra та Rb незалежно обираються із групи, яка складається з водню та C 1-C6 алкілу, C2-C6 алкенілу; Ra та Rb разом можуть формувати кільце; де R3 обирається із групи, яка складається з водню, галогену, OCH 3, SCH3, алкілсульфоксиду, алкілсульфону, сульфону, нітрилу, NO 2, алкілу, метилу, та трифторметилу; де R4 обирається із групи, яка складається з галогену, нітрилу, -COCH3, -SO2CH3, та -NO2; де R11 і R12 незалежно обираються із групи, яка складається з водню та C 1-C6 нижчого алкілу, або R11 і R12 разом формують гетероцикл, який необов'язково містить інший гетероатом, обраний із групи, яка складається з азоту, кисню, селену, кремнію та сірки; де R13 обирається із групи, яка складається з водню, гідроксилу та C 1-C6 нижчого алкілу; де R14 обирається із групи, яка складається з водню, гідроксилу та C 1-C6 нижчого алкілу; де R14 та R 1 5 разом можуть формувати C4-C8 кільце або C4-C8 гетероцикл; де R 1 5 обирається із групи, яка складається з водню та C1-C6 нижчого алкілу. R14 та R15 разом можуть формувати C4-C8 кільце або C4-C8 гетероцикл; і де R16 обирається із групи, яка складається з водню та C1-C6 нижчого алкілу. Найбільш бажаними є сполуки, які мають молекулярну структуру, обрану із групи, яка складається із представлених нижче структур, або їхніх солей, та їхніх фармацевтичних композицій, перелік яких включає: У деяких втіленнях є бажаним, щоб R11 або R12 були циклопентилом, циклогексилом або радикалом циклогептилу. 10 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких втіленнях є бажаним, щоб Ra та Rb незалежно вибиралися із групи, яка складається з водню, метилу та етилу. Бажано, щоб Z2 обирався із групи, яка складається з водню, фтору, хлору та ціаніду. Бажано, щоб n дорівнювало 3. У кращих втіленнях дві або, бажано, більше з описаних тут кращих сполук застосовується в комбінації. Антиандрогени даного винаходу переважно готуються разом із фармацевтично прийнятними розчинниками, наповнювачами або носіями (включаючи капсули) у вигляді фармацевтичних композицій зі звичайними концентраціями антиандрогенів для антиандрогенів, які застосовувались у попередній галузі техніки. Беручи до уваги більш високу ефективність сполук даного винаходу, клініцист, який практикує може надати перевагу зміні концентрації та/або дозування, щоб пристосувати дозу до специфічної реакції кожного пацієнта. Бажано, щоб клініцист, який би практикував, особливо на початку лікування, контролював би повністю всі реакції індивідуального пацієнта та рівні антиандрогенів у сироватці (у порівнянні із кращими концентраціями в сироватці, обговореними нижче), і контролювати повністю всі реакції пацієнта на лікування, регулюючи дозування в міру необхідності, якщо метаболізм даних пацієнтів або реакція на лікування нетипові. Як це більш докладно описано нижче, носії, наповнювачі або розчинники містять у собі тверді речовини та рідини. Консервант (наприклад бензиловий спирт), визнані в даній галузі техніки, типово включаються, якщо композиція готується не для негайного застосування. Нові фармацевтичні композиції даного винаходу можуть застосовуватися в лікуванні андроген-залежних хвороб, або зменшувати ймовірність виникнення таких хвороб. При системному введенні (наприклад, для лікування раку простати, доброякісної гіперплазії простати, раннього статевого дозрівання, полікістозного синдрому яєчників та інших хвороб, які не зачіпають у першу чергу шкіру) застосовуються звичайні розчинники або носії, які, про які відомо в даній галузі техніки, що вони є фармацевтично прийнятними для системного застосування, наприклад, сольовий розчин, вода, водний етанол, олія, тощо. Носій часто є сумішшю компонентів. Коли розробляється рецептура для системного застосування, антиандрогени можуть бути підготовлені до введення звичайними способами, наприклад перорально або ін'єкцією. Антиандроген може бути уведений, наприклад, перорально. Сполуки даного винаходу можуть бути приготовлені зі звичайними фармацевтичними наповнювачами, (наприклад висушена розпиленням лактоза та стеарат магнію) у вигляді таблеток або капсул для перорального введення. Звичайно, можуть бути додані поліпшуючі смак речовини у випадку форм для перорального введення. Коли бажані капсули для перорального проковтування, будь-які фармацевтичні капсули, відомі в даній галузі техніки, можуть бути заповнені активними компонентами даного винаходу, із застосуванням або без застосування обговорених тут додаткових розчинників та інших добавок. Активна речовина може бути розфасована в пігулки або гранули драже, при цьому будучи змішаною із твердими, порошкоподібними речовинами носія, такими як лимоннокислий натрій, карбонат кальцію або дикальційфосфат, і зв'язуючими речовинами, такими як полівінілпіролідон, желатин або похідні целюлози, можливо з додаванням також, змащуючих речовин, таких як стеарат магнію, лаурилсульфат натрію, "Carbowax" або поліетиленгліколь. Як додаткові форми, можна застосовувати пресовані капсули, наприклад, із твердого желатину, так само як закриті капсули з м'якого желатину, які включають пом'якшувач або пластифікатор, наприклад, гліцерин. Пресовані капсули містять активну речовину переважно у формі гранулята, наприклад, у суміші з наповнювачами, такими як лактоза, сахароза, манітол, крохмалі, такі як картопляний крохмаль або амілопектин, похідні целюлози або високодисперсні кремнієві кислоти. У м'яких желатинових капсулах активна речовина переважно розчинена або суспендована в придатних рідинах, таких як рослинні олії або рідкі поліетиленгліколі. Може застосовуватися суха система доставки, як описано в US 3742951, 3797494 або 4568343. Альтернативно, активний компонент може бути поміщений у трансдермальний пластир, який містить відомі в даній галузі техніки структури, наприклад, такі структури, як описано в Е.Р. 0279982. Такі розчинники або пристрої як описаний в US 5064654, 5071644 або 5071657, можуть також застосовуватися, щоб полегшити трансдермальне проникнення, коли бажаними є системні ефекти. При застосуванні для лікування системних хвороб, ділянка аплікації на шкірі повинна періодично змінюватися, щоб уникнути надлишкової локальної концентрації антиандрогенів. У деяких втіленнях антиандрогени даного винаходу застосовуються для лікування 11 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пов'язаних з андрогенами хвороб шкіри, таких як вугрове висипання, себорея, гірсутизм, андрогенне облисіння та чоловічі залисини. При застосуванні у кожному з названих випадків, антиандрогени бажано вводяться місцево разом зі звичайним місцевим носієм або розчинником. При місцевому застосуванні, бажано, щоб розчинник або носій не підтримували трансдермальне проникнення активних компонентів у кровоток або інші тканини, де вони могли б викликати небажані системні ефекти. Коли сполука вводиться з носієм або розчинником для шкірного або місцевого застосування, носій або розчинник можуть бути обрані з поміж будь-якого з відомих в косметичних і медичних галузях техніки, наприклад, може застосовуватися будь-який гель, крем, лосьйон, мазь, рідкий або не рідкий носій, емульгатор, розчинник, рідкий розчинник або інший подібний носій, який не проявляє шкідливої дії на шкіру або іншу живу тканину тварини. Носій або розчинник звичайно є сумішшю декількох компонентів, які включають, але ними не обмежуються, рідкі спирти, рідкі гліколі, рідкі поліалкіленгліколі, воду, рідкі аміди, рідкі ефіри, рідкий ланолін, похідні ланоліну та подібні матеріали. Спирти включають моно та багатоатомні спирти, в тому числі етанол, гліцерин, сорбітол, ізопропіловий спирт, діетиленгліколь, пропіленгліколь, етиленгліколь, гексиленгліколь, манітол і метоксиетанол. Типові носії можуть також включати ефіри, наприклад діетиловий і діпропіловий ефір, метоксиполіоксиетилени, карбовоск, поліетиленгліцероли, поліоксиетилени та сорбітоли. Звичайно, носій для місцевого застосування містить у собі і воду, і спирт, щоб максимізувати гідрофільну та ліпофільну розчинність, наприклад, суміш етанолу або ізопропілового спирту з водою. Носій для місцевого застосування може також містити в собі різні інші компоненти, які зазвичай застосовуються в мазях і лосьйонах і добре відомі в косметичних і медичних галузях техніки. Можуть бути присутніми, наприклад, ароматизатори, антиоксиданти, парфумерні речовини, желатуючі агенти, загущувачі, такі як карбоксиметилцелюлоза, сурфактанти, стабілізатори, пом'якшувачі, барвники та інші подібні речовини. Концентрація активного компонента в мазі, кремі, гелі або лосьйоні зазвичай становить від приблизно 0,1 до 20 відсотків, бажано, від 0,5 до 5 відсотків, а ще краще - 2 відсотки (за вагою відносно загальної маси лосьйону, крему, гелю або мазі). У межах кращих діапазонів більш високі концентрації дозволяють досягати придатного дозування, якщо застосовувати лосьйон, мазь, гель або крем у меншій кількості або з меншою частотою. Кілька необмежуючих прикладів, наведених нижче, описують приготування типового лосьйону та гелю, відповідно. На додаток до наповнювачів будь-який фахівець у даній галузі техніки може вибрати інші наповнювачі, щоб пристосуватися до певних дерматологічних потреб. Коли антиандрогени вводяться системно, вони переважно вводяться перорально або парентерально. Природно, місцеве введення є бажаним, якщо цільовою ділянкою застосування є шкіра. Концентрація активних антиандрогенів варіює певною мірою залежно від способу введення фармацевтичної композиції. Композиція, придатна для перорального введення, бажано може містити, щонайменше, один антиандроген, де загальна концентрація всіх таких антиандрогенів у названій фармацевтичній композиції становить приблизно від 1 % до 95 % композиції (за вагою), а краще, від приблизно 5 % до приблизно 20 %. Загальне сумарне дозування всіх антиандрогенів, якщо використовується комбінація антиандрогенів, повинна бути рівною діапазону дозування, названому вище. Рівень антиандрогенів у крові є кращим критерієм адекватного дозування, який враховує індивідуальні варіації в поглинанні та метаболізмі. При приготуванні для парентеральної ін'єкції антиандрогени переважно додають при концентрації між приблизно 0,1 мг/мл і приблизно 100 мг/мл (бажано від приблизно 2,5 мг/мл до приблизно 25 мг/мл). Коли бажаною є системна активність, необхідно тільки, щоб антиандрогени вводилися тим способом і в тому дозуванні, які достатні для досягнення бажаних рівнів концентрації в сироватці крові. Концентрація антиандрогенів у сироватці повинна звичайно підтримуватися між 0,1 та 1000 мікрограмів на літр, бажано від 50 до 1000 мікрограмів на літр, а ще краще, від 50 до 500 мікрограмів на літр. Адекватні рівні в сироватці можуть також визначатися, виходячи з реакції пацієнта на лікування. Для типових пацієнтів придатне дозування антиандрогенів для досягнення бажаної концентрації в сироватці перебуває між 10 і 2000 міліграмів активного компонента на день на 50 кг маси тіла при пероральному введенні. При введенні ін'єкцією рекомендується приблизно від 2 до 1500 мг на день на 50 кг маси тіла, бажано від 5 до 100. Для місцевого застосування лосьйон, мазь, гель або крем повинні бути повністю втерті в шкіру так, щоб зовсім не залишилось явно помітного надлишку, і цю ділянку шкіри бажано не 12 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мити протягом, щонайменше, 30 хвилин. Кількість, що застосовується повинна забезпечити надходження, щонайменше, 0,02 міліграма антиандрогену на квадратний сантиметр (бажано 2 від 0,1 до 1 мг/см ) за одне застосування. Бажано наносити композицію для місцевого застосування на оброблювану ділянку від 1 до 6 разів на день, наприклад, 3 рази в день із приблизно рівними інтервалами. У деяких втіленнях даного винаходу антиандрогени даного винаходу застосовуються у поєднанні з іншим активним компонентом як частина комбінованої терапії. Наприклад, новий антиандроген може бути застосований разом з узятими окремо інгібітором 5-редуктази, інгібітором 17-гідроксистероїддегідрогенази типу 5 або типу 3, або інгібітором 1 Коротколанцюгової Дегідрогенази Редуктази Простати, який може бути включений у ту ж саму фармацевтичну композицію, що й антиандроген, або який можна вводити окремо. Таким чином, комбінована терапія може містити в собі лікування з використанням однієї або більше сполук, які інгібують продукцію дигідротестостерону або його попередників. У деяких кращих втіленнях даного винаходу фармацевтична композиція для місцевого застосування додатково містить у собі інгібітор активності 5-редуктази стероїдів. Один такий інгібітор ("Ргоресіа або Proscar") є комерційно доступним від Merck Sharp і Dohme. Інший інгібітор "Dutasteride", який інгібує обидва коферменти 5-редуктази, був зареєстрований GlaxoSmithKline. Інгібітори 17гідроксистероїддегідрогенази типу 5 (особливо сполука EM-1404) розкриті в міжнародній публікації WO 99/46279. Сполука ЕМ-1792, один із інгібіторів 17-гідроксистероїддегідрогенази типу 13, описаний в WO 2005/000011. Коли в комбінованій терапії відповідно до даного винаходу, описаного тут, застосовуються інгібітори 5-редуктази, бажане пероральне дозування становить між 0,1 мг та 100 мг на день на 50 кг маси тіла, а ще краще між 0,5 мг/день та 10 мг/день, наприклад, 5,0 мг на день фінастериду. Коли в комбінованій терапії відповідно до даного винаходу, описаного тут, застосовуються інгібітори 17 гідроксистероїддегідрогенази типу 5, пероральне дозування становить бажано між 5 мг та 500 мг на день на 50 кг маси тіла, ще краще, між 10 мг/день та 400 мг/день, наприклад, 300 мг на день ЕМ-1404. Коли в комбінованій терапії відповідно до даного винаходу, описаного тут, застосовуються інгібітори 17-гідроксистероїддегідрогенази типу 5 або типу 13, пероральне дозування становить бажано між 10 мг та 1000 мг на день на 50 кг маси тіла, а ще краще між 25 мг/день та 1000 мг/день, наприклад 200 мг на день ЕМ-1404 або ЕМ-2881. Пацієнтом, який потребує лікування або зниження ризику виникнення даної хвороби, є той, кому поставили діагноз такої хвороби або той, хто сприйнятливий до виникнення такої хвороби. Даний винахід особливо корисний для індивідуумів, які через спадковість, екологічні фактори або інші визнані фактори ризику піддаються більшому, у порівнянні з іншим населенням, ризику виникнення станів, до яких має відношення даний винахід. Крім тих випадків, у яких вказано інакше, краще дозування активних сполук даного винаходу ідентичне й для терапевтичних і для профілактичних цілей. Дозування для кожного активного компонента, обговореного тут, є таким самим, незалежно від хвороби, яку лікують (або попереджають). Де обговорюються два або більше різних активних агенти як частина комбінованої терапії (наприклад інгібітор ферменту та антиандроген), переважно вводиться сукупність різних сполук, швидше ніж одна сполука, яка проявляє множинні активності. Крім тих місць, де позначено інакше, термін "сполука" і будь-яка асоційована з ним молекулярна структура можуть охоплювати будь-який їхній можливий стереоізомер, у формі рацемічної суміші або в оптично активній формі. Крім тих місць, де відзначено інакше, або де це є очевидним із контексту, зазначені дозування стосуються ваги активних сполук, без урахування фармацевтичних наповнювачів, розчинників, носіїв або інших компонентів, хоча включення таких додаткових компонентів є бажаним, як показано в наведених тут прикладах. Будь-яка лікарська форма (капсула, таблетка, ін'єкція або тому подібне) звичайно може бути застосована у фармацевтичній промисловості, є придатною для застосування тут, і терміни "наповнювач", "розчинник" або "носій" включають такі неактивні компоненти, які включаються звичайно в промисловості, разом з активними компонентами в такі лікарські форми. Всі активні компоненти, які застосовуються в кожному з описаних тут комбінованих способів лікування, можуть бути приготовлені у вигляді фармацевтичних композицій, які також містять у собі один або більше інших активних компонентів. Альтернативно до цього, їх можна вводити кожний окремо, але досить синхронізовано в часі таким чином, щоб у пацієнта в остаточному підсумку піднявся їх рівень в крові, або іншим способом одночасно досягалася корисна дія 13 UA 97786 C2 5 10 15 кожного з активних компонентів (або стратегій). У деяких кращих втіленнях даного винаходу, наприклад, один або більше активних компонентів повинні включатися в одну фармацевтичну композицію. В інших втіленнях даного винаходу наданий набір, який містить у собі, щонайменше, два окремі контейнери, де, щонайменше, один контейнер відрізняється від іншого контейнера за комбінацією активних компонентів, які містяться в ньому. Два або більше різних контейнери застосовуються в комбінованих способах лікування даного винаходу. Також описані тут комбіновані способи лікування передбачають застосування одного активного компонента з комбінації при виготовленні ліків для лікування (або попередження) розглянутої хвороби, де лікування або попередження додатково включають інший активний компонент або стратегію із запропонованої комбінації. Наприклад, для терапії раку простати можуть застосовуватися агоніст LHRH або антагоніст або інгібітор 17-гідроксистероїддегідрогенази типу 3. Кращі сполуки Нижче в таблицях представлені списки кращих сполук, їхні властивості та ефективність. Таблиці І і II містять у собі тільки визначення андрогенної/антиандрогенної активності in vitro із використанням клітин карциноми молочної залози мишей лінії Shionogi та визначення зв'язування з рецептором андрогенів людини в трансфекованих клітинах і дані визначення антиандрогенної активності in vivo у пацюків. Детальні пояснення того, як ці дані були отримані та представлені, подано слідом за таблицями. 14 UA 97786 C2 15 UA 97786 C2 16 UA 97786 C2 17 UA 97786 C2 18 UA 97786 C2 19 UA 97786 C2 20 UA 97786 C2 21 UA 97786 C2 5 Підписи до таблиць 1 і 2: У колонці 1 наведена лабораторна назва антиандрогенів. У колонці 2 показана молекулярна структура антиандрогенів. Колонка 3 представляє дозу (виражену в нМ), яка інгібує на 50 % (IC 50) число клітин DHT 22 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 стимульованоі карциноми молочної залози мишей лінії Shionogi. Більш низькі значення є кращими. Колонка 4 представляє відносну спорідненість зв'язування (RBA) антиандрогену, виражену як відсоток (%), з рецептором андрогенів людини в трансфекованнх клітинах, стосовно R1881, яка розрахована за формулою: % RBA=100  IC50 R1881/IC50 (сполука) Більш високі значення є кращими. Колонка 5 представляє % ефективності антиандрогену в простаті пацюка, вираженої у відсотках інгібування: де відсоток інгібування (% inhib) розраховується за наступною формулою: % Inhib = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою простати. Більш високі значення є кращими. Колонка 6 є % антиандрогенної ефективності в сім'янику пацюка, вираженим у відсотках інгібування: де відсоток інгібування (% inhib) розраховується за наступною формулою: % Inhib = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою сім'яника. Більш високі значення є кращими. Колонка 7 представляє % ефективності антиандрогену в задньому піднімаючому м'язі (levator ani muscle) пацюка, виражений у відсотках інгібування: де відсоток інгібування (% inhib) розраховується за наступною формулою: % Inhib = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою сім'яника. Більш високі значення є кращими. 23 UA 97786 C2 5 Підписи до таблиці 3: У колонці 1 наведені молекулярна структура та лабораторна назва антиандрогенів. У колонці 2 представлена доза (виражена в нМ), яка інгібує на 50 % (ІС50) число клітин DHTстимульованої карциноми молочної залози мишей лінії Shionogi. Коли сполука стимулює клітини карциноми молочної залози мишей лінії Shionogi, використовується термін «Агоніст». Більш низькі значення є кращими. Колонка 3 представляє відносну з'єднуючу спорідненість (RBA) антиандрогену з рецептором 24 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 андрогенів людини в трансфекованих клітинах, виражену як відсоток (%), відносно R1881, який розрахований за наступною формулою: % RBA=100  IC50 R1881/IC50 (сполука) Більш високі значення є кращими Колонка 4 представляє % ефективності антиандрогену в простаті пацюка, виражений у відсотках інгібування: де відсоток інгібування розраховується за наступною формулою: % Inhib = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою простати. Більш високі значення є кращими. Колонка 5 представляє % ефективності антиандрогену в сім'янику пацюка, виражений у відсотках інгібування: де відсоток інгібування розраховується за наступною формулою: % Inhib = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою сім'яника. Більш високі значення є кращими. Колонка 6 представляє % ефективності антиандрогену в задньому піднімаючому м'язі (levator ani muscle) пацюка, виражений у відсотках інгібування: де відсоток інгібування розраховується за наступною формулою: % Inhib = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою сім'яника. Більш низькі значення є кращими. Колонка 7 представляє % ефективності андрогену в простаті пацюка, виражений у відсотках стимуляції: де відсоток стимуляції розраховується за наступною формулою: % стимуляції = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою простати. Більш низькі значення є кращими. Колонка 8 представляє % ефективності андрогену в сім'янику пацюка, виражений у відсотках стимуляції: де відсоток стимуляції розраховується за наступною формулою: % стимуляції = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою сім'яника. Більш низькі значення є кращими. Колонка 9 представляє % ефективності андрогену в задньому піднімаючому м'язі (levator ani muscle) пацюка, виражений у відсотках стимуляції: де відсоток стимуляції розраховується за наступною формулою: % стимуляції = 100 - [W (сполука) - W (контроль) / W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою сім'яника. Більш високі значення є кращими. 40 Підписи до таблиці 4: У колонці 1 наведена лабораторна назва антиандрогену. У колонці 2 наведена молекулярна структура антиандрогену. 25 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Колонка 3 представляє дозу (виражену в нМ), яка інгібує на 50% (ІС50) число клітин DHTстимульованої карциноми молочної залози мишей лінії Shionogi. Більш низькі значення є кращими. Колонка 4 представляє відносну спорідненість зв'язування (RBA) антиандрогену з рецептором андрогенів людини в трансфекованих клітинах, виражену як відсоток (%), відносно R1881, який розрахований за формулою: % RBA=100  IC50 R1881/IC50 (сполука) Більш високі значення є кращими. Колонка 5 представляє відсоток інгібування площі сальних залоз лівого вуха оброблених тварин у порівнянні із площею сальних залоз лівого вуха контрольних тварин. Доза в 3 мкг на день дослідної сполуки, розчиненої в десяти мкл розчину етанол: пропіленгліколь (1:1; за об'ємом), наносилася протягом 14 днів на область між двома хрящовими виступами вентральної поверхні лівої вушної раковини. Ефективність кращих інгібіторів А Аналіз андрогенної/антиандрогенної активності антиандрогенів in vitro Андрогенну/антиандрогенну активність кращих сполук визначали з використанням клітин карциноми молочної залози мишей лінії Shionogi (Shionogi mouse mammary carcinoma cells). 1. Матеріали Базове мінімальне середовище для культивування клітин (MEM), замінні амінокислоти та фетальна сироватка теляти були придбані в Flow Laboratories. Для видалення ендогенних стероїдів середовище інкубували протягом ночі при 4 °С у присутності 1% активованого вугілля (Norit A, Fisher) і 0,1% Декстрана Т-70 (Pharmacia). Додатково проводили адсорбцію протягом 2 годин при 25°С для видалення пов'язаних із білками стероїдів. Сироватку також інактивували за допомогою 20 хв. інкубації при 56°С. 5-дигідротестостерон (DHT) був отриманий від Steraloids. Антиандроген гідпроксифлутамід (OH-FLU) був люб'язно наданий докторами T.L. Nagabuschan та R. Neri (Schering Corporation, Kenilworth, U.S.A.). 2. Дисперсія, культура та клонування клітин Самці мишей лінії Shionogi, яка має андроген-чутливі пухлини молочної залози, були надані докторами Keishi Matsumoto (Osaka, Japan) та Yvonne Lefebvre (Ottawa, Canada). Для одержання первинної культури пухлини вирізали та промивали в крижаному стерильному розчині 2 5 мМ буфера Hepes (137 мМ NaCl; 5 мМ KCl; 0,7 мМ Na2HPO4; 10 мМ глюкоза, рН 7,2). Після подрібнення ножицями, пухлини піддавали переварюванню протягом 2 годин при 37°С у буфері Hepes, який містить 3,8 мг/мл колагенази (Clostridium, Boehringer), 1,5 мг/мл гіалуронідази II (Sigma) і 3% бичачого сироваткового альбуміну (фракція V, Schwartz-Mann). Дисперговані клітини збирали центрифугуванням (500  g протягом 10 хв.), двічі промивали, суспендуючи їх у мінімальному середовищі росту (MEM), яке містить 5% фетальної сироватки теляти, обробленої активованим вугіллям, покритим декстраном (DCC-FCS), 1% замінних амінокислот, 10 IU/мг пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину та 100 нМ дигідротестостерону (DHT) (Steraloids). 2 Клітини висіювали в те ж середовище при щільності 75000 клітин/мл в 75 см колби та вирощували в атмосфері 5% вуглекислого газу в повітрі при 37°С. Середовище замінювалося щотижня. Антиандрогени розчиняли в етанолі та зберігали у вигляді концентрованих розчинів, підібраних таким чином, щоб кінцева концентрація етанолу в культуральному середовищі була меншою 0,01%. Така концентрація етанолу не впливала на ріст клітин. Клітини субкультивували на стадії майже повного злиття за допомогою м'якого переварювання в 0,1% розчині панкреатину (Flow Laboratories) у буфері Hepes, який містить 3 мм етилендіамін-тетраоцтової кислоти (EDTA) (рН 7,2). Клітини осаджували центрифугуванням, ресуспендували в середовищі культивування, підраховували кількість клітин на лічильнику Coulter counter і повторно висіювали, як описано вище. Клонування на м'якому агарі проводили, як описано в роботі Stanley et al, Cell 10:35-44,1977 у присутності 100 н DHT. 3. Вимірювання росту клітин Клітини висіювали в 24-коміркові планшети при щільності 20 000 клітин/комірку. Зазначені концентрації, які збільшуються, досліджуваних агентів додавали в трьох повторностях, і клітини вирощували протягом 10-12 днів зі зміною середовища кожні 3-4 дні. Число клітин визначали прямим підрахунком на лічильнику Coulter counter. 4. Розрахунки та статистичний аналіз Значення ІС50 антиандрогенів розраховували відповідно до регресії за методом найменших квадратів, як описано Rodbard, Endocrinology. Статистичну вірогідність розраховували відповідно до багатофакторного тесту Крамера (Kramer multiple-range test). 26 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В Вимір рецептора андрогенів (AR) 1. Приготування тканини Приготування клітин нирок ембріонів людини (Human Embryonic Kidney, НЕК-293), трансфекованих рецептором андрогенів людини (Human Androgen Receptor, hAR) : клітини 5 культивували в 6-коміркових флаконах (Falcon flasks) до приблизно 310 клітин/комірку в середовищі Голка, модифікованому Дульбекко (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), до якого додавали 10% фетальну сироватку теляти, при 37°C у вологій атмосфері 95% повітря та 5% CO2. Для трансфекції використовували 5 мкг плазміди pCMVneo-hAR, трансфекцію здійснювали, використовуючи набір для трансфекції з ліпофектином (Life Technologies, Ontario, Canada). Після 6 годин інкубації при 37°C середовище для трансфекції видаляли та додавали 2 мл середовища DMEM. Клітини додатково культивували протягом 48 годин та потім переносили на чашки Петрі діаметром 10 см і культивували їх в DMEM, яке містить 700 мкг/мл G-418 для того, щоб інгібувати ріст нетрансфекованих клітин. Середовище, яке містить G-418, міняли кожні два дні до появи колоній стійких клітин. Позитивні клони відбирали, використовуючи метод PCR. Клітини HEK 293, трансфековані hAR, розмножували та заморожували для подальшого використання для визначення зв'язування. Одержання препарату цитозолю клітин НЕК-293, які експресують hAR: Ранком у день визначення зв'язування осад клітин НЕК-293 hAR розморожували та суспендували у буфері А (25 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ динатрієвої солі ЕДТА, 10 мМ -монотіогліцерол, 10% гліцерол і 10 мМ молібдат натрію, рН 7,4; 625000 клітин/0,1 мл). Суспензію клітин обробляли ультразвуком три рази по 30 сек. (із перервами для охолодження) і потім центрифугували при 105000  g протягом 90 хв. 2. Вимірювання рецептора андрогенів Зв'язування андрогенів вимірювали, використовуючи визначення з гідроксилапатитом (НАР). 3 Коротко, солюбілізований в етанолі радіоактивний стероїд [ H]R1881 розбавляли буфером В (10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ динатрієвої солі ЕДТА, 10 мМ -монотіогліцерол, рН 7,4). Потім аліквоти 3 препарату цитозоля клітин (0,1 мл) інкубували з 5 нМ [ H]R1881 (0,1 мл, ~ 100000 расп./хв.) у присутності або за відсутності зазначених концентрацій немічених сполук (0,1 мл, приготовлені в буфері В, який містить 30% етанолу) протягом 16-18 годин при 0-4°C. Триамцінолон ацетонід (ТАС; 100 нМ) додавали для маскування рецепторів прогестерона. Стероїди, які не зв'язалися, відокремлювали за допомогою інкубації протягом 40 хв. при 0-4°C з 0,3 мл НАР, приготовленому в буфері P (50 мМ Tris-HCl, 10 мМ КН2РO4, рН 7,4). Після інкубації з НАР і центрифугування протягом 10 хв. при 1000  g осад 3 рази промивали 1 мл буфера Р. Після цього радіоактивність екстрагували з осаду за допомогою інкубації з 1 мл етанолу за кімнатної температури протягом 60 хв. Після центрифугування супернатант зливали в сцинтиляційний флакон і осад знову екстрагували етанолом. Після додавання сцинтиляційної рідини вимірювали радіоактивність у рідинному сцинтиляційному лічильнику. 3. Розрахунки та статистичний аналіз Значення IC50 антиандрогенів розраховували відповідно до регресії за методом найменших квадратів, як описано Rodbard, Endocrinology. Статистичну вірогідність розраховували відповідно до багатофакторного тесту Крамера (Kramer multiple-range test). Відносна спорідненість зв'язування (Relative Binding Affinity, RBA) антиандрогену у відсотках відносно R1881 розраховували за формулою: % RBA = 100  IC50 R1881/IC50 (сполука) С Системна антиандрогенна/андрогенна активність (статевонезрілі самці пацюків) 1. Тварини Статевонезрілі самці пацюків (CrI: CD (SD) Br) у віці від 22 до 24 днів були отримані від Charles-River, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada) і утримувалися в пластикових контейнерах до 5 штук на контейнер при температурі (23 ± 1°С) і освітленості (12 годинний світловий день, світло вмикали о 7 годині 15 хв.) у контрольованих умовах. Пацюки одержували стандартний комбікорм і воду в поїлках ad libitum. Наступного дня після одержання, тварини були орхідектомовані (кастровані) (CX) з використанням ізофлуранової анестезії через мошонку та розсаджені випадковим чином групами по 5 особин. Для вимірювання антиандрогенної активності один силіконовий імплантат із дигідротестостероном (DHT, довжина імплантату 1 см) вшивався підшкірно на спинну сторону тварини під час орхідектомії. Одна група з 5 тварин використовувалася тільки як CX контроль (імплантат із DHT не вшивався). 2. Обробки Для оцінки антиандрогенної активності досліджувані сполуки вводили підшкірно або перорально один раз на день при використанні дози 0,5 мг/тварину для визначення антиандрогенної активності або 0,2 мг/тварину для визначення андрогенної активності протягом 27 UA 97786 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7 днів (SD від 1 до 7). Сполуки були солюбілізовані (коли це було можливим) у диметилсульфоксиді (DMSO, кінцева концентрація 10%) і вводилися у вигляді суспензії в 0,4% метилцелюлозі. Пацюки у контрольних групах CX та CX + DHT одержували протягом 7 днів тільки один носій. Одна група тварин одержувала антиандроген флутамід (Flutamide) для порівняння. Тварин забивали переломом шийних хребців із використанням ізофлуранової анестезії на 8-ий ранок після кастрації. Черевна простата та сім'яники швидко вирізалися та зважувалися. 3. Розрахунки та статистичний аналіз Для оцінки антиандрогенної активності, відсоток інгібування (% інгіб.) розраховується за наступною формулою: % Інгіб. = 100 - [W (сполука) - W (контроль)/ W (DHT) - W (контроль)]  100. Для оцінки андрогенної активності, відсоток стимуляції розраховується за наступною формулою: % стимуляції = [W (сполука) - W (контроль)/ W (DHT) - W (контроль)]  100. W є вагою простати, сім'яника або м'яза levator ani. D Вимірювання місцевої антиандрогенної активності in vivo Антиандрогенна активність сполук при місцевому застосуванні була визначена з використанням моделі вушних сальних залоз самців хом'ячка. 1. Тварини Самці золотистих сірійських хом'ячків (SYR) вагою 110-120 г були надані Harlan SpragueDawley (Madison, USA) і утримувалися по 2 штуки у пластикових контейнерах при температурі (22 ± 3°С і освітленості (12 годинний світловий день, світло вмикали о 7 годині 15 хв.) у контрольованих умовах. Хом'ячки одержували комбікорм для гризунів Certified Rodent Diet 5002 (гранули) і мали доступ до поїлок із водою ad libitum. Тварини акліматизувалися протягом, щонайменше, п'яти днів до початку досліджень. Тварини були розділені випадковим чином на групи по 8 штук. Одна група хом'ячків була кастрована з використанням ізофлуранової анестезії в день початку експерименту (SDl) і використовувалася як контрольна група. 2. Обробки Для оцінки антиандрогенної активності досліджувані сполуки наносилися місцево на внутрішню частину лівого вуха один раз на день протягом 14 днів. Десять мкл розчину ацетон:етанол:пропіленгліколь (1:1:2; за об'ємом), який містить 0,1, 0,3 або 1,0 мг/мл досліджуваної сполуки, акуратно наносили на ділянку між двома хрящовими гребенями на вентральній поверхні лівої вушної раковини. Для тварин із кастрованої та інтактної контрольних груп наносили тільки 10 мкл розчинника на ліве вухо. На праве вухо розчин не наносили. 3. Посмертні дослідження та вимірювання На 15 день дослідження хом'ячки забивались переломуванням шийних хребців із використанням ізофуранової анестезії. Ліве та праве вухо, з'єднані шкірою голови, збирали, фіксували розпластаними на папері та занурювали в 10% нейтральний розчин формаліну. Із розпластаних фіксованих вушних раковин вирізали кружки діаметром 6 мм у ділянках, на яких наносилися розчини. Такі зразки одержували з кожного вуха. За допомогою леза скальпеля, ці 6 мм кружки розрізали навпіл між двома хрящовими гребенями. Обидві рівні половинки кожного кружка заливали в парафін. Після обробки тканини, обидві половинки розташовували вертикально та паралельно одна до одної таким чином, плоскою 6 міліметровою ділянкою назовні. З кожного парафінового блоку готовили один зріз (товщиною 5 мкм) і поміщали на предметне скло. Таким чином, кожний препарат містив два довгих зрізи довжиною 6 мм. Зрізи офарблювали гематоксиліном і еозином. 4. Аналіз площі сальних залоз З використанням відеокамери та 5-кратного об'єктива світлового мікроскопа були отримані зображення, довжина яких у полі зору становила 0,953 мм. Коли перший зріз довжиною 6 мм аналізувався зліва направо, перше та друге зображення відкидалися, а третє та четверте зображення фіксувалися для наступного аналізу зображень. Кожне поле мало довжину 0,953 мм. За допомогою комп'ютерної мишки відзначалися сальні залози у всьому полі зору (0, 953 мм). Також фіксувалася площа по всій довжині поля зору та висота між гранулярним шаром (stratum granulosum) і верхнім краєм хряща. 2 Загальна площа сальних залоз (мкм ) у кожному дослідженому полі зору була розрахована за допомогою Image Analyser. Була також визначена загальна площа по всій довжині в 0,953 мм і висота між гранулярним шаром і хрящем. Крім того, був розрахований відсоток площі, зайнятий сальними залозами. Таким чином, для кожного вуха було отримано два зрізи та було проаналізовано по два поля зору для кожного зрізу. З даних цих чотирьох вимірювань були розраховані середнє значення та стандартна помилка середнього значення з використанням 28